劉昶君,徐文堅(jiān)

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院影像科,山東 青島 266003)

原發(fā)性惡性骨腫瘤好發(fā)于青少年，惡性程度高，給病人及其家庭帶來(lái)極大的負(fù)擔(dān)。1970年之前，惡性骨腫瘤的治療方法以截肢術(shù)為主，5年生存率低，超過(guò)80%的病人最終死于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。近年來(lái)放化療聯(lián)合保肢治療成為惡性骨腫瘤主要治療方法之一，早期有效的療效評(píng)估與惡性骨腫瘤預(yù)后關(guān)系密切。如何提高對(duì)惡性骨腫瘤放療后早期微觀變化的了解，評(píng)估放療早期療效，成為臨床研究的熱點(diǎn)。動(dòng)態(tài)對(duì)比增強(qiáng)磁共振成像(DCE-MRI)可間接反映病變組織的微血管生成狀態(tài)及微觀血流灌注狀況，體素內(nèi)不相干運(yùn)動(dòng)擴(kuò)散加權(quán)成像(IVIM-DWI)能夠有效區(qū)分活體組織內(nèi)部水分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的真性擴(kuò)散以及微循環(huán)血流灌注產(chǎn)生的假性擴(kuò)散[2]。有學(xué)者利用IVIM-DWI及DCE-MRI進(jìn)行腫瘤良惡性鑒別及療效預(yù)測(cè)的研究[3-4]，但相關(guān)研究多針對(duì)軟組織腫瘤，罕有兩者聯(lián)合對(duì)動(dòng)物模型惡性骨腫瘤放療早期療效評(píng)估的研究。本研究旨在通過(guò)分析IVIM-DWI及DCE-MRI定量參數(shù)的相關(guān)性及診斷效能，實(shí)現(xiàn)惡性骨腫瘤放療早期療效的無(wú)創(chuàng)性量化評(píng)估。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型建立

雄性健康新西蘭大白兔(由青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)32只，2月齡，體質(zhì)量為2.0～3.0 kg。所有手術(shù)及磁共振檢查操作均在兔麻醉狀態(tài)下完成，麻醉采用100 g/L水合氯醛溶液，左側(cè)大腿外側(cè)肌群肌注，注射劑量3 mL/kg。將VX2腫瘤組織塊(上海交通大學(xué)第一人民醫(yī)院提供)剪碎、研磨、離心，獲得腫瘤細(xì)胞懸濁液。取2只新西蘭大白兔，用5 mL的注射器取腫瘤細(xì)胞懸濁液分別接種于雙側(cè)股骨周?chē)∪海總?cè)1 mL，制備荷瘤兔。荷瘤兔正常飼養(yǎng)14 d后觸摸接種處有硬結(jié)形成，在全身麻醉狀態(tài)下剝離腫瘤，剔除囊變壞死區(qū)及纖維組織后，分割成1 mm3組織塊用以制備兔惡性骨腫瘤模型。將剩余30只新西蘭大白兔充分麻醉后仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，嚴(yán)格遵循無(wú)菌原則，縱行切開(kāi)右側(cè)脛骨結(jié)節(jié)下方皮膚及皮下組織至暴露骨皮質(zhì)，用牙科鉆鉆通至骨髓腔，將2～3塊VX2腫瘤組織植入骨髓腔，用骨蠟封堵缺損，逐層縫合切開(kāi)部位。術(shù)后每天連續(xù)肌注青霉素4×105U/kg，共注射3 d，以預(yù)防術(shù)后感染。

1.2 模型兔分組及處理

腫瘤植入2周后，模型兔在充分麻醉下行磁共振成像(MRI)平掃，確認(rèn)腫瘤生長(zhǎng)后納入實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)編號(hào)將30只模型兔分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，每組15只。實(shí)驗(yàn)組于首次磁共振檢查后行放射治療，對(duì)照組不予任何治療。

1.3 放射治療

實(shí)驗(yàn)組模型兔充分麻醉后仰臥位固定于檢查床上，充分暴露右側(cè)脛骨內(nèi)側(cè)腫瘤種植區(qū)域。放療采用醫(yī)用高能直線加速器(Varian-23EX，USA)，照射劑量10 Gy，照射采用6 MeV的X射線，照射次數(shù)1次，照射野6 cm×6 cm，源皮距100 cm。

1.4 MRI檢查及數(shù)據(jù)后處理

采用Siemens Prisma 3.0 T MR掃描儀(Siemens Healthcare GmbH，Erlangen，Germany)及8通道動(dòng)物線圈(上海辰光醫(yī)療公司)。模型兔取仰臥位，頭先進(jìn)，掃描范圍為兔右側(cè)股骨下段1/3處至踝關(guān)節(jié)。常規(guī)MRI掃描序列包括矢狀位T1WI(TR 737 ms，TE 22 ms)、TIRM(TR 3 200 ms，TE 44 ms，IR 230 ms)、T2WI(TR 3 000 ms，TE 96 ms)、冠狀位T1WI(TR 737 ms，TE 22 ms)，層厚3 mm，層間距1 mm，激勵(lì)次數(shù)為4次，F(xiàn)OV為160 mm×160 mm。IVIM-DWI序列為矢狀位(TR 3 000 ms，TE 50 ms)，共14個(gè)b值(b=0、10、20、30、40、50、80、100、150、200、400、600、800、1 000)，層厚3 mm，層間距1 mm，激勵(lì)次數(shù)為2次，F(xiàn)OV為17 cm×17 cm。DCE-MRI序列為矢狀位(TR 6.5 ms，TE 1.4 ms)，層厚3 mm，激勵(lì)次數(shù)為 2 次，F(xiàn)OV為20 cm×20 cm；選擇8°、 10°、 12°翻轉(zhuǎn)角各采集1 個(gè)時(shí)相的圖像作為預(yù)掃描，最終選擇12°翻轉(zhuǎn)角進(jìn)行多期動(dòng)態(tài)增強(qiáng)掃描，共掃描50個(gè)時(shí)相，第2個(gè)時(shí)相結(jié)束時(shí)立刻應(yīng)用雙筒高壓注射器經(jīng)兔耳緣靜脈先注射釓噴葡酸胺(Gd-DTPA，Bayer Schering，Germany)2 mL/kg，流量1.5 mL/s，隨后立即注射生理鹽水12 mL。

原始DICOM圖像導(dǎo)入 Siemens Syngo via.后處理工作站進(jìn)行后處理，感興趣區(qū)(ROI)放置及參數(shù)測(cè)量均由兩位3年以上年資的骨關(guān)節(jié)放射科醫(yī)師進(jìn)行，意見(jiàn)不同時(shí)協(xié)商解決。ROI選擇：對(duì)照病理切片及MRI平掃T2WI和TIRM圖像選取IVIM-DWI及DCE-MRI矢狀位腫瘤的最大徑層面勾畫(huà)ROI，盡量避開(kāi)壞死區(qū)及大血管，ROI=2 mm3，共選擇3個(gè)ROI，參數(shù)取平均值。IVIM-DWI圖像后處理選擇MR Body Diffusion后處理軟件，通過(guò)雙指數(shù)模型計(jì)算生成IVIM-DWI參數(shù)真性擴(kuò)散系數(shù)(D)、假性擴(kuò)散系數(shù)(D*)、擴(kuò)散分?jǐn)?shù)(f)及偽彩圖；DCE-MRI圖像后處理選擇 Tissue 4D 模塊，進(jìn)行圖像運(yùn)動(dòng)校正以后，通過(guò)血流動(dòng)力學(xué)雙室模型計(jì)算生成DCE-MRI定量參數(shù)組織容積轉(zhuǎn)移常數(shù)(Ktrans)、速率轉(zhuǎn)運(yùn)常數(shù)(Kep)、組織細(xì)胞外血管外容積分?jǐn)?shù)(Ve)及偽彩圖。

1.5 組織病理學(xué)檢查

完成全部磁共振檢查后，立即經(jīng)耳緣靜脈注射過(guò)量麻醉劑處死模型兔，將股骨下端及踝關(guān)節(jié)處離斷，確保脛骨完整并保留周?chē)浗M織，大體標(biāo)本置于40 g/L中性甲醛溶液中暫存。使用硬組織切片機(jī)將標(biāo)本切成厚度約為3 mm的組織片，最佳組織片包含腫瘤的最大范圍區(qū)域，而后置于40 g/L中性甲醛溶液中固定，固定好的組織片在EDTA脫鈣液中脫鈣2周，脫鈣完成后進(jìn)行石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組IVIM-DWI及DCE-MRI定量參數(shù)比較

IVIM-DWI及DCE-MRI各參數(shù)后處理偽彩圖見(jiàn)圖1，兩組放療后IVIM-DWI及DCE-MRI定量參數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。放療后實(shí)驗(yàn)組IVIM-DWI參數(shù)的D值明顯高于對(duì)照組，D*值明顯低于對(duì)照組，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-7.927、4.246，P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組DCE-MRI參數(shù)的Ktrans值明顯低于對(duì)照組，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.313，P<0.05)。

2.2 組織病理學(xué)觀察

肉眼觀察顯示，腫瘤沿骨髓長(zhǎng)軸生長(zhǎng)，邊界與正常骨髓組織分界尚清，無(wú)包膜，瘤體中心可見(jiàn)不同程度白色壞死組織。HE染色觀察顯示，對(duì)照組腫瘤實(shí)性區(qū)腫瘤細(xì)胞數(shù)量增多，排列紊亂密集，細(xì)胞核異型性明顯，核質(zhì)比大，壞死不明顯；實(shí)驗(yàn)組腫瘤實(shí)性區(qū)腫瘤細(xì)胞數(shù)量明顯減少，殘存腫瘤細(xì)胞仍可見(jiàn)異型性，但不及對(duì)照組明顯，瘤巢周?chē)梢?jiàn)大片壞死區(qū)。見(jiàn)圖2。

2.3 各定量參數(shù)ROC曲線分析

ROC曲線分析的結(jié)果顯示，Ktrans值和D值的AUC、靈敏度和特異度均高于其他參數(shù)，其中D值的特異度最高(100.00%)，而Ktrans值的靈敏度最高(93.30%)。見(jiàn)圖3和表2。

A～C分別為IVIM-DWI定量參數(shù)D、D*、f偽彩圖；D～F分別為DCE-MRI定量參數(shù)Ktrans、Kep、Ve偽彩圖。

表1 放療后兩組IVIM-DWI及DCE-MRI定量參數(shù)比較

A：大體標(biāo)本；B：實(shí)驗(yàn)組放療后病理表現(xiàn)(HE染色，100倍)；C：對(duì)照組放療后同期病理表現(xiàn)(HE染色，100倍)。

A：D值和f值曲線；B：D*值曲線；C：Ktrans值、Kep值和Ve值曲線。

表2 IVIM-DWI及DCE-MRI各參數(shù)的診斷效能

3 討 論

常規(guī)MRI平掃只能反映組織形態(tài)學(xué)改變，不能反映腫瘤組織內(nèi)部的早期微觀改變，對(duì)于腫瘤療效的監(jiān)測(cè)具有局限性。近年來(lái)快速發(fā)展的磁共振灌注成像、功能成像技術(shù)等，能夠在無(wú)創(chuàng)條件下反映腫瘤組織內(nèi)部微觀變化，為腫瘤治療后早期療效評(píng)估及療效動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)提供了可能。IVIM-DWI技術(shù)是LE BIHAN等[2]最早提出的描述體素內(nèi)信號(hào)衰減程度與b值間關(guān)系的一種MRI技術(shù)，采用多b值DWI成像，用于量化分析組織中水分子的擴(kuò)散和灌注兩種運(yùn)動(dòng)成分。DCE-MRI技術(shù)利用TOFTS等[5]提出的雙室藥代動(dòng)力學(xué)模型，用于量化分析組織血管通透性和組織灌注情況。目前IVIM-DWI和DCE-MRI序列已廣泛應(yīng)用于多種疾病的實(shí)驗(yàn)及臨床療效評(píng)估研究中[6-10]。

IVIM-DWI無(wú)需注射外源性對(duì)比劑，利用自體水分子基于雙指數(shù)模型進(jìn)行運(yùn)算，反映組織灌注信息及擴(kuò)散信息，其定量參數(shù)值的改變也可被用來(lái)進(jìn)行量化評(píng)估[11-13]。D值反映真實(shí)的組織擴(kuò)散情況，其大小主要受組織細(xì)胞內(nèi)外間隙比值的影響，細(xì)胞密集程度大，細(xì)胞外間隙體積就相對(duì)減小，組織內(nèi)水分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)受限，D值相應(yīng)減小[4]。本研究結(jié)果顯示，放療后實(shí)驗(yàn)組大白兔D值較對(duì)照組明顯增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與NOUGARET等[14]利用IVIM-DWI評(píng)估直腸癌化療效果的研究結(jié)果一致。分析原因可能為：VX2惡性骨腫瘤細(xì)胞對(duì)放療敏感，從而使實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞密集程度不及對(duì)照組(病理結(jié)果顯示放療后實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞較對(duì)照組明顯減少，且壞死區(qū)增多)，細(xì)胞外間質(zhì)體積相對(duì)增加，組織內(nèi)水分子擴(kuò)散程度增加，故D值增大。D*值代表灌注相關(guān)的擴(kuò)散系數(shù)，其大小與腫瘤組織內(nèi)微血管形成相關(guān)。本文的研究結(jié)果顯示，放療后實(shí)驗(yàn)組D*值較對(duì)照組減小，這可能與放療后腫瘤新生毛細(xì)血管減少、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡以及毛細(xì)血管內(nèi)血栓形成等導(dǎo)致血液灌注減少有關(guān)[15-17]。f值表示單個(gè)體素內(nèi)微循環(huán)灌注容積占總體灌注容積的比值。ZHU等[18]對(duì)于宮頸癌放化療療效評(píng)估的研究結(jié)果表明，f值易受多種內(nèi)外界環(huán)境因素的影響，因此評(píng)估價(jià)值有限。

DCE-MRI通過(guò)靜脈注射對(duì)比劑后對(duì)ROI進(jìn)行連續(xù)動(dòng)態(tài)圖像采集，獲得ROI內(nèi)所有體素的時(shí)間-信號(hào)強(qiáng)度曲線(TIC)，選取Tofts模型對(duì)曲線進(jìn)行分析獲得定量參數(shù)，是目前臨床最常見(jiàn)的無(wú)創(chuàng)性評(píng)價(jià)組織血流灌注的MR技術(shù)[19-22]。Ktrans值為對(duì)比劑從血管滲漏進(jìn)入周?chē)M織間隙的轉(zhuǎn)運(yùn)常數(shù)，反映血管的通透性，諸多研究表明Ktrans值與組織新生毛細(xì)血管密度密切相關(guān)[23-25]。本研究結(jié)果表明，放療后實(shí)驗(yàn)組Ktrans值較對(duì)照組明顯減小，分析原因可能是由于放療導(dǎo)致腫瘤組織新生毛細(xì)血管減少、毛細(xì)血管壁變性或壞死導(dǎo)致新生毛細(xì)血管密度減低，腫瘤組織血管灌注減少、血管通透性減低[26-27]。Kep值代表對(duì)比劑反向滲透進(jìn)入血管內(nèi)的反向速率常數(shù)，同樣受到血流量、血管內(nèi)皮通透性等因素的影響。COENEGRACHTS等[28]的研究表明，Kep值可作為預(yù)測(cè)腫瘤療效的指標(biāo)之一。但本研究未顯示兩組間Kep值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與腫瘤的異質(zhì)性有關(guān)。Ve值代表血管外細(xì)胞外間隙中的對(duì)比劑體積占單位體積的比例。部分學(xué)者認(rèn)為，Ve值受到腫瘤細(xì)胞密度、腫瘤細(xì)胞分化程度、對(duì)比劑在血管內(nèi)外交換速率等多重因素的影響，因此在腫瘤的療效評(píng)估方面無(wú)明顯價(jià)值[29-30]。這與本研究的結(jié)果相一致，Ve值能否應(yīng)用于腫瘤療效評(píng)估還有待進(jìn)一步研究探討。

本研究應(yīng)用ROC曲線對(duì)Ktrans、Kep、Ve、D、D*及f值的診斷效能進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，D值的診斷效能最高(AUC=0.978)，其對(duì)應(yīng)的靈敏度、特異度分別為86.70% 和100.00%；Ktrans值的診斷效能次之(AUC=0.969)，其對(duì)應(yīng)的靈敏度、特異度分別為93.30%和93.30%。

本研究具有以下不足之處：①觀察期較短，僅研究放療后3 d惡性骨腫瘤IVIM-DWI及DCE-MRI定量參數(shù)變化，對(duì)于放療后不同時(shí)期定量參數(shù)的動(dòng)態(tài)變化有待進(jìn)一步研究；②放療方法為單次大劑量放療，臨床根據(jù)病人不同情況常采用多次小劑量放療方案，對(duì)于兩種放療方案治療后各定量參數(shù)的比較有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，IVIM-DWI定量參數(shù)D值對(duì)于惡性骨腫瘤放療早期療效評(píng)估具有較高的靈敏度，DCE-MRI定量參數(shù)Ktrans值則具有較高的特異度，IVIM-DWI聯(lián)合DCE-MRI可為放療早期療效的評(píng)估提供有效的檢測(cè)手段。