楊一凡,王亭,劉世國(guó),李冰

(青島大學(xué),山東 青島 266071 1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)系； 2 附屬醫(yī)院脊柱外科； 3 附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳科)

低磷血癥性佝僂病是一種具有高度臨床和遺傳異質(zhì)性的骨代謝障礙性疾病，其臨床表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢、負(fù)重肢體彎曲，一般在1～2歲后表現(xiàn)明顯，常伴有腎臟磷酸鹽重吸收缺陷和異常骨礦化[1-3]。X-連鎖低磷血癥性佝僂病(XLH，OMIM#307800)是其中最常見(jiàn)的類(lèi)型，發(fā)病率約為 1/20 000[4]。XLH是由于X染色體上內(nèi)肽酶同源磷調(diào)節(jié)基因(PHEX，OMIM#300550，NM_000444.6)失活性突變引起的[5]。PHEX基因位于Xp22.1上，由22個(gè)外顯子組成，全長(zhǎng)243 kb[6-7]。常規(guī)技術(shù)檢查(包括放射技術(shù)檢查和電生理檢查)對(duì)XLH診斷有輔助性作用，但由于XLH具有臨床和遺傳異質(zhì)性，無(wú)法根據(jù)臨床數(shù)據(jù)確定基因型與表型的相關(guān)性。本研究通過(guò)全外顯子組測(cè)序(WES)和Sanger測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)合病人的實(shí)驗(yàn)室和影像學(xué)檢查結(jié)果，從1個(gè)XLH中國(guó)家系中鑒定出1個(gè)PHEX基因的異常剪接突變。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

病人來(lái)自山東省的一個(gè)患有XLH的中國(guó)家庭。先證者為女性，47歲(圖1中Ⅱ3)，根據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查，在青島大學(xué)附屬醫(yī)院臨床診斷為XLH。其他家系成員均無(wú)此病(圖1)。本研究經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得家系成員的知情同意。

正方形表示男性，圓圈表示女性；黑色符號(hào)表示受影響的成員；黑色箭頭表示家族中的先證者。

1.2 實(shí)驗(yàn)室和影像學(xué)檢查

采集先證者空腹靜脈血，應(yīng)用日立7600全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血鈣、磷和堿性磷酸酶(ALP)濃度。用ECLIA Elecsys全自動(dòng)分析儀(E170，德國(guó)曼海姆羅氏診斷公司)測(cè)定血清1,25-雙羥維生素D(1,25(OH)2D)和甲狀旁腺激素(PTH)水平。用3.0 Tesla臨床掃描儀(GE HDX 3.0 T MR系統(tǒng)，GE Medical System，Milwaukee，USA)對(duì)病人進(jìn)行腰椎和胸椎磁共振成像(MRI)檢查，并與之前在同一家醫(yī)院、使用相同的MRI技術(shù)和相同的臨床掃描儀檢查、年齡和性別匹配的健康個(gè)體50名進(jìn)行比較。同時(shí)進(jìn)行X線(xiàn)檢查。

1.3 突變基因檢測(cè)

1.3.1基因組DNA提取 分別采集該家系Ⅱ代成員的血液樣本2 mL，使用Qiagen DNA試劑盒提取DNA，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.2WES分析 對(duì)先證者(Ⅱ3)進(jìn)行WES分析。打斷基因組DNA，完成DNA片段化和接頭連接，制備cDNA文庫(kù)。應(yīng)用Aglient 2100檢驗(yàn)合格的cDNA文庫(kù)，將經(jīng)過(guò)富集的DNA應(yīng)用Illumina HISeq 2000測(cè)序儀進(jìn)行雙末端測(cè)序，平均測(cè)序深度達(dá)96.2×，目標(biāo)區(qū)域97.67×，覆蓋率為98%。去除接頭污染和低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選結(jié)果應(yīng)用MaxEntScan、Spliceman對(duì)可能有害的突變進(jìn)行預(yù)測(cè)，從而發(fā)現(xiàn)該家系致病的突變基因。

1.3.3Sanger測(cè)序 將WES所測(cè)得的高致病突變，在該家系第Ⅱ代樣本中進(jìn)行Sanger測(cè)序，以驗(yàn)證WES結(jié)果的準(zhǔn)確性。使用Primer express 3.0軟件設(shè)計(jì)引物(引物序列F：CATGTATGAAGGAGCCCAGCTT；R：CCTGGTAACAAGGATCAGAAAACA)，對(duì)檢出突變所在外顯子序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50.0 μL，包括：Master Mix 21.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板DNA 1.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸5 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸2 min。擴(kuò)增完成后，PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度為10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，對(duì)擴(kuò)增條帶明亮且單一者使用ABI 3730XL測(cè)序儀(Applied Biosystems 3730-XL)進(jìn)行測(cè)序。用BioEdit(Borland，V7.0.1)程序?qū)NA序列進(jìn)行分析，并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考序列進(jìn)行比較。然后應(yīng)用聚合物鑒定突變位點(diǎn)，比對(duì)人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(HGMD，http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)鑒定新突變。

2 結(jié) 果

2.1 XLH家系臨床特點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)室檢查

先證者，女，47歲。父母非近親結(jié)婚，G3P3，正常自然陰道分娩。出生體質(zhì)量2.4 kg，初次啼哭無(wú)延遲。臨床表現(xiàn)為身材矮小(身高140 cm，體質(zhì)量65 kg，體質(zhì)量指數(shù)(BMI)33.16 kg/m2)，下肢膝內(nèi)翻嚴(yán)重畸形，牙齒發(fā)育不良。臨床主要癥狀為步態(tài)異常，腰痛10年，下肢麻木2年。其他家庭成員無(wú)相關(guān)臨床癥狀。先證者實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果顯示：血鈣2.16 mmol/L(正常范圍2.08～2.60 mmol/L)，血磷0.5 mmol/L(正常范圍0.8～1.6 mmol/L)，ALP 133 U/L(正常范圍15～112 U/L)，PTH 67 ng/L(正常范圍15～65 ng/L),1,25(OH)2D 21.24 μg/L(正常范圍20～35 μg/L)。其他家系成員的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室結(jié)果均正常。先證者X線(xiàn)檢查顯示嚴(yán)重的下肢內(nèi)翻畸形(圖2A)；MRI檢查：胸椎管狹窄、腰椎間盤(pán)突出、胸腰椎退行性病變(圖2B)，全身松質(zhì)骨數(shù)量增加，骨密度增高，骨盆韌帶骨化。其他50名健康個(gè)體影像學(xué)檢查均無(wú)異常。

2.2 突變基因的WES分析及Sanger測(cè)序驗(yàn)證

WES分析顯示，先證者存在1個(gè)PHEX基因剪接位點(diǎn)雜合突變(c.1646-2A>G，NM_000444.6)，即該基因編碼cDNA的第1646位點(diǎn)(第15內(nèi)含子)上游的第2個(gè)堿基由腺嘌呤(A)變?yōu)轼B(niǎo)嘌呤(G)，導(dǎo)致剪接位點(diǎn)突變，從而引起編碼蛋白功能異常。MaxEntScan(http://hollywood.mit.edu/bur-gelab/maxent/Xmaxentscan_scoreseq.html)分析顯示，Maximum Entropy Model(MAXENT)-6.23，F(xiàn)irst-order Markov Model(MM)-5.56，Weight Matrix Model(WMM)-3.09,對(duì)應(yīng)的野生型評(píng)分分別為11.09、11.88、13.81；Spliceman指數(shù)顯示62%。該突變可能會(huì)影響mRNA剪接，從而影響編碼蛋白功能，最終導(dǎo)致疾病表現(xiàn)。

對(duì)WES分析顯示的高度可疑致病位點(diǎn)c.1646-2A>G進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明，先證者攜帶該致病突變，而家系中其他兩位正常成員(Ⅱ1、Ⅱ2)未發(fā)現(xiàn)該基因的異常。此外，在中國(guó)山東的100名無(wú)關(guān)健康對(duì)照者中也未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。因此，先證者可被診斷為XLH。

A：X線(xiàn)片顯示下肢膝內(nèi)翻畸形；B：MRI顯示胸椎管狹窄、腰椎間盤(pán)突出癥、胸腰椎退行性疾病。

3 討 論

XLH是低磷血癥性佝僂病中最常見(jiàn)的類(lèi)型，因?yàn)椴∪司S生素D吸收相對(duì)無(wú)效，因此XLH病人的臨床表現(xiàn)與大多數(shù)佝僂病病人的臨床表現(xiàn)不同[9]。XLH病人實(shí)驗(yàn)室檢查表現(xiàn)為低磷血癥、ALP升高、血鈣正常、1,25(OH)2D正?；蚱?、PTH正?；蚱遊4]。XLH病人在兒童發(fā)育早期由于腎臟磷酸鹽滲漏導(dǎo)致血液中磷酸鹽水平降低和骨礦化缺陷而對(duì)維生素D治療產(chǎn)生抵抗力；隨著年齡增長(zhǎng)，病人會(huì)出現(xiàn)自發(fā)性牙齒膿腫、廣泛骨痛和關(guān)節(jié)病等[5-7]。雖然患有XLH的病人臨床表現(xiàn)不盡相同，但其特點(diǎn)均為佝僂骨畸形、身材矮小和牙齒畸形等[3]。

PHEX的失活性突變可致磷調(diào)節(jié)因子纖維生長(zhǎng)因子23(FGF23)升高，減少腎小管磷的重吸收，抑制活性維生素D的生成，導(dǎo)致骨骼礦化障礙[9]。因此，PHEX基因的功能喪失伴隨骨骼礦化缺陷、FGF23的合成和分泌增強(qiáng)。迄今為止，在XLH病人中已發(fā)現(xiàn)約460個(gè)PHEX突變，國(guó)內(nèi)也有相關(guān)病例報(bào)道[10-12]。然而，PHEX失活導(dǎo)致XLH骨骼和腎臟異常的確切機(jī)制尚未完全闡明。

PHEX基因如發(fā)生病理性變異可導(dǎo)致低磷血癥性佝僂病，通常以X連鎖顯性的方式遺傳：男性病人可將病理性變異遺傳給女兒，女兒患病率為100%，因?yàn)槟行酝ǔＶ挥幸粋€(gè)X染色體的半合子，所以X連鎖顯性疾病在男性中的表達(dá)率通常高于女性[13-15]。女性病人有50%的可能將病理性變異遺傳給子女，但通常女性病人的癥狀較輕，無(wú)明顯的骨骼發(fā)育畸形，只表現(xiàn)為低磷血癥[16]。

對(duì)散發(fā)性病人，PHEX基因突變的分子診斷對(duì)于確認(rèn)XLH的臨床診斷，進(jìn)行遺傳咨詢(xún)和促進(jìn)產(chǎn)前干預(yù)具有重要意義。國(guó)內(nèi)外研究顯示，XLH病人在出現(xiàn)生長(zhǎng)障礙及佝僂病體征前的嬰兒期開(kāi)始治療，其身高改善及病情減輕較1歲后開(kāi)始治療者效果好[17]。XLH病人的子女應(yīng)在出生后3個(gè)月內(nèi)仔細(xì)追蹤，盡早治療。

2014年YUE等[18]報(bào)道了9個(gè)中國(guó)漢族無(wú)關(guān)家系(其中有3個(gè)散發(fā)性病例)的16例病人(5例男性，11例女性)，12例病人有膝內(nèi)翻的表現(xiàn)，但嚴(yán)重程度不一；4例病人存在牙齒發(fā)育異常，其中2例病人有不同程度的牙齒脫落。對(duì)相關(guān)研究報(bào)道的病例進(jìn)行比較顯示，不同種族的相同基因突變會(huì)導(dǎo)致不同的臨床特征[1,18]。

本研究通過(guò)對(duì)1例中國(guó)XLH病人的WES分析及Sanger測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)合病人的臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室和影像學(xué)檢查結(jié)果，確定了一個(gè)影響RNA轉(zhuǎn)錄本的致病基因突變，該突變位于PHEX基因內(nèi)含子15剪接受體位點(diǎn)(c.1646-2A>G)。隨著對(duì)XLH遺傳學(xué)分子基礎(chǔ)認(rèn)識(shí)的加深和我國(guó)XLH病人數(shù)量的增加，將有望闡明PHEX基因復(fù)雜的基因型-表型關(guān)系和功能，有助于XLH的早期分子診斷和治療。本研究為深入了解XLH的病理生理機(jī)制，更準(zhǔn)確迅速地診斷該遺傳性出生缺陷疾病奠定基礎(chǔ)。今后需要對(duì)更多的中國(guó)XLH病人進(jìn)行研究，以闡明PHEX突變的分布和頻率以及中國(guó)XLH病人的基因型-表型關(guān)系。