張 寧，郭亞麗，劉 建，彭艷茹，王玉光

(首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院呼吸科，北京 100010)

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、全身性自身免疫性疾病，以多關(guān)節(jié)對稱性腫脹、疼痛等為主要臨床表現(xiàn)，而肺部受累為其關(guān)節(jié)外常見表現(xiàn)，約發(fā)生在60%～80%的RA患者中，可導致間質(zhì)性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)[1-4]。據(jù)相關(guān)報道，ILD是RA患者死亡的重要原因，其發(fā)病機制可能與肺間質(zhì)有豐富的結(jié)締組織以及充足的血液供應(yīng)有關(guān)[5-8]。目前，RA-ILD尚無特異性的治療藥物，常見的為慢作用抗風濕藥聯(lián)合糖皮質(zhì)激素或抗纖維化藥物，但其不良反應(yīng)有時讓患者難以接受[3]。故仍需積極探索治療RA-ILD的有效藥物以及研究其作用機制，以更好地治療該病。

從中醫(yī)學來講，RA屬于“痹證”范疇，風寒濕等邪氣侵襲是發(fā)病的主要原因之一，以關(guān)節(jié)腫痛、僵硬不適為主要癥狀，應(yīng)為外痹；ILD屬于“肺痹”范疇，主要發(fā)病原因之一為肺、脾、腎虧虛，癥狀以咳嗽、喘息、活動后加重為主，應(yīng)為內(nèi)痹，故RA-ILD屬于內(nèi)外合痹。桂枝芍藥知母湯囊括了肢體痹與肺痹的治療，充分體現(xiàn)了內(nèi)外合痹的證治思想，故可用于RA-ILD的治療?，F(xiàn)代藥理學研究結(jié)果顯示，桂枝芍藥知母湯可降低Ⅱ型膠原誘導關(guān)節(jié)炎大鼠模型血清中腫瘤壞死因子(TNF)α、白細胞介素(IL)1β、IL-6、IL-17和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)等水平，誘導滑膜成纖維細胞凋亡等[9]。而TNF-α、IL-17和IL-1β等在RA-ILD的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，尤其是在成纖維細胞中[10-12]。本課題組在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用桂枝芍藥知母湯治療RA-ILD的療效良好，可改善患者肢體關(guān)節(jié)腫痛、咳嗽和喘息等癥狀，但其具體作用機制未知。目前，有不少研究報道應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接相結(jié)合的生物信息學方法，可預測中藥復方的活性成分、作用靶點以及潛在的作用機制[13-15]。故本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接技術(shù)對桂枝芍藥知母湯治療RA-ILD的潛在作用機制進行全面探討，為后期的實驗研究以及臨床推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 藥物有效成分收集與潛在作用靶點預測

通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)檢索桂枝芍藥知母湯的有效成分和潛在作用靶點。應(yīng)用平臺中“Igredient”功能選項，查找復方中的有效成分，同時將口服生物利用度(OB)、類藥性(DL)各設(shè)為≥30%、≥0.18作為篩選條件；運用平臺中“Related Targets”功能選項查找其所對應(yīng)的作用靶點。運用“PERL”軟件及腳本對所獲得的藥物成分及作用靶點進行合并。借助于Uniprot數(shù)據(jù)庫將靶點基因名稱進行標準化處理，以便后續(xù)研究。

1.2 RA-ILD潛在致病靶點篩選

將RA-ILD的英文全稱作為關(guān)鍵詞，分別從以下數(shù)據(jù)庫對RA-ILD潛在致病靶點基因進行搜索并將結(jié)果導出：GeneCard數(shù)據(jù)庫[篩選條件設(shè)為相關(guān)得分(Relevance score)≥1]及PharmGkb、人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(OMIM)、治療靶點數(shù)據(jù)庫(TTD)和DrugBank數(shù)據(jù)庫。應(yīng)用R×64 4.0.2軟件將導出的結(jié)果取并集，并繪制可視化的韋恩圖。

1.3 藥物-疾病潛在作用靶點的整理

應(yīng)用R×64 4.0.2軟件將“1.1”項和“1.2”項中最終所獲結(jié)果進行整理，并取交集，繪制韋恩圖。

1.4 構(gòu)建藥物成分-疾病靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

應(yīng)用Cytoscape 3.8.0軟件將“1.3”項中的結(jié)果構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖。本研究的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖分為2個部分，周邊圓形代表中藥化學成分，中心網(wǎng)格代表疾病靶基因。網(wǎng)格中節(jié)點大小代表與相連中藥化學成分的數(shù)目，若節(jié)點越大，則說明與該基因相連的成分越多。周邊圓形代表不同藥物所含成分。用邊來表示藥物成分與疾病靶點之間的相互關(guān)系，同時依據(jù)網(wǎng)絡(luò)度值(degree)的大小進行分類。

1.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)與篩選核心基因

運用STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)置物種條件為人，將“1.3”項中藥物與疾病潛在作用靶點交集基因構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并下載TSV格式文件。在上述操作中，設(shè)置置信度(high confidence)≥0.9，同時隱藏斷開節(jié)點。運用Cytoscape 3.8.0軟件中的CytoNCA插件對節(jié)點屬性進行評分，包括“Degree centrality”(DC)、“Betweenness centrality”(BC)、“Closeness centrality”(CC)、“Eigenvector centrality”(EC)、“Network centrality”(NC)和“Local average connectivity”(LAC)。具有高DC、BC、CC、EC、NC和LAC值的節(jié)點，意味著其在網(wǎng)絡(luò)中起著非常重要的作用。基于上述評分結(jié)果，篩選每個評分大于中位數(shù)的基因作為核心基因，并進行2次篩選，最終獲得網(wǎng)絡(luò)核心基因[16]。

1.6 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

在富集分析中，Pvalue<0.05，Qvalue<0.05。將GO富集結(jié)果中富集最高的前10項和KEGG通路富集結(jié)果中富集最高的前30項以可視化圖形表示出來。

1.7 藥物主要有效成分-關(guān)鍵核心靶點基因分子對接驗證

從PubChem數(shù)據(jù)庫下載桂枝芍藥知母湯主要有效成分的小分子配體2D結(jié)構(gòu)，通過應(yīng)用ChemOffice軟件轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)。關(guān)鍵靶點基因的大分子蛋白受體從PDB數(shù)據(jù)庫中獲取，其中所含的小分子配體和水分子由Pymol軟件去除，通過AutoDockTools進行預處理(包括加氫等)。采用Vina軟件將大分子受體與小分子配體進行分子對接，同時分析其結(jié)合活性。

2 結(jié)果

2.1 桂枝芍藥知母湯有效成分篩選與靶點預測

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫進行搜索共獲得201個有效成分，其中桂枝7個，白芍13個，甘草92個，麻黃23個，生姜5個，白術(shù)7個，知母15個，防風18個，附子21個；同時，共獲得3 018個預測靶點。將有效成分及靶點預測文件采用“PERL”軟件及其腳本進行合并，應(yīng)用Uniprot數(shù)據(jù)庫及“PERL”軟件進行標準化注釋、刪除無效及重復靶點，最終獲得237個作用靶點。

2.2 桂枝芍藥知母湯-RA-ILD共同靶點篩選

通過GeneCard數(shù)據(jù)庫、PharmGkb數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、DrugBank數(shù)據(jù)庫及TTD數(shù)據(jù)庫分別獲得RA-ILD潛在致病靶點2 008、402、0、0及6個，共獲得2 293個RA-ILD潛在致病靶基因。經(jīng)過整理、分析，得到166個“藥物-疾病”的潛在共同作用靶點，見圖1。

圖1 桂枝芍藥知母湯-RA-ILD潛在共同作用靶點韋恩圖Fig 1 Venn diagram of potential interaction targets of Guizhi Shaoyao Zhimu decoction-RA-ILD

2.3 有效成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)分析

活性成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖見圖2。由圖2可知，有效成分-核心靶點共有307個節(jié)點，其中來源于化合物的有141個，來源于基因的有166個。有效成分的degree越高，可能在桂枝芍藥知母湯治療RA-ILD中發(fā)揮重要作用。排序結(jié)果顯示，槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)和漢黃芩素(wogonin)的degree較高(degree≥30)。

圖2 活性成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Network diagram of active components-core targets

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)及核心基因預測

運用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖3。利用網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)篩選關(guān)鍵基因時，第1次篩選條件分別為BC≥57.49，CC≥0.18，DC≥7.5，EC≥0.04，LAC≥3.1，NC≥4，篩選結(jié)果共顯示48個節(jié)點，313條邊，得到48個核心基因；第2次篩選條件分別為BC≥14.97，CC≥0.55，DC≥11，EC≥0.11，LAC≥5.52，NC≥6.94，篩選結(jié)果顯示17個節(jié)點，89條邊，得到17個核心基因，包括信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、蛋白激酶B(Akt)1、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)1和MAPK3等，見圖4。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig 3 PPI network

圖4 核心基因篩選Fig 4 Screening of core genes

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

經(jīng)GO功能富集分析共得到2 762個富集結(jié)果，其中生物過程(BP)2 467個，其中對氧化應(yīng)激反應(yīng)、對營養(yǎng)水平的反應(yīng)及對脂多糖的反應(yīng)等是其主要生物調(diào)節(jié)過程；細胞組分(CC)87個，分子功能(MF)208個，見圖5。經(jīng)KEGG通路富集分析共得到170條通路富集結(jié)果，主要包括IL-17信號通路、TNF信號通路、Th17細胞分化、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號通路和JAK激酶-信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK-STAT)信號通路等，提示桂枝芍藥知母湯可能通過上述通路發(fā)揮對RA-ILD的治療作用，見圖6—7。

圖5 GO功能富集分析Fig 5 Go function enrichment analysis

圖6 KEGG通路富集分析Fig 6 KEGG pathway enrichment analysis

圖7 JAK-STAT信號通路圖Fig 7 Signal path diagram of JAK-STAT

2.6 有效成分-核心基因分子對接

選取degree≥30的藥物有效成分(槲皮素、木犀草素、山柰酚和漢黃芩素)，分別與前4位核心基因STAT3、Akt1、MAPK1和MAPK3進行分子對接，結(jié)果顯示，槲皮素、木犀草素、山柰酚和漢黃芩素分別與STAT3、Akt1、MAPK1和MAPK3的結(jié)合能均≤-29.26 kJ/mol，顯示出良好的結(jié)合力，見表1、圖8。

表1 中藥有效成分與核心靶基因的分子對接結(jié)果Tab 1 Molecular docking results of effective components of traditional Chinese medicine and core target genes

A.槲皮素與STAT3；B.槲皮素與Akt1；C.槲皮素與MAPK1；D.槲皮素與MAPK3A.quercetin and STAT3；B.quercetin and Akt1；C.quercetin and MAPK1；D.quercetin and MAPK3圖8 有效成分與核心靶基因的分子對接圖(部分)Fig 8 Molecular docking diagram of active ingredients and core target genes (part)

3 討論

本研究結(jié)果顯示，桂枝芍藥知母湯的有效成分包括槲皮素、木犀草素和山柰酚等。相關(guān)研究結(jié)果顯示，槲皮素可通過作用于多種細胞因子、生長因子以及相關(guān)信號通路等發(fā)揮抗肺纖維化作用[17-18]。宋占帥[19]的研究結(jié)果顯示，木犀草素具有抑制肺纖維化的作用。龔國清等[20]的研究結(jié)果顯示，木犀草素可降低肺纖維化大鼠肺組織中羥脯氨酸含量以及轉(zhuǎn)化生長因子-β1 mRNA的表達水平，延緩肺組織纖維化的進展。相關(guān)報道顯示，抗氧化、抗炎及增強機體免疫功能等為山柰酚的主要功效[21]。故推測槲皮素、木犀草素和山柰酚等有效成分在桂枝芍藥知母湯治療RA-ILD中發(fā)揮重要作用。

本研究通過PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲分析后預測出STAT3、Akt1和MAPK1等17個核心靶基因。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子STAT3在成熟組織功能中起著關(guān)鍵作用，包括抑制炎癥和免疫反應(yīng)，STAT3激活可促進RA成纖維細胞樣滑膜細胞的增殖，在肺纖維化發(fā)病機制中也發(fā)揮重要作用[22-23]。Kuuliala等[24]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RA患者中的單核細胞脂多糖(LPS)激發(fā)后可促使Akt的活化，并與疾病的活動程度相關(guān)。因MAPK1(ERK2)屬于炎癥和免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子，參與了RA-ILD的發(fā)生[25-26]。由此，可推測STAT3、Akt1和MAPK1等核心靶基因在RA-ILD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可能是治療RA-ILD的潛在靶點。

GO功能富集分析結(jié)果顯示，RA-ILD的發(fā)病機制可能涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)、營養(yǎng)水平的反應(yīng)和脂多糖的反應(yīng)等生物過程。氧化應(yīng)激是RA病理生理學的重要組成部分，在自身免疫性疾病中，免疫應(yīng)答與內(nèi)源性/外源性抗原的相互作用導致活性氧的產(chǎn)生，氧化應(yīng)激過程可能與炎癥和加速關(guān)節(jié)破壞呈正相關(guān)[27]。相關(guān)研究結(jié)果表明，動物模型中異常的抗氧化活性加劇了肺纖維化，活性氧產(chǎn)生的細胞外基質(zhì)降解產(chǎn)物可通過影響上皮細胞、間充質(zhì)細胞和炎癥細胞活性來促進纖維化，在肺纖維化患者的肺中也發(fā)現(xiàn)了氧化應(yīng)激的標志物[28]。若作為抗氧化劑輔助因子之一的營養(yǎng)素長期缺乏或與感染相結(jié)合可削弱免疫反應(yīng)，進而引起炎癥介質(zhì)以及免疫細胞群的增多[29]。LPS可誘導釋放IL-6、IL-1β和TNF-α等炎癥細胞因子，激活下游炎癥相關(guān)信號通路[30-31]。MAPK信號通路包括細胞外信號相關(guān)激酶(ERK)1/2、p38MAPK和c-Jun NH2末端激酶(JNK)等，也已被證明與LPS誘導的炎癥反應(yīng)有關(guān)，可誘發(fā)RA-ILD[32-33]。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，桂枝芍藥知母湯治療RA-ILD的作用機制可能與調(diào)控IL-17、PI3K-Akt、TNF以及JAK-STAT等信號通路表達密切相關(guān)。相關(guān)臨床研究結(jié)果顯示，IL-17在RA-ILD患者血清中的含量明顯高于單純的RA患者以及健康對照組，同時與肺功能具有一定的相關(guān)性[34]。菅向東[35]的研究結(jié)果顯示，RA-ILD患者血清中TNF-α表達水平明顯升高，同時在肺纖維化大鼠肺組織中TNF-α mRNA表達水平顯著高于對照組。據(jù)相關(guān)報道，趨化因子配體中的CXCL16和CXCR6在器官纖維化中起著關(guān)鍵作用，而RA-ILD患者血清可溶性CXCL16水平顯著升高，并與肺纖維化的嚴重程度相關(guān)，這與CXCL16/CXCR6軸通過PI3K-Akt-FOXO3a信號通路促進MRC-5細胞增殖和膠原生成有關(guān)[36]。在本病發(fā)生、發(fā)展中，若JAK-STAT信號通路功能失調(diào)，可持續(xù)釋放MMP，使異常免疫細胞表達增多、凋亡軟骨細胞增加，從而誘發(fā)疾病，甚至加速病情進展[37]。分子對接結(jié)果顯示，槲皮素、木犀草素、山柰酚和漢黃芩素分別與STAT3、Akt1、MAPK1和MAPK3相結(jié)合后，均展現(xiàn)出具有良好的親和力，這也充分驗證了本研究的成果。

本研究預測了桂枝芍藥知母湯治療RA-ILD的可能作用機制，其涉及多靶點以及多條信號通路，為后期進一步的實驗研究以及臨床推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，也為醫(yī)者應(yīng)用桂枝芍藥知母湯治療RA-ILD提供了一定的依據(jù)。但本研究仍存在一定局限性，有待相關(guān)基礎(chǔ)實驗進行驗證。