余甜，舒紅英，楊小頎

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，咸陽(yáng) 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，咸陽(yáng) 712000）

從免疫學(xué)角度來(lái)講，胎兒被認(rèn)為是一類(lèi)特殊的同種半異基因移植物。成功種植意味著胚胎所表達(dá)的父系抗原沒(méi)有遭到母體排斥，而是在母-胎界面免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)下成功耐受，這得益于母胎間復(fù)雜而精確的免疫平衡機(jī)制。母-胎界面由母體蛻膜組織和胎盤(pán)滋養(yǎng)層組織共同構(gòu)成，內(nèi)含多種免疫活性細(xì)胞和免疫因子。他們共同構(gòu)成的子宮免疫微環(huán)境是母體與胎兒免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮作用的關(guān)鍵場(chǎng)所，能在保證感染防御的同時(shí)維持母體對(duì)胎兒的免疫耐受平衡。

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（RSA）指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生3次及以上的孕28周前的自然流產(chǎn)。但國(guó)內(nèi)外大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為在發(fā)生第2次自然流產(chǎn)后就應(yīng)予以干預(yù)，并告知患者引起重視，因其發(fā)生再流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)已接近3次流產(chǎn)者。RSA病因復(fù)雜，除染色體、內(nèi)分泌、解剖、感染、自身免疫病等傳統(tǒng)因素之外，仍有50%～60%患者無(wú)法找到明確的病因，稱(chēng)為不明原因的RSA（URSA）[1]，且大多與免疫失衡相關(guān)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，URSA患者體內(nèi)T淋巴細(xì)胞及其亞群較正常妊娠組變化顯著[2]，提示該細(xì)胞群參與維持子宮免疫微環(huán)境的平衡與穩(wěn)定，一旦失衡即會(huì)造成胎兒種植失敗或流產(chǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 RSA患者T淋巴細(xì)胞及其亞群

T淋巴細(xì)胞及亞群與RSA之間密切相關(guān)，但其導(dǎo)致免疫失衡的致病機(jī)制尚不完全明確，故筆者對(duì)RSA母體T淋巴細(xì)胞變化的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為深入研究其引導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)在疾病中的作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，以期探索新的治療方法。

1 Th1/Th2

Th細(xì)胞均表達(dá)CD4，可以通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子引導(dǎo)人體免疫方向的傾斜。其中Th1細(xì)胞以分泌白細(xì)胞介素（IL）-2、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞因子為主，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫和局部炎癥反應(yīng)，通過(guò)激活細(xì)胞免疫和血管內(nèi)皮促凝參與妊娠病理過(guò)程[3]。Th2細(xì)胞分泌以IL-4、IL-5、IL-6、IL-10為主的細(xì)胞因子，主要促進(jìn)B細(xì)胞增殖和抗體生成，介導(dǎo)體液免疫，可抑制Th1細(xì)胞的分化和功能[4]，誘導(dǎo)母胎界面免疫耐受的形成，防止過(guò)度免疫應(yīng)答對(duì)胚胎著床造成的傷害。早期實(shí)驗(yàn)證明，母胎界面免疫平衡向Th2型細(xì)胞因子的偏移是妊娠成功的關(guān)鍵[5]，近年來(lái)也被各種動(dòng)物模型與臨床研究證明。與DBA/2雄性小鼠結(jié)合的CBA/J雌性小鼠是公認(rèn)的自然流產(chǎn)小鼠模型，Luo等[6]的酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，RSA組小鼠外周血中Th1/Th2細(xì)胞因子比值（IFN-γ/IL-4）明顯高于正常妊娠組。在URSA患者蛻膜中IFN-γ的表達(dá)也明顯高于對(duì)照組，而IL-4和IL-10的表達(dá)相應(yīng)減低[7]。但近來(lái)也有研究顯示，具有Th2型免疫優(yōu)勢(shì)的正常婦女也會(huì)反復(fù)出現(xiàn)自然流產(chǎn)現(xiàn)象[8]。由此可推測(cè)，成功妊娠的維持不單與Th1/Th2的平衡有關(guān)，還可能是與其他細(xì)胞共同作用的結(jié)果。

2 Th17/Treg

IL-6和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β在小鼠CD4+細(xì)胞定向分化為T(mén)h17細(xì)胞的過(guò)程中缺一不可，但在缺乏IL-6的條件下，TGF-β將抑制孤核受體γt（RORγt）轉(zhuǎn)錄活化，通過(guò)上調(diào)Foxp3的表達(dá)而促使細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化[9]。Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞之間的平衡對(duì)機(jī)體維持自身穩(wěn)態(tài)是至關(guān)重要的。雖然兩者均需要TGF-β因子進(jìn)行初始分化，而終末分化細(xì)胞卻執(zhí)行相反的功能：Th17細(xì)胞分泌促炎性因子IL-17，與多種自身免疫性疾病的發(fā)生相關(guān)；而Treg細(xì)胞分泌IL-10等細(xì)胞因子，有抗炎和維持免疫穩(wěn)態(tài)的作用，在妊娠過(guò)程中增強(qiáng)母體免疫耐受并防止妊娠母體對(duì)胎兒的免疫排斥。研究表明，URSA患者的Treg/Th17和Foxp3/RORγt比值均低于正常對(duì)照組[10-11]，提示這一平衡向著Th17細(xì)胞的方向偏移可能與URSA的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。另一組對(duì)照研究根據(jù)受試者是否具有多次流產(chǎn)史（即URSA）以及是否懷孕將其分為4組，雖然各組患者外周血IL-10、IL-17水平及Th17/Treg細(xì)胞比值均保持穩(wěn)定，但在母胎界面，懷孕的URSA組蛻膜組織中TGF-β1的mRNA和蛋白水平明顯降低，而IL-6和Th17/Treg比值明顯升高[12]。這一結(jié)果表明在反復(fù)流產(chǎn)患者的母胎界面，免疫細(xì)胞與相關(guān)因子的變化程度較外周血中更為明顯，且IL-6在Treg/Th17失衡的誘導(dǎo)中起到一定作用。此外，有學(xué)者通過(guò)ROC曲線(xiàn)分析將Foxp3與RORγt的mRNA檢測(cè)應(yīng)用于疾病診斷中，發(fā)現(xiàn)兩項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)優(yōu)于單項(xiàng)檢測(cè)，能有效提高RSA診斷的特異性和敏感性[13]。

3 Treg細(xì)胞

由CD4+細(xì)胞分化而來(lái)的Treg細(xì)胞主要分為兩大類(lèi)：nTreg以及pTreg或iTreg，后者主要包括Tr1和Th3。nTreg主要由胸腺內(nèi)自身抗原誘導(dǎo)生成，而pTreg細(xì)胞來(lái)自外周血，由外來(lái)抗原誘導(dǎo)生成。除此之外，體內(nèi)發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)的Treg細(xì)胞還有CD8+Treg細(xì)胞和NKT細(xì)胞等。Treg細(xì)胞群對(duì)于懷孕成功的重要性已經(jīng)在人類(lèi)和動(dòng)物模型中得到證實(shí)，且在RSA患者體內(nèi)較Th17細(xì)胞變化更為顯著，提示其對(duì)妊娠結(jié)局的影響更為重大[14]。Treg細(xì)胞除了可以抑制炎癥、防止母體對(duì)胎兒過(guò)度免疫外，還被證明在妊娠期間有助于調(diào)節(jié)母體血管功能，支持正常胎兒和胎盤(pán)發(fā)育[15]。

3.1 nTreg細(xì)胞 nTreg占外周血CD4+T細(xì)胞的10%左右，主要指CD4+CD25+Foxp3+Treg。已知在正常妊娠或是流產(chǎn)患者的早孕蛻膜組織中，都是以nTreg細(xì)胞為主[16]。在小鼠模型中測(cè)得外周血nTreg的數(shù)量在懷孕期間會(huì)持續(xù)增加，并在孕中期達(dá)到峰值，隨后下降直到足月達(dá)非孕水平[17]，提示nTreg細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化與成功妊娠相關(guān)。nTreg特征性表達(dá)Foxp3和高水平IL-2Rα鏈（CD25），因此有多項(xiàng)試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定Foxp3和CD25來(lái)間接反映nTreg的水平。Salek等[18]的實(shí)驗(yàn)證明，RSA模型小鼠經(jīng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞處理后顯著上調(diào)Foxp3等Treg相關(guān)基因在胎盤(pán)和蛻膜中的表達(dá)，懷孕小鼠的流產(chǎn)率顯著降低，并恢復(fù)至正常水平，提示該條件可能會(huì)在母胎界面建立一個(gè)免疫耐受的微環(huán)境，參與調(diào)控母體對(duì)胎兒的過(guò)度免疫反應(yīng)。

同樣，在RSA患者體內(nèi)測(cè)得CD4+CD25+Treg的比例和Foxp3蛋白水平等各項(xiàng)含量明顯低于正常妊娠對(duì)照組，提示Treg細(xì)胞數(shù)量的下降可能是URSA的發(fā)生機(jī)制之一[19]。尤其在排除染色體異常的流產(chǎn)患者中，蛻膜Foxp3+Treg細(xì)胞減少更為明顯[20]。最近的1項(xiàng)研究表明，RSA組外周血及蛻膜組織中CD4+CD25bright頻率及CD4+CD25bright/CD4+都顯著低于健康對(duì)照組，Logistic回歸分析顯示CD4+CD25bright頻率是流產(chǎn)發(fā)生的獨(dú)立保護(hù)因素[21]。同時(shí)該作者還提出外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞和IL-10水平對(duì)RSA具有較高預(yù)測(cè)價(jià)值，聯(lián)合檢測(cè)可作為預(yù)測(cè)既往RSA孕婦再發(fā)流產(chǎn)的參考指標(biāo)[22]。

轉(zhuǎn)錄因子家族成員Helios是nTreg細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，可用以區(qū)別nTreg和pTreg[23]。Inada等[20]的試驗(yàn)證明，在正常妊娠時(shí)，蛻膜中Helios-pTreg細(xì)胞數(shù)量很少，而Helios+效應(yīng)性Treg細(xì)胞的出現(xiàn)率明顯高于外周血，提示效應(yīng)性Treg細(xì)胞可能從外周血選擇性地遷移到蛻膜中發(fā)揮作用。而在正常的流產(chǎn)患者中，蛻膜基底層的Foxp3+細(xì)胞數(shù)量減少，但在頂葉蛻膜沒(méi)有減少，這表明Treg細(xì)胞在胎兒-母體交界處的遷移失敗可能是導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生的原因。

3.2 pTreg細(xì)胞 保守的非編碼序列1（CNS1）是一種Foxp3增強(qiáng)子，只存在于胎盤(pán)哺乳動(dòng)物中，是pTreg細(xì)胞發(fā)育所必需的。在小鼠模型中可以觀(guān)察到，pTreg細(xì)胞通過(guò)識(shí)別父系抗原抑制母胎效應(yīng)性T細(xì)胞激活免疫反應(yīng)。當(dāng)CNS1缺陷的雌性小鼠與主要組織相容性復(fù)合體（MHC）不匹配的雄性小鼠交配時(shí)，pTreg細(xì)胞的缺乏會(huì)導(dǎo)致胚胎自然流產(chǎn)的增加[24]。在妊娠早期植入pTreg后，流產(chǎn)易感模型小鼠脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量明顯增加，胚胎吸收明顯減少[25]。最近的臨床試驗(yàn)也顯示，與正常非孕者相比，無(wú)流產(chǎn)史的懷孕婦女外周性Treg細(xì)胞顯著增加；但在URSA患者中，pTreg細(xì)胞數(shù)量在懷孕時(shí)較低[12]。由此可見(jiàn)，pTreg可能參與并維持由nTreg啟動(dòng)的免疫耐受狀態(tài)，在小鼠和人類(lèi)的胚胎植入和妊娠中起著重要作用。

3.3 其他Treg細(xì)胞 在CD8+T細(xì)胞中也存在一類(lèi)Treg細(xì)胞。CD8+Treg具有免疫抑制作用，可識(shí)別胎兒抗原和裂解滋養(yǎng)層細(xì)胞。正常妊娠時(shí)在母胎交界處發(fā)揮有限的細(xì)胞毒作用，通過(guò)多種途徑產(chǎn)生抑制信號(hào)，導(dǎo)致滋養(yǎng)層抗原特異性耐受。

NKT細(xì)胞共表達(dá)T細(xì)胞受體和自然殺傷（NK）細(xì)胞受體，在不同情況下定量克隆。試驗(yàn)顯示URSA患者外周血和蛻膜中NKT樣細(xì)胞亞群所占比例明顯高于正常妊娠和未妊娠婦女，提示NKT樣細(xì)胞在維持正常妊娠中可能起重要作用；同時(shí)推斷外周血中CD3+CD56+CD16+NKT樣細(xì)胞的檢測(cè)可能為評(píng)估患者自然流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)提供一種潛在工具[26]。除此之外，CD8+Treg和NKT細(xì)胞也可以分泌1型和2型細(xì)胞因子，協(xié)助維持Th1/Th2等的動(dòng)態(tài)平衡[27]。

4 其他細(xì)胞

在人類(lèi)免疫細(xì)胞中，Th22分泌IL-22而不表達(dá)IL-17、IL-4及IFN-γ，在監(jiān)控和協(xié)調(diào)免疫細(xì)胞引發(fā)炎癥的過(guò)程中起特殊作用，但在生殖系統(tǒng)的研究甚少[28]。最近的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[29]，在RSA患者外周血中，Th22的數(shù)量及IL-22濃度都有顯著增高；但也有證據(jù)表明，正常成功妊娠者外周血及蛻膜中存在IL-22 mRNA增多的現(xiàn)象[30]，提示IL-22在妊娠的某些階段是造成胎兒移植排斥反應(yīng)的原因，但在其他階段也可能對(duì)懷孕有正向作用，其來(lái)源與具體作用及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

CD4+T細(xì)胞還可分化為T(mén)fh，通過(guò)分泌IL-21等相關(guān)因子在Th細(xì)胞依賴(lài)性B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。研究表明，該種細(xì)胞與RSA疾病相關(guān)的主要亞群有CD4+CXCR5+PD-1+CCR7-Tfh和CD4+CXCR5+PD-1+ICOS+Tfh。兩者在RSA患者的蛻膜組織中明顯增多，且后者在自身抗體陽(yáng)性的RSA患者中增加更明顯[31]。此外，患者外周血中Tfh與IL-21水平的升高也有效證實(shí)了此類(lèi)細(xì)胞與RSA疾病的相關(guān)性[32]。

還有一些研究者提到了Teff細(xì)胞，它是指CD25低表達(dá)的CD4+的非抑制性效應(yīng)性T細(xì)胞，與Treg一樣表達(dá)Foxp3，可由Treg分化而來(lái)，但對(duì)免疫耐受起破壞作用。在染色體核型正常的流產(chǎn)病例中，蛻膜組織的Foxp3+Teff細(xì)胞增加，母胎界面呈現(xiàn)免疫激活顯性狀態(tài)[20]。但在感染、過(guò)度炎癥或胎兒發(fā)育受到干擾的情況下，Treg能夠分化為T(mén)eff的能力可終止妊娠并確保孕產(chǎn)婦生存，可見(jiàn)Teff細(xì)胞對(duì)于妊娠的調(diào)節(jié)具有積極意義[33]。

5 不同治療方式對(duì)母胎T淋巴細(xì)胞的影響

5.1 西醫(yī)治療 目前大多采取免疫療法，包括淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫、靜脈注射免疫球蛋白（IVIG）、脂肪乳、免疫抑制劑和粒細(xì)胞集落刺激因子等。研究表明，淋巴細(xì)胞治療和IVIG的應(yīng)用均可提高妊娠成功率。在多次植入失敗的URSA患者中，注射外源淋巴細(xì)胞或IVIG可以通過(guò)平衡Th1/Th2來(lái)促進(jìn)胚胎植入，還能促進(jìn)改善Treg的比例[34-35]。近年來(lái)有學(xué)者提出，使用更為安全經(jīng)濟(jì)的脂肪乳可代替免疫球蛋白降低外周血中的NK細(xì)胞含量，且治療效果比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[36]。適量免疫抑制劑，如環(huán)孢素A可調(diào)節(jié)免疫因子，誘導(dǎo)免疫耐受，通過(guò)改變RSA患者共抑制分子的表達(dá)降低Th17細(xì)胞的百分比，促進(jìn)Treg細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)[37]，但因研究樣本量不足，其安全性和有效性有待進(jìn)一步研究。

此外，通過(guò)給予孕酮和補(bǔ)充維生素D3可以影響身體免疫狀態(tài)，同樣對(duì)RSA有治療效果。越來(lái)越多的臨床試驗(yàn)證據(jù)表明，孕酮對(duì)反復(fù)流產(chǎn)或早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)高的婦女有效[38]。在1項(xiàng)孕激素聯(lián)合絨毛膜促性素治療URSA的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)中，地屈孕酮片組和黃體酮組患者的 IL-4、IL-10、Treg/CD4+均升高，IL-6、IL-17、INF-γ、Th17/Treg均降低，且地屈孕酮片組流產(chǎn)率較低，足月分娩率更高。提示孕激素聯(lián)合絨毛膜促性素可通過(guò)調(diào)節(jié)患者T淋巴細(xì)胞因子及炎癥因子水平，促進(jìn)母胎平衡，提高保胎率[39]。還有些數(shù)據(jù)表明[40]，給予外源性雌激素治療的小鼠Foxp3的表達(dá)增強(qiáng)，在懷孕期間Treg功能增加。維生素D3治療也可通過(guò)影響外周血Th1/Th2、Th17/Treg比值，增強(qiáng)免疫耐受，從而改善妊娠結(jié)局[41]。

5.2 中醫(yī)治療 RSA在中醫(yī)屬“數(shù)墮胎”“滑胎”等范疇，治療應(yīng)以補(bǔ)腎健脾為主，兼補(bǔ)益氣血。中醫(yī)藥治療RSA臨證時(shí)通過(guò)辨證論治，可靈活運(yùn)用經(jīng)典方、經(jīng)驗(yàn)方，并隨癥加減，在多項(xiàng)臨床試驗(yàn)中取得顯著成效。實(shí)驗(yàn)證明中藥自擬固胎煎（由經(jīng)典名方壽胎丸化載而來(lái)）可通過(guò)上調(diào)小鼠外周血IL-10、TGF-β1的表達(dá)水平，下調(diào)IL-6、IL-17的表達(dá)水平調(diào)節(jié)母胎免疫[42]，起到補(bǔ)腎健脾安胎的功效。此外，減味壽胎丸[43]、補(bǔ)腎固沖方[44]等均可通過(guò)提高患者Treg細(xì)胞百分率，下調(diào)Th17細(xì)胞及其分泌的免疫因子含量，降低胚胎吸收率。

妊娠是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，為使胎兒不受母體免疫系統(tǒng)排斥，母胎界面的T淋巴細(xì)胞亞群和免疫分子充分發(fā)揮各自職能，對(duì)耐受平衡進(jìn)行復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控。近年來(lái)在發(fā)現(xiàn)部分RSA患者同樣具有Th2型免疫優(yōu)勢(shì)后，學(xué)者們開(kāi)始將研究重點(diǎn)從經(jīng)典的Th1/Th2失衡理論轉(zhuǎn)移到Th17/Treg上來(lái)，尤其是各類(lèi)Treg細(xì)胞在外周與母胎間的分布和變化，成為了生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。但當(dāng)下對(duì)于疾病的大多研究仍集中在通過(guò)測(cè)定細(xì)胞因子含量和標(biāo)志性基因，對(duì)比正常妊娠組與RSA患者T淋巴細(xì)胞各亞群數(shù)量級(jí)的差異上。研究結(jié)果往往只能說(shuō)明該細(xì)胞群與疾病的免疫病理因素相關(guān)，而每種細(xì)胞是如何調(diào)節(jié)抗原免疫耐受形成的機(jī)制尚不清楚，他們?cè)赗SA中究竟如何發(fā)揮作用仍待研究。目前，評(píng)估URSA患者的細(xì)胞因子功能狀態(tài)及免疫細(xì)胞含量可能對(duì)于制定合理的治療方案具有一定指導(dǎo)意義，但仍需大規(guī)模臨床研究來(lái)支持針對(duì)細(xì)胞因子治療的可行性及評(píng)估獲益風(fēng)險(xiǎn)。筆者綜述匯總了既往免疫細(xì)胞的相關(guān)研究，為深入研究免疫調(diào)節(jié)在RSA中的作用機(jī)制提供理論參考，以探索新的免疫學(xué)診斷和治療方法改善妊娠結(jié)局。