王婷 ，李海艦 ，廖明 ，曾伍姣

（1.廣東省第二人民醫(yī)院檢驗科，廣州 510317；2.廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科，廣州 510095）

哮喘是一種由多種炎癥細胞及細胞因子參與的氣道慢性炎癥性疾病，其主要特征有可逆性氣流受限、一系列氣道結(jié)構(gòu)改變和對多種刺激因素呈現(xiàn)高反應性[1]。而臨床癥狀表現(xiàn)為反復發(fā)作的氣急、咳嗽、喘息、胸悶等。據(jù)流行病學數(shù)據(jù)顯示全球目前大約有3.3億的哮喘患者[2]，中國的哮喘患者約有3 000萬。值得注意的是隨著全球環(huán)境污染逐漸加重，全球哮喘患病率呈逐年增長的趨勢，嚴重影響人們的身體健康。目前尚未完全闡明其發(fā)病機制，可能與炎癥、氧化應激等密切相關(guān)[3]。而臨床上常常使用糖皮質(zhì)激素、β2受體激動劑等藥物進行對癥治療[4]。但長期大劑量給藥可能引起較多的不良反應，故尋找高效低毒的新藥是目前急需解決的問題。

大黃酚是大黃中一種藥效明確的蒽醌類化合物?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)大黃酚具有抗氧化、抗凋亡和抗炎等多種藥理作用[5]，提示其可能對哮喘疾病有較好的療效。而目前暫未見大黃酚對哮喘的相關(guān)研究報道。此外，基于腫瘤壞死因子樣凋亡弱誘導因子（TWEAK）/成纖維細胞生長誘導因子14（Fn14）信號通路探討哮喘相關(guān)發(fā)病機制的研究報道也較少。本實驗旨在闡明大黃酚是否能夠通過TWEAK/Fn14信號通路，改善卵清蛋白（OVA）致哮喘小鼠的相關(guān)癥狀，為日后的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級C57BL/6小鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購于廣東省實驗動物中心[許可證號：SCXK（粵）2017-0006]。

1.1.2 藥物與試劑 大黃酚，純度＞98%，批號：110796-20150622，購于中國藥品生物制品檢定研究；氫氧化鋁粉、OVA、地塞米松，購于美國Sigma公司；DAB 免疫組化試劑盒、白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-5（IL-5）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-1β（IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒，購于博士德生物技術(shù)有限公司；β-actin、TWEAK和Fn14抗體，購于美國Abcam公司。

1.1.3 儀器 403型超聲霧化器：江蘇魚躍科技發(fā)展有限公司；JK-RM-60型輪轉(zhuǎn)式切片機：上海精學科學儀器有限公司；CX23CX33型Olympus顯微鏡：日本Olympus公司；SAF-680型酶標儀：上海巴玖實業(yè)有限公司；H1650R型高速冷凍離心機：上海盧湘儀有限公司；KEEBIO-VE186型電泳儀：上海嘉鵬科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 SPF級C57BL/6小鼠60只，按體質(zhì)量隨機分成6組，每組10只，分別為正常對照組（CON組）、模型組（OVA組）、地塞米松陽性對照組（DEX組）、大黃酚低劑量組（RHU-L組）、大黃酚中劑量組（RHU-M組）和大黃酚高劑量組（RHU-H組）。

1.2.2 哮喘小鼠模型的建立 除CON組外，其余各組分3次（第1、7、14天）對各組小鼠進行OVA致敏，參考文獻[6]的建模方法，具體方法如下：小鼠每次腹腔注射200 μL OVA溶液（含4 mg氫氧化鋁和100 μg OVA），CON組腹腔注射等量的生理鹽水。第21天后對各組小鼠進行霧化激發(fā)（連續(xù)4d），CON組以等量生理鹽水霧化吸入。RHU-L組、RHU-M組和RHU-H組小鼠在第15天時分別用濃度為50、100、200 mg/kg的大黃酚灌胃給藥，DEX組小鼠使用濃度為10 mg/kg的地塞米松灌胃給藥，CON組和OVA組灌胃等量生理鹽水，每日給藥1次。

1.2.3 標本采集及處理 各組末次激發(fā)24 h后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉小鼠。小鼠固定于手術(shù)臺進行氣管插管，小心暴露胸腔，血管夾夾住右主支氣管，以0.4 mL磷酸緩沖鹽溶液（PBS）重復灌洗左肺，共3次，合并灌洗液，于4℃離心機離心（700×g，10 min）。將上清液保存于-80℃冰箱，剩余的細胞沉淀用于涂片，再將小鼠右肺剝離，10%中性甲醛浸泡固定。取右肺中葉，常規(guī)石蠟包埋切片，用于蘇木素-伊紅（HE）染色，觀察肺組織形態(tài)學變化。其余肺組織用生理鹽水沖洗后，保存于-80℃冰箱，用于蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測。

1.2.4 哮喘程度評分 根據(jù)小鼠行為學變化嚴重程度對哮喘的嚴重程度進行分級評估，具體方法如下。無異常：0分；點頭或震顫：1分；嗆咳：2分；腹肌痙攣：3分；跌倒：4分。

1.2.5 肺泡灌洗液（BALF）中炎癥細胞計數(shù) BALF的細胞沉淀中加入500 μL生理鹽水，混勻后，取100 μL于載玻片中常規(guī)制備細胞涂片。嚴格按照Diff-Quick染色步驟進行染色，光學顯微鏡下進行炎癥細胞計數(shù)。

1.2.6 肺組織形態(tài)學觀察 從10%中性甲醛中取出并選取同一部位適量大小的肺組織塊，分別經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等常規(guī)石蠟包埋切片步驟，HE染色，光學顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織形態(tài)學變化。

1.2.7 ELISA 法測定 BALF 中 IL-4、IL-5、TNF-α和IL-1β水平 嚴格根據(jù)ELISA試劑盒說明書要求，使用酶標儀檢測，并根據(jù)樣品吸光度值確定BALF中 IL-4、IL-5、TNF-α 和 IL-1β水平。

1.2.8 免疫組織化學法檢測 將各組切片分別進行熔蠟、脫蠟、脫水處理，沸水中進行抗原修復（30min），然后分別用TWEAK（4℃過夜孵育）一抗和二抗（常溫孵育2 h）進行孵育。DAB顯色，蘇木精復染，最后封片，顯微鏡下觀察。

1.2.9 Western Blot法檢測 將樣品進行蛋白裂解后，使用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒檢測各樣品蛋白濃度。每個泳道加入等量的蛋白質(zhì)樣品并分離完成后，轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜中，5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，并加入稀釋的一抗（TWEAK、Fn14、β-actin）4℃過夜。洗膜，并用相應的二抗孵育3 h。使用電化學發(fā)光（ECL）法進行化學發(fā)光，Amersham Imager 600多功能成像儀采集圖像。

1.2.10 統(tǒng)計學方法 本實驗采用SPSS 19.0軟件分析各組數(shù)據(jù)，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布、方差齊性采用單因素方差分析，若不符合正態(tài)分布、方差齊性采用非參數(shù)秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃酚對哮喘程度評分的影響 與CON組比較，OVA組小鼠哮喘評分上升，出現(xiàn)腹肌抽搐、嗆咳及運動功能失調(diào)等哮喘癥狀。給予大黃酚后，小鼠哮喘評分降低，哮喘癥狀減輕，呈劑量依賴性。見表1。

表1 各組小鼠哮喘程度評分結(jié)果

2.2 大黃酚對BALF炎癥細胞數(shù)量的影響 OVA組BALF中總細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞的數(shù)量較CON組升高（P＜0.01）。與OVA組相比，DEX組與大黃酚各給藥組的總細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數(shù)量減少（P＜0.01）。與RHU-L組比較，RHU-H組和DEX組的總細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數(shù)量減少（P＜0.05）。見表2。

表2 BALF炎癥細胞數(shù)量（±s）

表2 BALF炎癥細胞數(shù)量（±s）

注：與 CON 組比較，*P<0.05，**P<0.01；與 OVA組比較，#P<0.05，##P<0.01；與 RHU-L 組比較，△P<0.05。

淋巴細胞（×107個/L）CON 組 10 2.53±0.11 1.22±0.06 1.35±0.65 3.37±0.36 OVA 組 10 9.67±0.72** 4.43±0.22**8.82±0.62** 18.32±1.69**DEX 組 10 4.72±0.33*##△ 2.11±0.16*##3.89±0.41*##△ 7.55±0.64**##△RHU-L 組 10 7.21±0.57**#3.36±0.37**#6.42±0.59**#13.64±0.89**##RHU-M 組 10 5.58±0.25*## 2.73±0.23*##4.85±0.32**##10.42±0.67**##RHU-H 組 10 3.83±0.26##△ 2.37±0.19## 2.88±0.17*##△ 6.67±0.53**##△組別 動物數(shù) 總細胞（×108個/L）嗜酸性粒細胞（×108個/L）中性粒細胞（×107個/L）

2.3 大黃酚對肺組織病理學的影響 CON組小鼠氣道管壁完整，上皮細胞排列整齊，管腔無狹窄、黏液，無明顯炎性細胞浸潤。OVA組小鼠氣道管壁完整性明顯受損，上皮細胞排列紊亂，管腔明顯縮窄，可見較多黏液及大量炎性細胞浸潤。與OVA組比較，DEX組及大黃酚各給藥組氣道管壁較OVA組相對完整，上皮細胞脫落數(shù)量、管腔黏液、炎性細胞浸潤均減少。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理形態(tài)學觀察（HE染色，×10）

2.4 大黃酚對BALF中IL-4、IL-5、TNF-α和IL-1β水平的影響 OVA組 BALF中 IL-4、IL-5、TNF-α和IL-1β水平較CON組升高（P＜0.01）。與OVA組相比，DEX組與大黃酚各給藥組的IL-4、IL-5、TNF-α 和IL-1β水平降低（P＜0.05或 P＜0.01）。與RHU-L組比較，RHU-H組的IL-5、TNF-α和IL-1β水平降低（P＜0.05）。見圖 2。

圖2 各組小鼠BALF中IL-4、IL-5、TNF-α和IL-1β水平（±s，n=10）

2.5 大黃酚對各組小鼠肺組織中TWEAK表達的影響 免疫組織化學染色結(jié)果可見，與CON組比較，OVA組氣道周圍TWEAK蛋白表達升高。與OVA組比較，DEX組與大黃酚各給藥組的TWEAK蛋白表達降低。見圖3。

圖3 各組小鼠肺組織中TWEAK表達情況（HE 染色，×40）

2.6 大黃酚對肺組織中TWEAK和Fn14蛋白表達的影響 與CON組比較，各組小鼠肺組織中TWEAK和Fn14表達量升高（P<0.05或P<0.01）。與OVA組比較，DEX組與大黃酚各給藥組小鼠肺組織中TWEAK和Fn14表達量降低（P<0.05或P<0.01）。與RHU-L組比較，RHU-H組小鼠TWEAK和Fn14表達量降低（P<0.05）。見圖4。

圖4 各組小鼠肺組織中TWEAK和Fn14表達情況（±s，n=10）

3 討論

哮喘屬于慢性炎癥性疾病范疇，主要特征有炎癥細胞浸潤（嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等）、氣道高反應性及黏液分泌過多等，引起一系列的氣道炎癥性反應。哮喘的發(fā)病機制異常復雜，涉及多種炎性細胞和炎性細胞因子。有研究報道TWEAK/Fn14通路在哮喘氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[7]。然而，基于長期大劑量使用糖皮質(zhì)激素會導致較多的不良反應發(fā)生，故目前仍需迫切尋求具有高效低毒的治療藥物來提高哮喘患者的生存質(zhì)量。大黃酚是一種從中藥大黃中純化的單體化合物，現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)大黃酚具有抗氧化、抗凋亡和抗炎等多種藥理作用，提示其可能對哮喘有著較好的保護作用。而本研究也證實大黃酚能夠通過TWEAK/Fn14信號通路明顯減輕OVA誘導哮喘小鼠的炎癥性癥狀，表明大黃酚可能是防治支氣管哮喘疾病潛在的有效藥物。值得注意的是，本實驗使用大黃酚的最高給藥劑量（小鼠給藥劑量200mg/kg，折算成人給藥劑量為22.17 mg/kg）相當于臨床大承氣湯中大黃酚的人每日劑量（0.55 mg/kg）的40倍[8]，有研究表明大黃蒽醌類成分人的毒性劑量可高達4 500 mg/kg[9]。而本實驗分別以50、100、200 mg/kg的大黃酚灌胃給藥后，均未發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)嚴重腹瀉情況，但大黃酚各給藥組小鼠的糞便排泄量比CON組多。此外，該劑量范圍內(nèi)給藥尚未發(fā)現(xiàn)其他不良反應。

炎性細胞，如嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞和單核細胞等，遷移至肺組織是形成哮喘氣道炎癥的重要致病因素，其中炎性細胞的定向遷移受到多種趨化細胞因子的復雜調(diào)控，輔助T細胞（Th）1/Th2失衡是目前被廣泛接受的哮喘重要發(fā)病機制之一[10]。本研究發(fā)現(xiàn)OVA誘導的小鼠BALF中增加了大量炎癥細胞浸潤，包括淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞等。同時，OVA誘導的OVA組小鼠BALF中促炎細胞因子輔助 T 細胞（Th）1（TNF-α、IL-1β）、Th2（IL-4、IL-5、IL-13）的水平明顯升高，表明 OVA 誘導的小鼠哮喘模型破壞了Th1與Th2的平衡。HE染色結(jié)果顯示，OVA誘導的OVA組小鼠氣管內(nèi)有大量黏液和炎癥細胞浸潤。綜上所述，提示了小鼠過敏性哮喘模型建立成功。而給予不同劑量的大黃酚后，可明顯降低BALF中淋巴細胞、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞數(shù)量。同時，HE染色結(jié)果顯示不同劑量大黃酚可減少氣管內(nèi)的黏液分泌和炎癥細胞浸潤，明顯改善小鼠哮喘癥狀。TWEAK是一種可以表達于多種細胞的Ⅱ型跨膜蛋白，TWEAK通過Fn14發(fā)揮對其他細胞的調(diào)節(jié)作用，包括促進炎癥細胞活性、調(diào)節(jié)細胞生長、血管生成等[11]。有研究發(fā)現(xiàn)TWEAK/Fn14通路在哮喘氣道炎癥發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用[7]。本研究免疫組織化學染色和Western Blot檢測結(jié)果表明大黃酚可以降低肺組織中TWEAK和Fn14的表達水平，提示大黃酚可能通過作用于TWEAK/Fn14信號通路，從而改善哮喘氣道炎癥癥狀。

綜上所述，大黃酚通過減少哮喘程度評分、減少肺組織中黏液量、減輕炎癥細胞浸潤、抑制炎癥細胞因子，并降低TWEAK和Fn14蛋白生成，從而改善哮喘氣道炎癥，其作用機制可能與調(diào)節(jié)TWEAK/Fn14信號通路密切相關(guān)。