張環(huán)宇 ，王文秀 ，高晗 ，譚偉 ，余小磊 ，李振國 ，田曉軒

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津 301617；3.牡丹江友搏藥業(yè)有限責任公司，牡丹江 157000）

水蛭為螞蟥（Whitmania Pigra Whitman）、水蛭（Hirudo nipponica Whitman）或柳葉螞蟥（Whitmania acranutata Whitman）的干燥全體[1]。目前中藥材市場中主要流通品種為螞蝗，又名寬體金線蛭，為藥用優(yōu)良品種[2-3]。近年來，水蛭作為原料藥被大量用于中藥制劑的開發(fā)，導致水蛭中藥材價格上漲，常有不法藥材銷售商對水蛭中藥材摻假出售[3]。因此，對水蛭的質(zhì)量鑒別尤為重要。

傳統(tǒng)水蛭鑒定方法主要包括性狀鑒別及理化鑒別[4-5]，這些技術在水蛭鑒定和質(zhì)量控制中發(fā)揮了關鍵作用。隨著分子生物學的發(fā)展，分子鑒別技術在中藥材鑒定中得到了廣泛的應用，與傳統(tǒng)的形態(tài)和化學檢測方法相比，分子技術具有更高的準確度。環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）是一種新型的等溫核酸擴增技術，因其操作簡便、儀器費用低廉、結果分析簡單、快速等優(yōu)點成為目前常用的核酸檢測技術之一[6-7]。因此，本研究針對水蛭線粒體細胞色素氧化酶I（COI）基因序列設計LAMP引物，結合熒光染料法對寬體金線蛭及其常見混偽品進行快速鑒別。

1 材料與儀器

1.1 藥品 取采自中藥材市場的4份水蛭樣品進行特異性實驗，見表1。實際樣品檢測材料共9份水蛭樣品，見表2。樣品經(jīng)牡丹江友搏藥業(yè)有限責任公司張孝晨根據(jù)樣品形態(tài)等特征進行性狀鑒定。

表1 實驗材料

表2 實際樣品檢測材料

1.2 儀器 凝膠成像分析儀（Cuene Genins）；DYY-8C型核酸電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；ZHJH-C1112B型超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）；聚合酶鏈式反應（PCR）儀（Eppendorf）；ZF-6型紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；JA3003型電子精密天平（天津天馬衡基儀器有限公司）。

1.3 試劑 Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶（紐英倫生物技術有限公司）；Tks Gflex DNA聚合酶（寶日醫(yī)生物技術有限公司）；瓊脂糖（Lonza）；無水乙醇（天津市大茂化學試劑廠）；6×上樣緩沖液（Loading buffer，寶日醫(yī)生物技術有限公司）；10 000×SYBR Green I核酸染料（北京索萊寶科技有限公司）；DuRed核酸染料（北京泛博生物化學有限公司）；D2000 DNA Marker（北京天根生化科技有限公司）；50×TAE（合肥志宏生物技術有限公司）；無酶水（Biosharp）；DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；Tks Gflex DNA聚合酶（寶日醫(yī)生物技術有限公司）；等溫擴增反應緩沖液（紐英倫生物技術有限公司）；MgSO4（100 mmol/L，紐英倫生物技術有限公司）。

2 實驗方法及結果

2.1 引物特異性檢測實驗 剪取4份特異性實驗樣品（2條寬體金線蛭、1條光潤金線蛭、1條日本醫(yī)蛭）肌肉組織約30 mg，將其放入潔凈的1.5 mL離心管中，另取一離心管以無酶水代替DNA模板作為陰性對照。按照動物組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取總DNA，取5 μL提取產(chǎn)物，加入1 μL的6×Loading buffer混勻后于DuRed染色的1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察DNA提取質(zhì)量及長度。使用紫外分光光度計測量所提取的DNA濃度及A260/A280，儲存于-20°C。選擇通用引物COI（見表3）對提取的DNA 進行擴增，25 μL 反應體系包括 12.5 μL 2×反應緩沖液、0.5 μL 10 μmol/L LCO1490（10 μmol/L）、0.5 μL 10 μmol/L HCO2198（10 μmol/L）、0.5 μL DNA模板、1.25 U Tks Gflex DNA 聚合酶、10.5 μL 無酶水。引物序列見表3。PCR檢測在PCR儀上進行，擴增程序為：98℃預變性1 min，98℃變性10 s，52℃退火15 s，68℃延伸30 s，40個循環(huán)，68℃再延伸5 min。擴增結束后取5 μL擴增產(chǎn)物，加入1 μL 6×Loading buffer混勻后于DuRed染色的1%瓊脂糖凝膠進行電泳，選擇陽性PCR產(chǎn)物樣品進行一代雙端測序。一代測序結果見表1。

2.2 LAMP引物設計與合成 將上述一代測序所得4條水蛭序列進行LAMP引物設計，使用Geneious 8.0.4去除引物區(qū)，利用MAFFT v7.271進行對齊，篩選寬體金線蛭特有的變異位點，針對其變異位點在網(wǎng)站（http：//primerexplorer.jp/lampv5e/index.html）設計LAMP引物組，挑選3組引物組于Oligo 7進行引物評價，篩選引物質(zhì)量最佳的1組引物作為本次實驗所用引物組。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，LAMP引物序列見表3。

表3 引物及反應條件

2.3 LAMP法檢測中藥材寬體金線蛭方法的建立 配置反應體系為25 μL，包括0.2 μmol/L sz-F3（10 μmol/L）、0.2 μmol/L sz-B3（10 μmol/L）、1.6 μmol/L sz-FIP（10 μmol/L）、1.6 μmol/L sz-BIP（10 μmol/L）、1×等溫擴增反應緩沖液、8 U Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶、6 mmol/L MgSO4（100 mmol/L）、1.4 mmol/L三磷酸脫氧核苷酸（dNTPs）（10 mmol/L）、1 μL DNA模板，加無酶水補充總體積至25 μL。將反應液于64℃恒溫反應60 min，80℃下孵育10 min結束反應。反應結束后取5 μL擴增產(chǎn)物于含DuRed核酸染料的1%瓊脂糖凝膠上進行電泳（觀察有無梯狀條帶及條帶的明亮程度），電壓110 V，電泳30 min。在余下20 μL擴增產(chǎn)物中加入0.2 μL 10 000×SYBR GreenⅠ核酸染料，在自然燈下及254 nm紫外光下觀察顏色變化。

2.4 LAMP特異性檢測結果 擴增產(chǎn)物于含DuRed核酸染料的1%瓊脂糖凝膠上電泳，結果見圖1A，寬體金線蛭呈梯狀條帶（陽性），對照組無條帶產(chǎn)生（陰性）。在余下20 μL擴增產(chǎn)物中加入0.2 μL 10 000×SYBR GreenⅠ核酸染料，于自然燈下觀察結果見圖1B，寬體金線蛭在自然光下變?yōu)榫G色（陽性），光潤金線蛭、日本醫(yī)蛭、陰性對照均呈橙黃色（陰性）。將加入了0.2 μL 10 000×SYBR GreenⅠ核酸染料的擴增產(chǎn)物置于254 nm紫外燈下觀察顏色變化，結果見圖1C，寬體金線蛭在254 nm紫外光下呈綠色熒光（陽性），對照組無熒光產(chǎn)生（陰性）。以上結果表明，所設計的LAMP引物能對寬體金線蛭進行特異性擴增。

圖1 LAMP反應特異性檢測結果

3 水蛭實際樣品檢測

收集市售9份水蛭樣品，按照“2.1”項所述方法進行DNA提取、PCR擴增及一代測序，對所收集樣品進行分子鑒定，一代測序結果見表2。運用所設計的LAMP引物按上述步驟進行LAMP擴增，反應時間為60 min，對水蛭實際樣品進行檢測。檢測結果見圖2。擴增產(chǎn)物于含DuRed核酸染料的1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，結果見圖2A，編號K1、K2、K3樣品均呈梯狀條帶（陽性），對照組無條帶產(chǎn)生（陰性）。在余下20 μL擴增產(chǎn)物中加入0.2 μL 10 000×SYBRGreenⅠ核酸染料，自然燈下觀察結果見圖2B，編號K1、K2、K3樣品在自然光下變?yōu)榫G色（陽性），對照組呈橙黃色（陰性）。將加入了0.2 μL 10 000×SYBR GreenⅠ核酸染料的擴增產(chǎn)物置于254 nm紫外燈下觀察，結果見圖2C，編號K1、K2、K3樣品在254 nm紫外光下呈綠色熒光（陽性），對照組無熒光產(chǎn)生（陰性）。3種檢測方式中的陽性結果樣品與表2中分子鑒定結果為寬體金線蛭的樣品一致。以上結果表明，本研究所建立的寬體金線蛭LAMP檢測技術可實現(xiàn)對市售寬體金線蛭及其常見混偽品的快速鑒別。

圖2 LAMP實際樣品檢測結果

4 討論

準確檢測寬體金線蛭對水蛭的臨床用藥安全具有重要意義。目前水蛭的鑒別方法，如高效液相色譜法、高效毛細管電泳法等通常需要大型儀器設備，不利于寬體金線蛭的現(xiàn)場快速鑒別。因此，本研究通過設計4條LAMP特異性引物，利用具有鏈置換活性的Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶，在64°C恒溫下保溫60 min即可結束反應，無需熱循環(huán)儀。且本研究建立了3種LAMP檢測方法，分別為瓊脂糖凝膠電泳法及在自然光、254 nm紫外光下肉眼觀察核酸染料SYBR GreenⅠ的顏色變化，以對寬體金線蛭進行準確識別。該檢測體系的結果判定只需加入核酸染料，肉眼即可觀察到顏色變化，操作簡便。因此本研究提供了寬體金線蛭的基源快速鑒定方法，具有操作簡便、儀器費用低廉、特異性良好、檢測快速等優(yōu)點。

適宜的靶標序列是DNA分子鑒定準確性的基礎保障。研究表明，以COI為靶標序列可將正品水蛭與其他混偽品明顯區(qū)分[3]。因此，本研究基于線粒體COI基因序列建立了中藥材寬體金線蛭的LAMP檢測體系。本研究的結果表明，利用LAMP技術可成功將寬體金線蛭與光潤金線蛭、日本醫(yī)蛭、歐洲醫(yī)蛭及牛蛭屬物種區(qū)分開來，且特異性良好。