佟盼盼，陳文霞，王芋丹，張萌萌，張毅，鄭曉風(fēng)，劉璐瑤，蘇戰(zhàn)強(qiáng)，謝金鑫

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052)

產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌(Shiga toxin-producingEscherichiacoli，STEC)是與人類(lèi)出血性結(jié)腸炎(hemorrhagic colitis，HC)和溶血性尿毒癥綜合征(hemolytic uremic syndrome，HUS)相關(guān)的食源性病原體[1]。牛和牛肉制品是其主要宿主和傳染源。STEC每年在全世界引起病例數(shù)多達(dá)280萬(wàn)[2]。雖然O157∶H7 STEC是最常報(bào)道的血清型，但目前的研究表明，非O157 STEC感染的病例數(shù)有時(shí)超過(guò)O157 STEC[3]。

細(xì)菌的毒力決定簇主要由移動(dòng)基因編碼或與遺傳元件相關(guān)，如噬菌體、質(zhì)粒、插入元件或轉(zhuǎn)座子。大量毒力決定簇位于毒力島(pathogenicity islands，PAIs)上，可以在不同細(xì)菌物種之間交換，并通過(guò)選擇壓力組裝和穩(wěn)定，發(fā)生致病性變異[4]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，致病菌株和非致病菌株的毒力差異不同程度歸因于PAIs上的基因差異[5]。一些致病大腸埃希氏菌利用Ⅲ 型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system，T3SS)，編碼在PAI腸細(xì)胞脫落位點(diǎn)(locus of enterocyte effacement，LEE)上，將廣泛的效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞，以破壞細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)，促進(jìn)細(xì)菌定植[6]。編碼T3SS基因位于LEE中并分散于染色體各處[6]。在感染人類(lèi)的致病菌株中除了確定位于LEE上的基因以外，還鑒定到大量的非LEE效應(yīng)基因(non-LEE encoded effectorsnles)位于其他PAIs上，這些基因參與宿主細(xì)胞內(nèi)的各種功能，有助于細(xì)菌在腸道中定植和毒性，包括抗凋亡活性，破壞宿主固有免疫反應(yīng)，增加細(xì)胞膜通透性、阻斷細(xì)胞分裂、破壞微管細(xì)胞骨架和抑制吞噬等[7]?；趎le基因含量檢測(cè)的分子風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估已被用于預(yù)測(cè)STEC菌株對(duì)人類(lèi)健康是否構(gòu)成重大風(fēng)險(xiǎn)[8-11]。

STEC的致病性主要?dú)w因于其攜帶的多個(gè)毒力基因組島，如STX(志賀毒素)、LEE PAI和Hly(溶血素)，除此之外，一些非LEE基因組O島(O-island，OI)也與細(xì)菌毒力相關(guān)，如OI-57、OI-71及OI-122與人類(lèi)暴發(fā)HC和HUS相關(guān)[8-9,11-12]。

目前，除了LEE以外，關(guān)于STEC的其它PAIs的研究很少?；赑AIs可以作為區(qū)分強(qiáng)毒株和弱毒株的標(biāo)記，本研究擬調(diào)查OI-36、OI-57、OI-71和OI-122在新疆牛源和人源STEC中的分布和流行情況，以預(yù)測(cè)牛源STEC感染人的風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 受試菌株為2017年-2021年本實(shí)驗(yàn)室(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院臨床實(shí)驗(yàn)室)保存的139株牛源非O157 STEC[13-14]和3株人源非O157 STEC(來(lái)自2019年臨床腹瀉樣本，由烏魯木齊市沙依巴克區(qū)疾病預(yù)防控制中心惠贈(zèng))。142株STEC有34株僅攜帶stx1，24株僅攜帶stx2，84株同時(shí)攜帶stx1和stx2，9株eae+。用含有終濃度150 mL/L甘油的生理鹽水保菌并儲(chǔ)存于-80℃，從最初分離限次傳代以確保其遺傳穩(wěn)定性。

1.1.2 主要試劑 Thermo PCR反應(yīng)試劑(2×TaqPCR Green Mix)、Gelgreen(Biotium)，中國(guó)北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；E.coli營(yíng)養(yǎng)肉湯(EC肉湯)、麥康凱培養(yǎng)基(MAC)，中國(guó)青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 PCR儀(TC1000-G)，美國(guó)SCILOGEX公司產(chǎn)品；電泳儀(DYY-6D)，中國(guó)北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；凝膠電泳成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Red公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 參考文獻(xiàn)[8]合成OI-36(nleB2、nleC、nleH1-1和nleD)，OI-57(nleG2-3、nleG5-2和nleG6-2)，OI-71(nleA、nleF、nleG、nleG2-1、nleG9和nleH1-2)，OI-122(ent/espL2、nleB和nleE)基因的引物；參考文獻(xiàn)[12]合成IO-122上的4個(gè)特定基因Z4321、Z4326、Z4332和Z4333的引物(表1)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，按說(shuō)明書(shū)稀釋后保存于-20℃冰箱備用。

1.2.2 毒力島OI-36、OI-57、OI-71和OI-122的PCR擴(kuò)增 使用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取142株受試菌的基因組DNA，利用PCR方法進(jìn)行PAIs OI-36(nleB2、nleC、nleH1-1和nleD)；OI-57(nleG2-3、nleG5-2和nleG6-2)；OI-71(nleA、nleF、nleG、nleG2-1、nleG9和nleH1-2)；OI-122(ent/espL2、nleB和nleE)基因檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系：12.5 μLTaqMaster Mix，1 μL細(xì)菌DNA模板，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，加入ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性10 s，55℃退火1 min，72℃ 1 min 30個(gè)循環(huán)；72℃延長(zhǎng)10 min。根據(jù)擴(kuò)增基因的不同，調(diào)整退火溫度，參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 本研究中編碼OI毒力基因的引物序列

1.2.3 OI-122特定基因的PCR擴(kuò)增 利用PCR擴(kuò)增IO-122上的4個(gè)特定基因Z4321、Z4326、Z4332和Z4333。根據(jù)Karmali M A提出的模塊化方式分析檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)檢出這4個(gè)基因?yàn)橥暾腛I-122(COI-122)，檢出1個(gè)～3個(gè)基因?yàn)椴煌暾腛I-122(INC)，4個(gè)基因都未檢出，表明不存在OI-122(ABS)；進(jìn)一步劃分為模塊1(Z4321)、模塊2(nleB、nleE、ent/espL2和Z4326)和模塊3(Z4332、Z4333)，每個(gè)模塊至少檢測(cè)出1個(gè)基因標(biāo)記即可判斷存在OI-122[12]。

2 結(jié)果

2.1 編碼OI單個(gè)毒力基因的檢出情況

在142株非O157 STEC中編碼OI單個(gè)毒力基因的檢出頻率不同，牛源和人源STEC均不同程度攜帶20種OI毒力基因，但有24株未攜帶其中任意一種，單個(gè)毒力基因中nelG9(OI-71)檢出率最高，為63%；Z4321和Z4326(OI-122)次之，分別為33%和36%；nleC(OI-36)檢出率最低，為1%。這2株菌均為人源分離株。

2.2 編碼OI的毒力譜分布

編碼OI的毒力譜的分布，(a)OI-36有6種毒力譜，其中nleD+nleH1-1組合最多，占40%；(b)OI-57有4種毒力譜，其中nleG2-3+nleG5-2組合最多，占43%；(c)OI-71有11種毒力譜，nleG9最多，占83%；(d)OI-122顯示7種毒力譜，其中Z4321最多，占43%。OI-122由位于島上不同區(qū)域的7個(gè)標(biāo)記基因確定，在142株受試菌株中，84株(59%)至少攜帶1種OI-122毒力基因，9株為eae+。

2.3 編碼OI-122毒力基因的模塊化分析

OI-122的特定基因PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，142株受試菌株中有83株(58%)攜帶不完整的OI-122，58株攜帶1種毒力基因，25株攜帶2種～3種毒力基因，59株(42%)不存在OI-122。模塊1、模塊2和模塊3分別出現(xiàn)在33%、37%和6%的菌株中。

2.4 編碼OI毒力基因與eae和stx關(guān)系分析

142株受試菌，攜帶編碼OI毒力基因在11種以上(包含11種)的菌株有10株，如表2所示，9株為eae+菌株，其中有6株eae+菌株至少攜帶14種編碼OI毒力基因，且均攜帶stx1基因，表明編碼OI-36、OI-57、OI-71和OI-122的毒力基因與eae+STEC高度相關(guān)。

表2 攜帶11種以上編碼OI毒力基因的非O157 STEC

3 討論

本研究首次在國(guó)內(nèi)牛源和人源非O157 STEC上調(diào)查PAIs的分布。單個(gè)編碼OI毒力基因的檢測(cè)結(jié)果與Soledad-Cadona等的檢測(cè)結(jié)果相比[6]，相同之處在于nleC(OI-36)的檢出率都很低(分別為1%和2%)，本研究中2株攜帶nleC的STEC來(lái)自于人，Soledad-Cadona等檢出的4株中有3株也來(lái)源于人[6]；不同之處在于本研究發(fā)現(xiàn)nleG9(OI-71)的檢出率最高(63%)，而Soledad-Cadona等發(fā)現(xiàn)Z4321(OI-122)的檢出率最高(61%)[6]。雖然我們了解NleG蛋白為泛素連接酶，但對(duì)nleG9的確切功能還不清楚。通過(guò)分析每種OI毒力譜分布發(fā)現(xiàn)在非O157 STEC中有多種編碼OI毒力基因的缺失，這印證了Soledad-Cadona等的假設(shè)，PAIs在STEC中可能不穩(wěn)定[6]。

位于PAIs上的毒力基因可用于識(shí)別新出現(xiàn)的致病菌[12,15-16]。已有研究表明，同時(shí)檢出eae、ent/espL2、nleB、nleE和nleH1-2的STEC菌株對(duì)人的毒性更高[11]。nleB和nleE是NF-KB通路的抑制因子，nleB通過(guò)阻止免疫調(diào)節(jié)因子NF-κB易位至細(xì)胞核進(jìn)而抑制宿主細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，并拮抗死亡受體誘導(dǎo)感染的細(xì)胞凋亡[17]。本研究中9株eae+菌株(6株牛源+3株人源)攜帶了11種及以上編碼OI的毒力基因，值得注意的是，eae、ent/espL2、nleB、nleE和nleH1-2同時(shí)存在于4株牛源和1株人源STEC菌株中，表明eae+且同時(shí)攜帶多種編碼OI毒力基因的非O157 STEC潛在感染人的風(fēng)險(xiǎn)。24株未攜帶任何被檢基因，且均為eae-，表明eae-菌株，似乎更容易缺乏OI基因。

已有研究表明COI-122陽(yáng)性菌株與HUS暴發(fā)相關(guān)[10,18-19]，LEE的核心區(qū)域缺乏可能與移動(dòng)遺傳元件相關(guān)，有研究指出OI-122的核心區(qū)域包含幾個(gè)與移動(dòng)遺傳元件相關(guān)的基因[14]，可能導(dǎo)致OI不如LEE穩(wěn)定。本研究中142株STEC中均未攜帶完整的COI-122，可能與其核心區(qū)域的遺傳元件相關(guān)，還需進(jìn)一步研究確認(rèn)。

本研究發(fā)現(xiàn)PAIs在牛源和人源非O157 STEC上分布不同，PAIs與eae+菌株關(guān)系密切。與牛源STEC相比，腹瀉患者源STEC攜帶的編碼PAIs的毒力基因更豐富，部分牛源STEC同人源分離株攜帶同種編碼PAIs的毒力基因，提示其潛在感染人的風(fēng)險(xiǎn)。