章建紅， 沈登鋒， 洪春桃， 焦云， 魏斌， 潘存德

(1.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)研究所，浙江 寧波 315040； 2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與園藝學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

光合作用是所有植物生存生長的基礎(chǔ)。高鹽環(huán)境會影響植物光合作用的正常進行，主要表現(xiàn)為氣孔抑制與非氣孔因素抑制，一般表現(xiàn)為植物在鹽脅迫環(huán)境中的葉片胞間二氧化碳濃度升高，并通過調(diào)節(jié)氣孔開度以降低其CO2濃度。槲櫟在鹽脅迫環(huán)境中光合作用受限，主要與氣孔抑制有關(guān)[1]；枸杞受到鹽脅迫后，短期內(nèi)光合作用受限是由于氣孔因素導(dǎo)致，長期鹽脅迫致使光合作用能力下降則為非氣孔因素所導(dǎo)致[2]；這一結(jié)果與對海濱錦葵的研究結(jié)果一致[3]；張會慧等[4]發(fā)現(xiàn)，桑樹在鹽脅迫下其葉黃素循環(huán)受到抑制，PSⅡ反應(yīng)中心正常功能受影響導(dǎo)致光合作用的下降。葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)研究表明，鹽環(huán)境下植物的電子傳遞效率[5]和PSⅡ活性[6]同樣受到影響。然而，不同植物或相同植物在不同生理時期和試驗環(huán)境下的光合作用受影響的程度有一定差異。薄殼山核桃原產(chǎn)于北美，目前在我國廣泛種植[7]，但薄殼山核桃Pawnee在鹽脅迫下的抗性表現(xiàn)還不是很清楚。本研究以一年生薄殼山核桃Pawnee幼苗為試驗材料，采用水培法比較不同濃度的NaCl對其葉綠素含量、光合特性及葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響，探討薄殼山核桃Pawnee耐鹽性的生理機制，以期為健全薄殼山核桃濱海地區(qū)鹽堿地栽培技術(shù)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以一年生薄殼山核桃品種Pawnee容器苗為供試材料，試驗于2019年4—11月在寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)業(yè)高新技術(shù)園區(qū)溫室大棚內(nèi)進行。

1.2 處理設(shè)計

配置不同濃度水平的NaCl溶液(0、0.3%、0.6%、0.9%)對一年生薄殼山核桃Pawnee的容器苗進行鹽脅迫處理，視干濕情況每隔2～5 d澆1次NaCl溶液，每次澆NaCl溶液定量為1.5倍容器的容量，重復(fù)3次，每處理含30株幼苗，按0、1、10、30、45、75、105 d處理時間點采集葉片樣品用于后續(xù)檢測分析。

1.3 觀察和測定

1.3.1 葉綠素含量

每處理組分別從5個以上植株隨機剪取1張葉片(頂部開始往下第三輪全功能葉)作為1個樣品，重復(fù)3次。將采回的新鮮葉片剔除中脈剪碎混勻，稱取0.2 g樣品浸泡于5 mL 95%乙醇中，室溫暗環(huán)境放置48 h后(至葉片完全發(fā)白)，對樣品進行短暫離心，棄去管底部的葉片殘渣，保留上清液。用紫外可見分光光度計(UV-1800PC，Mapada，Shanghai)并參照相關(guān)文獻中的方法[8]，測定葉片中葉綠素和類胡蘿卜素含量。

1.3.2 光合作用與葉綠素?zé)晒鈪?shù)

每處理固定2個植株，不作其他采樣處理，對其相同部位的全功能葉片，使用便攜式光合測定系統(tǒng)(LI 6400XT，USA)，CO2濃度為400 μmol·mol-1，光照強度設(shè)置為1 000 μmol·m-2·s-1，參考Wang等[9]方法測定光合作用參數(shù)，測定在上午8:30—11:30進行，每處理重復(fù)測6次。同時，葉綠素?zé)晒鈪?shù)采用PAM-2500便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x(Walz，Germany)，測定前用夾子夾住葉片，暗適應(yīng)處理30 min，參照高麗麗等[10]方法測定有關(guān)參數(shù)，每處理重復(fù)測定6次。

1.3.3 葉綠體超微結(jié)構(gòu)

取不同處理組植株葉片的相同部位(避開葉脈位置)，用去離子水沖洗干凈后，將葉片切成2 mm見方的小塊，置于磷酸緩沖液(0.1 mmol·L-1，pH 7.0)配制的2.5%戊二醛離心管中，抽真空使葉片沉于戊二醛底部，放在4 ℃下固定過夜。小心吸出戊二醛，用1.0 mL磷酸緩沖液(0.1 mmol·L-1，pH 7.0)對樣品進行漂洗，每次15 min，重復(fù)3次。棄去漂洗液，在通風(fēng)櫥環(huán)境中加入1.0 mL由磷酸緩沖液(0.1 mmol·L-1，pH 7.0)配制的1%鋨酸，對樣品固定2 h；棄去鋨酸溶液，加入1 mL磷酸緩沖液(0.1 mmol·L-1，pH 7.0)對樣品漂洗，每次30 min，重復(fù)4次。再參照Guo等[11]的方法，用透射電鏡(Hitachi H-7650，Japan)觀察葉綠體的超微結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)均匯總至Excel 2016，并利用DPS v 14.10軟件[12]對相關(guān)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用鄧肯新復(fù)極差檢驗法進行多重比較，在α=0.05水平進行顯著性檢驗，使用OriginPro軟件2021版繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素含量

如圖1所示，與CK相比，0.3%NaCl處理的總?cè)~綠素含量呈先下降后上升再下降的趨勢，在處理30 d時總?cè)~綠素含量開始高于CK，且在45 d時達到最大值，隨后又開始逐漸降低并顯著的低于CK；而對于0.6%NaCl處理，總?cè)~綠素含量趨勢上先上升而后下降，在處理1 d后總含量迅速上升并超過CK，約為CK的1.2倍，隨后開始隨著處理時間的延長而逐漸慢慢降低，并顯著低于CK。對于0.9%NaCl處理，在處理1 d后總?cè)~綠素含量便顯著低于CK，并隨著處理時間的延長逐漸降低，并始終低于CK。

同天數(shù)比較柱上無相同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)。圖2～3同。

此外，不同處理組中葉綠素a、b含量的變化與總?cè)~綠素含量的變化趨勢是類似的，同時，與CK相比，0.3%和0.6%NaCl處理的葉綠素a/b比值在處理前30 d差異不顯著，而之后顯著低于CK，而0.9%NaCl處理在10 d差異不顯著，之后顯著低于CK(表1)。NaCl處理下的胡蘿卜素含量隨處理時間的增加而逐漸的低于CK。由此可見，短期內(nèi)低濃度水平(0.3%NaCl)處理可能使植株葉綠素的含量有所增加，但長期處理下3種濃度水平的NaCl處理均會導(dǎo)致葉綠素含量的降低。

表1 不同濃度NaCl處理下葉片中葉綠素a/b比值

2.2 光合參數(shù)

如圖2所示，與CK相比，0.3%NaCl處理的凈光合速率(Pn)呈先下降后上升再下降的趨勢，在處理前30 d，Pn值持續(xù)下降，而后Pn值開始回升，至處理45 d時達到峰值，并達到近似CK的水平，且一直持續(xù)到75 d，其Pn值一直與CK無顯著差異。對于0.9%NaCl處理，其Pn值隨著處理時間的延長呈下降趨勢，但前期降幅較為緩和，在處理30 d時降為CK的83%，之后降幅迅速增加，到45 d時僅有1.49 μmol·m-2·s-1。由此表明，薄殼山核桃幼苗在0.3%NaCl短期處理下，光合作用會呈現(xiàn)一定的適應(yīng)性，但3種濃度的NaCl長期處理均會使得Pn值降低，且降幅隨著處理濃度和時間的延長而增加。此外，0.6%NaCl處理的細胞間隙CO2濃度(Ci)在處理1 d 后，增長為CK的1.61倍，并在后期處理中一直顯著高于CK。而0.9%NaCl處理在1 d后增長為CK的1.35倍，并隨著處理時間的延長而一直增長，在處理45 d時增長為CK的1.77倍，這意味著高水平鹽濃度(0.6%和0.9%)處理下會使薄殼山核桃葉片的Ci值顯著增加。同此，0.9%NaCl處理的蒸騰速率(Tr)值在處理1 d后便增長為CK的1.11倍，在處理10 d后達到峰值，為CK的1.43倍，直到鹽處理后期(植株發(fā)生萎蔫時)才低于CK。這表明鹽脅迫會顯著影響薄殼山核桃的蒸騰速率，尤其是高鹽濃度顯著加劇了蒸騰速率。值得注意的是，0.9%NaCl處理的氣孔導(dǎo)度(Gs)在處理1 d后就上升為CK的1.24倍，并一直保持高于CK，而該組中各數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差較大，意味著高鹽濃度下可能會由于離子平衡的紊亂使得薄殼山核桃氣孔導(dǎo)度增加，且氣孔開張的波動性較大。

圖2 不同濃度NaCl處理對葉片光合作用的影響

2.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)

由圖3可知，0.3%NaCl處理在前45 d，其PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)的值與CK無明顯差異，在處理75 d時略微超過CK，但在處理105 d時降為CK的94%，這意味著該濃度水平鹽脅迫對薄殼山核桃PSⅡ的活性影響較小。而高鹽濃度水平(0.6%、0.9%)處理會迅速減弱PSⅡ的活性，但在處理后期，F(xiàn)v/Fm又可恢復(fù)到正常水平，暗示著PSⅡ在該濃度下(0.6%、0.9%)受到的損傷是可逆的。類似的，0.6%和0.9%NaCl處理的非光化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ值)均呈先下降后上升的趨勢，在處理前10 d均低于CK，而處理30 d后NPQ值迅速上升，并顯著高于CK，并一直持續(xù)到鹽處理后期，這意味著植株以熱耗散形式散失的能量增多，減輕了PSⅡ光抑制程度，同時減緩了光合系統(tǒng)的損傷，可能是薄殼山核桃應(yīng)對鹽脅迫的一種保護機制。此外，在0.3%和0.6%NaCl處理的前期，通過降低光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP值)，減小PSⅡ的開放程度，降低光合速率，而處理后期通過qP值的升高增加PSⅡ的開放程度，進而減緩了光合速率的下降。

圖3 不同濃度NaCl處理對葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.4 葉綠體超微結(jié)構(gòu)

利用透射電鏡對不同濃度NaCl處理10 d的葉片進行切片觀察。圖4顯示，CK的葉綠體呈長橢圓形或橄欖球形，球體飽滿，類囊體片層整齊，層數(shù)多，排列緊密，淀粉粒飽滿積累在葉綠體中，葉綠體被膜清晰；0.3%NaCl處理下類囊體片層排列雖整齊緊密，但葉綠體膜已開始出現(xiàn)與細胞壁分離，葉綠體膜與細胞壁之間出現(xiàn)空隙；0.6%NaCl處理下葉綠體萎縮與細胞壁分離，類囊體片層排列不整齊、松散；0.9%NaCl處理下葉綠體扭曲呈扁圓形或球形，類囊體片層排列不整齊、稀疏。由此可見，不同濃度的NaCl處理均對葉綠體的結(jié)構(gòu)造成一定程度的損壞，且受損程度隨著NaCl濃度水平的增加而變得嚴(yán)重。

A、B、C、D分別為CK、0.3%NaCl、0.6% NaCl、0.9%NaCl處理，各處理中的左右圖比例尺分別為2μm和1μm。1～8分別為中央大葉泡、細胞核、葉綠體、類囊體片層、線粒體、淀粉粒、噬鋨顆粒和細胞壁。

3 小結(jié)與討論

鹽脅迫會對植物的光合作用造成一定的影響[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在0.6%和0.9%濃度處理下，薄殼山核桃Pawnee幼苗的Pn值整體上隨著處理時間的延長而逐漸降低；而在0.3%NaCl短期時間處理下Pn值呈現(xiàn)一定的上升趨勢并恢復(fù)到CK水平，光合作用會表現(xiàn)出一定的適應(yīng)性，但在處理105 d時又低于CK，說明三種濃度的NaCl長期處理均會使得Pn值降低，且降低幅度隨著處理濃度與處理時間的延長而增加。此外，NaCl脅迫條件下，光合作用的下降主要由氣孔因素與非氣孔因素兩個原因所引起[15]。氣孔因素主要是通過Gs的降低或關(guān)閉而引起CO2的供應(yīng)不足，使光合速率下降，如低鹽濃度下擬南芥、小麥光合速率的下降可歸結(jié)于此類原因[16-17]。而非氣孔因素則是通過改變光系統(tǒng)及碳同化過程關(guān)鍵酶活性等影響光合作用，如一定鹽濃度下黃瓜、野生大豆光合作用的降低屬于此類原因[18-19]。鹽脅迫對光合作用的限制因素會隨著NaCl濃度的不同而改變。在0.3%、0.6%NaCl處理下，酸柚苗Pn下降的主要原因是氣孔限制，在0.9%NaCl處理下的Pn下降的主要原因是非氣孔因素[20]。與酸柚苗相似的是，薄殼山核桃Pawnee在0.3%NaCl處理下，其Pn、Ci和Gs的變化趨勢基本相同，說明在該濃度下，氣孔因素可能是限制其光合作用的主要因素。對于0.6%NaCl處理組，其Gs隨處理時間而變化的規(guī)律性不強，波動性較大；而0.9%NaCl處理組的Ci和Gs整體上隨著處理時間的增加而增大，但Pn值卻呈下降趨勢，表明在高鹽濃度(0.6%和0.9%)下，可能通過非氣孔因素抑制其光合作用。

另外，葉綠素是植物進行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，在光能吸收過程中發(fā)揮著重要作用。同時，葉片葉綠素含量也是反映植物生理狀態(tài)的重要指標(biāo)之一[21-22]。鹽脅迫條件下會使葉綠素發(fā)生降解，并降低植物光系統(tǒng)的活性[23-24]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)低濃度水平NaCl處理會使植株的葉綠素含量有所增加，這可能是對NaCl脅迫的一種適應(yīng)性的表現(xiàn)，但長期處理下，3種濃度的NaCl處理依然會導(dǎo)致葉綠素含量發(fā)生不同程度的降低。因此，NaCl脅迫處理對薄殼山核桃PSⅡ的活性也造成一定影響。葉綠素?zé)晒鈗P值的變化表明，在0.3%和0.6%NaCl處理的前期，可能通過減小PSⅡ的開放程度，降低光合速率；在鹽脅迫處理后期，通過增加PSⅡ開放程度，可減緩光合速率的降低；0.9%NaCl則主要通過抑制qP值而減小PSⅡ的開放程度，降低光合速率。值得注意的是，在3種濃度NaCl處理的后期，F(xiàn)v/Fm值又可以恢復(fù)到正常水平，表明PSⅡ的最大光化學(xué)效率是可以恢復(fù)的，PSⅡ并未受到非可逆性的損傷。此外，前期研究結(jié)果表明，鹽脅迫會破壞葉綠體的結(jié)構(gòu)，損壞光系統(tǒng)活性中心，使電子運輸速率和碳同化速率顯著降低，最終使植物的光合作用受到抑制[25-27]。本研究中透射電鏡結(jié)果表明，3種濃度水平的NaCl處理均損壞了葉綠體的結(jié)構(gòu)，且受損程度隨著NaCl濃度的增加而更加嚴(yán)重，從而進一步解釋了鹽脅迫造成薄殼山核桃葉片光合作用降低的原因。