趙艷坤 劉慧敏 孟璐 王成 王加啟 鄭楠

（1. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（烏魯木齊）新疆農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

大腸埃希菌（Escherichia coli）是一種在微生物界具有特殊地位的致病菌，可以引起人類和動(dòng)物的嚴(yán)重感染。2020年的中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)分析報(bào)告顯示，革蘭氏陰性菌是最常見(jiàn)的醫(yī)源性細(xì)菌，其檢出率高達(dá)71%［1］，其中E.coli位居首位，給臨床治療帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。近年來(lái)，隨著抗菌藥物在臨床和畜牧業(yè)的大量及不合理使用，E.coli耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重，對(duì)現(xiàn)有可用抗菌藥物均存在耐藥性，尤其是多重耐藥（multi-drug resistance，MDR）及泛耐藥（pan-drug resistance，PDR）的出現(xiàn)，同時(shí)，E.coli也是耐藥基因的主要儲(chǔ)存庫(kù)，既是耐藥基因的供體，又是耐藥基因的受體，可導(dǎo)致動(dòng)物-人類-環(huán)境之間耐藥的傳播，已經(jīng)成為全球性醫(yī)學(xué)與社會(huì)問(wèn)題，嚴(yán)重威脅當(dāng)下的公共健康安全。

研究發(fā)現(xiàn)，E.coli還存在另一種耐藥情況，即細(xì)菌異質(zhì)性耐藥（heteroresistance，HR）［2］。通過(guò)特殊的檢測(cè)方法，從一些常規(guī)藥敏實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)敏感而抗菌藥物治療不佳的臨床患者分離培養(yǎng)的細(xì)菌中檢測(cè)到耐藥甚至更高水平耐藥的亞群，正是這些耐藥亞群的存在將很可能導(dǎo)致患者反復(fù)感染和治療失敗［3］。這一現(xiàn)象在包括E.coli在內(nèi)的多種細(xì)菌中已有較多報(bào)道。早在1994年已有E.coli對(duì)甲硝唑產(chǎn)生異質(zhì)性耐藥而導(dǎo)致治療失敗的報(bào)道［4］，近年來(lái)，E.coli對(duì)碳青霉烯類、多黏菌素、磷霉素、替加環(huán)素、頭孢噻呋、哌拉西林/他唑巴坦等抗菌藥物也出現(xiàn)了異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象，但其異質(zhì)性耐藥機(jī)制尚未明晰。本文簡(jiǎn)要綜述E.coli的異質(zhì)性耐藥流行狀況以及異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象的機(jī)制，旨在積極響應(yīng)人-動(dòng)物-環(huán)境“One Health”理念，為進(jìn)一步加深對(duì)E.coli異質(zhì)性耐藥的認(rèn)識(shí)和重視，為其評(píng)估治療方案和指導(dǎo)臨床抗菌藥物的合理使用提供參考。

1 異質(zhì)性耐藥的發(fā)現(xiàn)及特征

異質(zhì)性耐藥的定義是指某個(gè)單一分離菌株，在其培養(yǎng)的群體中存在著對(duì)某種藥物敏感性不同的亞群，即有些亞群對(duì)該藥物敏感，而另一些亞群則存在對(duì)該藥物耐藥的情況［2］。異質(zhì)性現(xiàn)象最早于1947年被描述［5］，在鏈霉素治療嗜血桿菌感染的流感病人期間，14人中3人治療失敗并且被證明是由于病人機(jī)體內(nèi)嗜血桿菌對(duì)鏈霉素的敏感性發(fā)生了變化，但一直未得到重視。直到1999年日本報(bào)告1例男性肺癌術(shù)后的痰標(biāo)本中分離到1株耐甲氧西林的葡萄球菌，其萬(wàn)古霉素最小抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為3 mg/L，按照國(guó)際臨床實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）規(guī)定屬于敏感菌，但用萬(wàn)古霉素治療12 d無(wú)效，后用特殊的檢測(cè)方法確定為異質(zhì)性耐藥萬(wàn)古霉素菌株［6］。逐步引起部分專家的關(guān)注，但研究大多致力于醫(yī)院金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌等表型異質(zhì)性耐藥研究，幾乎不涉及動(dòng)物源病原菌異質(zhì)性耐藥。直到2015年，El-Halfawy和Valvano發(fā)表了題為“抗菌藥物異質(zhì)性：一個(gè)需要明確的新興領(lǐng)域”的重要評(píng)述［7］，引起全球各領(lǐng)域關(guān)注，開(kāi)啟關(guān)于細(xì)菌異質(zhì)性耐藥的廣泛研究。

異質(zhì)性耐藥主要有3種形式［8］。（1）整個(gè)細(xì)菌群體對(duì)抗菌藥物完全敏感，而亞群的MIC則不同，這種形式在臨床最不重要（除非反應(yīng)最差的亞群對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥）；（2）細(xì)菌最經(jīng)典的異質(zhì)性耐藥，即大多數(shù)細(xì)菌種群對(duì)抗菌藥物敏感，有少數(shù)高度耐藥，以傳統(tǒng)藥物敏感性折點(diǎn)為指導(dǎo)的抗菌藥物治療會(huì)導(dǎo)致失??；（3）整個(gè)細(xì)菌種群（包括抵抗力最低的亞群）都具有耐藥性或中等耐藥性，其中一組亞群顯示出對(duì)抗菌藥物耐藥性增加。

異質(zhì)性耐藥是一種現(xiàn)象，其主要特征包括：（1）異質(zhì)性耐藥的細(xì)菌仍能在抗菌藥物暴露下存活，部分細(xì)菌亞群的MIC值顯著增加（至少8倍）［2］；（2）異質(zhì)性耐藥的耐藥表型不穩(wěn)定，當(dāng)抗菌藥物壓力下降時(shí)，細(xì)菌會(huì)恢復(fù)到抗菌藥物敏感狀態(tài)［9］；（3）異質(zhì)性耐藥分離株中耐藥細(xì)菌的頻率非常低（＜1/10 000），耐藥細(xì)菌亞群在總?cè)后w中占少數(shù)［10］。目前，公認(rèn)的MIC是細(xì)菌敏感或者耐藥的判斷標(biāo)準(zhǔn)，然而，由于異質(zhì)性耐藥典型的特征，為評(píng)估抗菌藥物對(duì)致病菌的治療效果帶來(lái)了極大困難，使MIC數(shù)據(jù)的可靠性降低，且異質(zhì)性耐藥常被錯(cuò)誤分類為抗菌藥物敏感，從而導(dǎo)致抗菌藥物治療時(shí)不僅不能治療感染，反而將逐漸進(jìn)化為耐藥，促進(jìn)了耐藥突變株的產(chǎn)生，造成反復(fù)感染，病程延長(zhǎng)，導(dǎo)致治療失敗。因此，及時(shí)檢測(cè)表型異質(zhì)性耐藥，精準(zhǔn)選擇抗菌藥物，才能達(dá)到成功的治療結(jié)果。

2 異質(zhì)性耐藥的檢測(cè)方法

迄今為止，尚無(wú)檢測(cè)異質(zhì)性耐藥的“金標(biāo)準(zhǔn)”，不同實(shí)驗(yàn)室、不同菌株使用的檢測(cè)方法各不相同。目前，用于檢測(cè)異質(zhì)性耐藥的主要方法包括：E-test法、K-B紙片擴(kuò)散法和群體譜分析法（population analysis profiling，PAP）。E-test法、K-B法 均 為 異質(zhì)性耐藥檢測(cè)的初篩方法，當(dāng)抑菌圈內(nèi)有散在菌落出現(xiàn)時(shí)即為疑似異質(zhì)性耐藥菌株，方法簡(jiǎn)便、直觀，但假陰性、假陽(yáng)性檢出率較高，并且無(wú)法對(duì)各亞群的耐藥程度及耐藥亞群數(shù)量進(jìn)行定量。PAP法被認(rèn)為是檢測(cè)異質(zhì)性耐藥菌株最可靠的方法，PAP通常使用標(biāo)準(zhǔn)MIC測(cè)定的格式，以2倍抗菌藥物增量，并通過(guò)使用擴(kuò)散板技術(shù)進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)，當(dāng)異質(zhì)性耐藥亞群比主要群體的MIC高8倍，且異質(zhì)性耐藥的發(fā)生頻率≥1×10-7，則被判定為異質(zhì)性耐藥菌株［11］，但其成本高，耗時(shí)長(zhǎng)，不能快速有效地對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。隨后，對(duì)PAP進(jìn)行了改良，出現(xiàn)了微量稀釋PAP法（microtitration population analysis profiling，MPAP），研究表明，MPAP比常規(guī)PAP檢測(cè)更快、成本更低，且能夠明確異質(zhì)性亞群的頻率和MIC，但細(xì)菌密度較高可能會(huì)增加假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)［12］。此外，改良的群體譜分析曲線法（PAP assay comparing the area under the curve，PAPAUC）是檢測(cè)異質(zhì)性萬(wàn)古霉素中介金黃色葡萄球菌（Heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus，hVISA）的“金標(biāo)準(zhǔn)”［13］，但該方法操作更為繁瑣且昂貴，且可能會(huì)錯(cuò)誤分類具有高度不同抗菌藥物濃度依賴性亞群大小的分離株，不適宜作為其他異質(zhì)性耐藥菌株的檢測(cè)。不同異質(zhì)性耐藥的檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)表1。

表1 異質(zhì)性耐藥的檢測(cè)方法對(duì)比Table 1 Comparison of detection methods for heteroresistance

近年來(lái)，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，開(kāi)發(fā)了一些異質(zhì)性耐藥檢測(cè)的新型方法，通過(guò)比較多種抗菌藥物濃度下的單個(gè)細(xì)菌生長(zhǎng)情況，準(zhǔn)確識(shí)別與耐藥相關(guān)的異質(zhì)性。數(shù)字PCR（Droplet Digital PCR，dd PCR）可以檢測(cè)與耐藥性相關(guān)的基因或點(diǎn)突變，即使它們只存在于細(xì)菌的一個(gè)亞群中［20］。越來(lái)越多的臨床試驗(yàn)采用全基因組測(cè)序法（whole genome sequencing，WGS）檢測(cè)分離菌株中耐藥亞群，通過(guò)菌株中耐藥亞群基因型的變化，確定異質(zhì)性耐藥［21］，WGS的準(zhǔn)確度遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的表型檢測(cè)，但該方法對(duì)于檢測(cè)頻率＜1%的亞群仍有局限性。此外，雖然表型耐藥和基因型之間有較好的相關(guān)性，但仍存在一些差異，可能導(dǎo)致基因分型結(jié)果分析復(fù)雜化，這些方法作為臨床異質(zhì)性耐藥檢測(cè)仍面臨很大困難。因此，未來(lái)急需開(kāi)發(fā)較低成本、較高準(zhǔn)確率以及識(shí)別較低頻率的耐藥亞群（遠(yuǎn)低于1%）的臨床實(shí)用性異質(zhì)性耐藥檢測(cè)技術(shù)。

3 大腸埃希菌異質(zhì)性耐藥的研究現(xiàn)狀

3.1 大腸埃希菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物異質(zhì)性耐藥的研究現(xiàn)狀

E.coli的異質(zhì)性耐藥相關(guān)研究常見(jiàn)于碳青霉烯類抗菌藥物，E.coli對(duì)碳青霉烯類異質(zhì)性耐藥（carbapenem-heteroresistant E.coli，CHEC）表型已在全球多項(xiàng)研究中進(jìn)行了報(bào)道，幾乎都在人類醫(yī)學(xué)方面，E.coli對(duì)于不同研究之間表現(xiàn)出異質(zhì)性耐藥分離株流行率存在很大差異，從0%-100%（表2）。

表2 大腸埃希菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物異質(zhì)性耐藥的流行情況Table 2 Prevalence of heteroresistance of E. coli to carbapenems

Nicoloff等［11］通過(guò) E-test初步判定和 PAP 法對(duì)來(lái)自瑞典的11株醫(yī)院臨床分離的E.coli進(jìn)行了異質(zhì)性耐藥性篩查，以最小抑菌濃度（MIC）/非抑菌濃度（NIC）（MIC/NIC）≥8來(lái)確定，其中厄他培南（ertapenem，ETP）顯示出最高的異質(zhì)性耐藥率（27.3%），而未發(fā)現(xiàn)E.coli對(duì)亞胺培南（imipenem，IPM）和美羅培南（meropenem，MEM）的異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象。另一個(gè)來(lái)自美國(guó)的試驗(yàn)通過(guò)紙片擴(kuò)散初篩和改良的PAP方法測(cè)定E.coli的異質(zhì)性耐藥，MIC/NIC≥8判定其異質(zhì)性耐藥，發(fā)現(xiàn)E.coli對(duì)ETP、IPM和MEM均表現(xiàn)出很高的異質(zhì)性耐藥率，分別為35%，25%和30%。不難發(fā)現(xiàn)，CHEC在不同研究之間差異很大，表明碳青霉烯類抗菌藥物的用藥背景決定E.coli對(duì)異質(zhì)性耐藥的流行率，在國(guó)外，E.coli對(duì)ETP表現(xiàn)異質(zhì)性耐藥比對(duì)IPM和MEM和具有異質(zhì)性耐藥更常見(jiàn)。

2015年，Sun等［20］首次報(bào)道了中國(guó)侵襲性E.coli感染中的碳青霉烯類抗菌藥物異質(zhì)性耐藥的情況，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)紙片擴(kuò)散或E-test篩選了332株臨床E.coli分離株的異質(zhì)性耐藥，結(jié)果顯示，114株E.coli對(duì)碳青霉烯類藥物具有異質(zhì)性耐藥性，CHEC的流行率為34.3%，PAP結(jié)果顯示，在ETP濃度高達(dá)10%的情況下，耐藥亞群的增長(zhǎng)分別為≥4 mg/L和128 mg/L，能夠在最高藥物濃度下生長(zhǎng)的耐藥亞群比例為8.00×10-8。E.coli異質(zhì)性耐藥率最高的為IPM（25%），其次是ETP（17.2%），對(duì)MEM的異質(zhì)性耐藥性率相對(duì)較低，為3.9%。另外，還發(fā)現(xiàn)了對(duì)碳青霉烯類藥物的共異質(zhì)性耐藥（Co-heteroresistance，CHR）的現(xiàn)象，達(dá)17.54%。此外，超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase，

ESBL）的產(chǎn)生與E.coli分離株CHEC表型顯著相關(guān)。研究表明，ESBL產(chǎn)生是導(dǎo)致E.coli對(duì)ETP和IPM產(chǎn)生異質(zhì)性耐藥的一個(gè)關(guān)鍵因素，并被認(rèn)為可能參與了對(duì)兩種抗菌藥物的CHR，產(chǎn)ESBL的細(xì)菌更多地具有CHR特征［26］。研究顯示，在對(duì)碳青霉烯類不敏感的E.coli中ESBL的流行率很高（96.7%），尤其是 CTX-M 型 ESBL［27］。湯麗霞等［24］采用 E-test初篩和PAP（MIC/NIC≥8）確定的檢測(cè)方法，在200株E.coli中共檢出83株碳青霉烯異質(zhì)性耐藥，CHEC的流行率為41.5%，對(duì)ETP、IPM和MEM的異質(zhì)性耐藥率分別為10%、19%和0.5%，同樣發(fā)現(xiàn)存在CHR現(xiàn)象，其中對(duì)IPM、ETP和MEM均表現(xiàn)為異質(zhì)性耐藥的E.coli比例為7.23%，與Sun等研究結(jié)果一致。另外，張文萍等［25］采用K-B紙片法聯(lián)合E-test和PAP的方法研究CHEC的流行情況，得到了趨勢(shì)一致的結(jié)果。這與國(guó)外的研究結(jié)果不盡一致，除地域差異，很大程度上取決于異質(zhì)性耐藥的定義方式和檢測(cè)方法及判定不統(tǒng)一?？赡艿脑蛞皇荌PM的抗菌選擇壓力要強(qiáng)于ETP和MEM，二是IPM的優(yōu)先使用在碳青霉烯類異質(zhì)性耐藥的高流行中起了關(guān)鍵作用。此外，不合理使用碳青霉烯類抗菌藥物和無(wú)視管理舉措都促進(jìn)了E.coli對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥性的演變。總之，適當(dāng)使用MEM并謹(jǐn)慎使用IPM和ETP是全球碳青霉烯類治療E.coli的明智之舉。

3.2 大腸埃希菌對(duì)黏菌素類抗菌藥物異質(zhì)性耐藥的研究現(xiàn)狀

目前，E.coli對(duì)黏菌素的異質(zhì)性耐藥的研究相對(duì)較少（表3），Juhász等［28］使用含有4 mg/L黏菌素的瓊脂平板法和MIC法評(píng)估耐碳青霉烯類的E.coli對(duì)黏菌素的異質(zhì)性耐藥情況發(fā)現(xiàn)，異質(zhì)性耐藥性率僅為3.4%，遠(yuǎn)低于碳青霉烯類，對(duì)黏菌素異質(zhì)性耐藥亞群的發(fā)生頻率在1.25×10-8-1.10×10-5。Liao等［29］研究發(fā)現(xiàn)291株E.coli中對(duì)黏菌素的耐藥率為0.69%，對(duì)黏菌素敏感的E.coli菌株中1.37%具有異質(zhì)性耐藥，其耐藥亞群的MIC值比親本菌株高16-64倍，耐藥亞群的發(fā)生頻率為4.00×10-7-4.00×10-6，在無(wú)抗培養(yǎng)基中傳代1周后，黏菌素對(duì)耐藥亞群的MIC值沒(méi)有變化，表明耐藥亞群的穩(wěn)定性良好。異質(zhì)性耐藥可以是穩(wěn)定的，即亞群在沒(méi)有抗菌藥物壓力下不恢復(fù)耐藥性，然而，異質(zhì)性耐藥多表現(xiàn)為不穩(wěn)定，即亞群在無(wú)抗菌藥物暴露下耐藥性降低或恢復(fù)為敏感［9］。鄺啟紅等［30］首次在中國(guó)豬源分離的E.coli中發(fā)現(xiàn)對(duì)黏菌素異質(zhì)性耐藥，采用PAP（MIC/NIC≥4）確認(rèn)了12株MDR的E.coli中有11株顯示出異質(zhì)性耐藥（91.67%），說(shuō)明MDR E.coli也傾向于表現(xiàn)異質(zhì)性耐藥，每個(gè)異質(zhì)性耐藥菌株均包含1個(gè)以上耐藥亞群，共獲得 17個(gè)耐藥亞群，且多個(gè)亞群對(duì)黏菌素的敏感性存在明顯差異，耐藥亞群的發(fā)生頻率為6.61×10-7-2.57×10-6。耐藥亞群在無(wú)抗培養(yǎng)50代后，大部分可以完全恢復(fù)到親本分離株的易感水平，說(shuō)明大多數(shù)亞群是不穩(wěn)定和短暫的，只有一個(gè)亞群保持對(duì)黏菌素的耐藥性（MIC為4 mg/L），這也揭示了黏菌素治療失敗的原因?？紤]到實(shí)驗(yàn)室中的常規(guī)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)往往會(huì)錯(cuò)誤地將異質(zhì)性耐藥分離株識(shí)別為“易感”，實(shí)際卻存在不同程度的異質(zhì)性耐藥亞群，因此應(yīng)高度關(guān)注耐藥亞群的存在，El-Halfawy等［31］認(rèn)為耐藥亞群的頻率隨抗菌藥物濃度而變化，為了便于未來(lái)不同研究之間的比較，建議應(yīng)盡可能報(bào)告抗菌藥物濃度高于原耐藥水平8倍的亞群頻率（圖1）。

圖1 異質(zhì)性耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)的推薦方案（改自文獻(xiàn)［31］）Fig. 1 Recommended scheme for determination of heteroresistance（Modified from reference［31］）

表3 大腸埃希菌對(duì)粘菌素類抗菌藥物異質(zhì)性耐藥的流行情況Table 3 Prevalence of heteroresistance of E. coli to colistin antibiotics

近年來(lái)，E.coli的異質(zhì)性耐藥研究逐漸增多，相繼有報(bào)道表明E.coli對(duì)磷霉素、頭孢噻呋、替加環(huán)素等抗菌藥物存在異質(zhì)性耐藥。目前，關(guān)于E.coli異質(zhì)性耐藥幾乎均在人類分離株中進(jìn)行，動(dòng)物源相關(guān)的研究少之甚少，E.coli異質(zhì)性耐藥的流行來(lái)自不同的醫(yī)院或養(yǎng)殖場(chǎng)，屬于不同的克隆組，表明E.coli異質(zhì)性耐藥或許與特定的克隆或醫(yī)院無(wú)關(guān)，可能是自發(fā)進(jìn)化的。鑒于人類中大部分食源性E.coli感染可以追溯到動(dòng)物，所以對(duì)動(dòng)物中E.coli異質(zhì)性耐藥研究可以為將來(lái)人類感染的耐藥機(jī)制提供思路，同時(shí)對(duì)動(dòng)物臨床合理用藥以達(dá)到理想的治療效果具有重大意義。

4 大腸埃希菌的異質(zhì)性耐藥機(jī)制

4.1 碳青霉烯類抗菌藥物的異質(zhì)性耐藥機(jī)制

盡管對(duì)E.coli異質(zhì)性耐藥的研究已在逐漸深入，但目前E.coli異質(zhì)性耐藥的機(jī)制仍未十分明確，主要異質(zhì)性耐藥機(jī)制如圖2。E.coli對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物異質(zhì)性耐藥的分子機(jī)制主要是產(chǎn)碳青霉烯酶、突變引起細(xì)菌外膜通透性下降［24］、膜孔蛋白缺失及外排泵高表達(dá)等。ESBL產(chǎn)生、孔蛋白缺乏和β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)升高會(huì)降低E.coli對(duì)ETP的敏感性［32］。張文萍等［25］研究結(jié)果表明，E.coli產(chǎn)ESBLs酶與碳青霉烯異質(zhì)性耐藥有關(guān)。由于異質(zhì)性耐藥是耐藥性進(jìn)化的過(guò)渡階段，ESBL的產(chǎn)生也參與對(duì)頭孢吡肟的異耐藥機(jī)制。研究證實(shí)ESBL的產(chǎn)生與頭孢吡肟表型異質(zhì)性耐藥的E.coli分離株增加顯著相關(guān)［26］，原因是ESBL可以水解頭孢吡肟，水解酶基因的異質(zhì)性表達(dá)可導(dǎo)致對(duì)頭孢吡肟的表型異質(zhì)性耐藥［33］。此外，由于孔蛋白編碼基因oprD的表達(dá)減少［34］，穩(wěn)定的耐藥亞群顯示出外排相關(guān)基因的上調(diào)和碳青霉烯類藥物的膜通透性降低。blaTEM-1表達(dá)上調(diào)聯(lián)合膜孔蛋白表達(dá)下調(diào)與E.coli亞胺培南的異質(zhì)性耐藥有關(guān)［35］。代佳伶［36］研究報(bào)道IPM-HR耐藥菌株不表達(dá)blakpc、blaNDM-1、blaIMP、blaVIM等產(chǎn)碳青霉烯酶基因，檢出ESBLs基因blaCTM-M-3，并且膜孔蛋白OmpF缺失，因此膜孔蛋白OmpF缺失可能是E.coli IPM-HR現(xiàn)象產(chǎn)生的機(jī)制之一。

圖2 大腸埃希菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的異質(zhì)性耐藥機(jī)制（改自文獻(xiàn)［9］）Fig. 2 Heteroresistance mechanism of E.coli to carbapenems（Modified from reference［9］）

由耐藥基因的自發(fā)不穩(wěn)定基因擴(kuò)增引起的不穩(wěn)定耐藥是革蘭氏陰性菌異質(zhì)性耐藥的最常見(jiàn)機(jī)制［8］。在存在甲氧西林的情況下，E.coli中自發(fā)突變的頻率很高（約為10-5/代），并導(dǎo)致高頻率的耐甲氧西林菌株，因此產(chǎn)生異質(zhì)性耐藥，突變率高的原因是100多個(gè)基因的突變可以產(chǎn)生對(duì)甲氧西林的耐藥性，其中一些基因的耐藥性表型是由功能缺失突變引起的（例如，參與半胱氨酸生物合成的半胱氨酸激酶失活）［37］。E.coli中的哌拉西林-他唑巴坦異質(zhì)性耐藥也有類似的基因擴(kuò)增機(jī)制［38］，其耐藥性的產(chǎn)生包括aadB基因在內(nèi)的一個(gè)區(qū)域的20-40倍擴(kuò)增。在不穩(wěn)定的異質(zhì)性耐藥表型中，61%與串聯(lián)擴(kuò)增有關(guān)，這些擴(kuò)增通常是位于質(zhì)?；蛉旧w上的已知耐藥基因。報(bào)道顯示，所有革蘭氏陰性細(xì)菌-抗菌藥物組合中，約14.7%將表現(xiàn)出由不穩(wěn)定基因擴(kuò)增引起的異質(zhì)性耐藥表型。擴(kuò)增突變體的種群頻率（在不影響優(yōu)勢(shì)種群生長(zhǎng)的最高濃度的8倍以上）為2.90×10-7-4.90×10-5［8］。

4.2 黏菌素類抗菌藥物的異質(zhì)性耐藥機(jī)制

現(xiàn)今己報(bào)道的黏菌素的異質(zhì)性耐藥機(jī)制主要包括PmrAB 和 PhoPQ 雙組份系統(tǒng)的激活［3，39］（圖 3）、MgrB 失活［40］、AcrAB-TolC 外排泵［41］和抗性基因串聯(lián)擴(kuò)增［9］。雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)PhoPQ和PmrAB與E.coli黏菌素耐藥性的形成密切相關(guān)［29］。PmrB和PhoQ是組氨酸激酶，而PmrA和PhoP是下游反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，而MgrB負(fù)調(diào)節(jié)PhoPQ系統(tǒng)［42］。鄺啟紅［30］在豬源E.coli黏菌素異質(zhì)性耐藥菌中發(fā)現(xiàn)，PmrB和PhoQ的氨基酸突變是黏菌素異質(zhì)性耐藥菌形成的主要原因，Kuang等［43］研究結(jié)果表明，CHR的E.coli分離株的形成主要與PmrB和/或PhoQ突變相關(guān)，而與PmrA、PhoP和MgrB無(wú)關(guān)，首次證明豬源E.coli中PmrB第93位的氨基酸變異（R93P）會(huì)導(dǎo)致HAMP結(jié)構(gòu)域β螺旋間構(gòu)象變化，加劇PmrAB、PmrC的表達(dá)量升高，是導(dǎo)致其對(duì)黏菌素產(chǎn)生異質(zhì)性耐藥的主要機(jī)制。Huang等［41］報(bào)道，由ecr編碼的小跨膜蛋白能夠通過(guò)PhoPQ介導(dǎo)異質(zhì)性耐藥。在PmrAB和PhoPQ的突變率方面，Sato等［44］證實(shí)在對(duì)黏菌素產(chǎn)生耐藥性或異質(zhì)性耐藥方面，PmrB比PmrA更容易發(fā)生突變。

圖3 革蘭氏陰性菌中PmrAB和PhoPQ雙組分系統(tǒng)調(diào)節(jié)的黏菌素異質(zhì)性耐藥性（改自文獻(xiàn)［2］）Fig. 3 Heteroresistance of colistin regulated by PmrAB and PhoPQ in Gram negative bacteria（Modified from reference［2］）

E.coli最常見(jiàn)的多黏菌素耐藥機(jī)制涉及質(zhì)粒攜帶的移動(dòng)多黏菌素耐藥（mcr）基因，該基因于2016年新發(fā)現(xiàn)并命名為mcr-1［45］。隨后，報(bào)道了幾種氨基酸變體，例如 mcr-2［46］和 mcr-3［47］，這種可轉(zhuǎn)移的黏菌素質(zhì)粒產(chǎn)生的耐藥機(jī)制可能會(huì)加劇并促進(jìn)耐藥性的傳播。Liao等［29］在兩株E.coli黏菌素耐藥菌株中均檢測(cè)到mcr-1基因，且在兩個(gè)異質(zhì)性耐藥菌株中檢測(cè)到PmrB中的突變。

在當(dāng)前研究中，黏菌素異質(zhì)性耐藥機(jī)制多在肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌和沙門菌等革蘭氏陰性細(xì)菌的相關(guān)研究，僅有極少數(shù)文獻(xiàn)涉及E.coli，且多數(shù)為醫(yī)院感染分離菌，而導(dǎo)致E.coli對(duì)黏菌素異質(zhì)性耐藥的潛在機(jī)制仍未完全闡明，較為明確的是與PhoPQ雙組分系統(tǒng)的表達(dá)和活性有關(guān)，該系統(tǒng)調(diào)節(jié)編碼脂質(zhì)A修飾酶的基因的表達(dá)，以減少脂質(zhì)A的負(fù)電荷，從而增加黏菌素耐藥性增加［48］。主要是因?yàn)镻mrD 作為一個(gè)輔助蛋白，將PhoQ-PhoP和PmrB-PmrA連接起來(lái)，磷酸化的PhoP誘導(dǎo)的PmrD 轉(zhuǎn)錄，PmrD結(jié)合到磷酸化的PmrA上，通過(guò)組氨酸激酶PmrB抑制去磷酸化，增加pmrCAB、pmrE和arnBCADTEF的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)黏菌素獲得異質(zhì)性耐藥。。

4.3 其他抗菌藥物的異質(zhì)性耐藥機(jī)制

近年來(lái)，研究人員相繼發(fā)現(xiàn)了哌拉西林-他唑巴坦、頭孢噻呋、頭孢吡肟等β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物異質(zhì)性耐藥的E.coli［49］，其形成原因與敏感菌具有明顯的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)相關(guān)，而多重耐藥區(qū)的插入是導(dǎo)致穩(wěn)定耐藥亞群獲得耐藥的主要原因。研究表明，E.coli替加環(huán)素耐藥機(jī)制與RND家族AcrAB-TolC有關(guān)，AcrAB同時(shí)受外排泵調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中MarAB的調(diào)節(jié)；marA位點(diǎn)直接或間接增加了micF的表達(dá)，導(dǎo)致ompF的表達(dá)減少［50］。劉宇陽(yáng)等［51］研究證實(shí)與原始菌株相比，耐碳青霉烯類E.coli對(duì)替加環(huán)素異質(zhì)性耐藥亞群的外排泵基因acrA、acrB表達(dá)上調(diào)1.79倍、5.01倍；其相關(guān)調(diào)控基因marA、marB分別表達(dá)上調(diào)5.38和2.18倍；膜孔蛋白基因ompC下調(diào)2.35倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)了RND外排泵上調(diào)與替加環(huán)素異質(zhì)性耐藥顯著相關(guān)。

在一組磷霉素異質(zhì)性耐藥菌株中，觀察到uhpT基因缺失，該基因編碼誘導(dǎo)磷霉素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)磷霉素轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)菌體，導(dǎo)致對(duì)磷霉素耐藥的E.coli產(chǎn)生不易察覺(jué)的內(nèi)集落突變體，這些突變體具有很高的生物學(xué)成本（如SNP、插入和刪除），當(dāng)這種耐藥突變體在沒(méi)有抗菌藥物的情況下生長(zhǎng)時(shí)，選擇了補(bǔ)償性突變（分別參與調(diào)節(jié)有氧呼吸、碳分解代謝和包膜應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)基因arcA、crp和cpxR中）［52］，以提高適應(yīng)性和敏感性，在這些代償突變體中，一些突變體失去了其異質(zhì)性耐藥表型，其特征是失去了敏感性降低的細(xì)胞亞群，而另一些突變體仍表現(xiàn)出異質(zhì)性耐藥表型。Campos等［53］對(duì)巴西E.coli磷霉素進(jìn)行異質(zhì)性耐藥研究，murA基因的過(guò)度表達(dá)及由轉(zhuǎn)運(yùn)體和調(diào)節(jié)基因突變引起的磷霉素?cái)z取系統(tǒng)存在缺陷是引起磷霉素異質(zhì)性耐藥機(jī)制的原因。E.coli對(duì)其他抗菌藥物的異質(zhì)性耐藥機(jī)制如表4。

表4 大腸埃希菌對(duì)其他抗菌藥物的異質(zhì)性耐藥機(jī)制Table 4 Heteroresistance mechanism of E.coli to other antibiotics

值得思考的是，生物被膜（biofilm）高度復(fù)雜的相互作用，如自發(fā)突變、外部刺激因素（如宿主免疫系統(tǒng)、抗菌治療）、內(nèi)部微環(huán)境（氧氣、營(yíng)養(yǎng)和pH梯度）和種間相互作用［55-56］等過(guò)程能夠?qū)е律锉荒觾?nèi)形成廣泛不同的亞群，生物被膜生物量越高，這種相互作用越明顯，新興亞種群的數(shù)量將越大。生物量的增加不一定意味著耐藥性的增加，而是異質(zhì)性耐藥的增加［57］。在E.coli菌落中，活性生長(zhǎng)細(xì)胞位于下層，而非生長(zhǎng)饑餓細(xì)菌則棲息在上層，以應(yīng)對(duì)基于擴(kuò)散的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)［58］，由此推斷，生物被膜的形成也可能與E.coli的異質(zhì)性耐藥有關(guān)，但相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。到目前為止，只有一份肺炎克雷伯菌的異質(zhì)性耐藥研究涉及生物被膜［59］，其在肺炎克雷伯菌生物被膜中，發(fā)現(xiàn)了能夠在黏菌素濃度高達(dá)MIC四倍的情況下生長(zhǎng)的異質(zhì)性耐藥亞群。耐藥亞群以穩(wěn)定的小菌落變體的形式表現(xiàn)出與剩余生物被膜群不同的菌落形態(tài)。這些最新發(fā)現(xiàn)是預(yù)測(cè)生物被膜內(nèi)異質(zhì)性耐藥發(fā)生的合理依據(jù)，生物被膜中通常存在的巨大異質(zhì)性生理學(xué)預(yù)測(cè)了此類疾病的發(fā)生表型。因此，生物被膜亞群及其內(nèi)在變異性對(duì)E.coli異質(zhì)性耐藥性出現(xiàn)的貢獻(xiàn)需要積極探索。

5 問(wèn)題與展望

異質(zhì)性耐藥被認(rèn)為是細(xì)菌逐漸進(jìn)化為耐藥的一個(gè)階段，在長(zhǎng)期抗菌藥物壓力環(huán)境下，能適應(yīng)較高抗菌藥物濃度的亞群不斷增加，如果不及時(shí)進(jìn)行干預(yù)，這類菌株將對(duì)抗菌藥物完全耐藥，影響臨床用藥選擇及治療效果。因此，及時(shí)有效的對(duì)異質(zhì)性耐藥菌株進(jìn)行檢測(cè)并防控尤為重要，統(tǒng)一異質(zhì)性耐藥的檢測(cè)和判定標(biāo)準(zhǔn)是先決條件，如簡(jiǎn)化PAP測(cè)試，可通過(guò)在單個(gè)平板上生成由特定抗菌藥物濃度組成的梯度，每種濃度下生長(zhǎng)菌落的自動(dòng)計(jì)數(shù)將確定耐藥亞群的比例及其耐藥水平，然而，實(shí)際上檢測(cè)異質(zhì)性耐藥需要在數(shù)小時(shí)內(nèi)而不是數(shù)天內(nèi)提供臨床治療指導(dǎo)，未來(lái)對(duì)開(kāi)發(fā)基于表型讀數(shù)的診斷工具提出了一個(gè)重要挑戰(zhàn)。

目前，揭示的E.coli異質(zhì)性耐藥機(jī)制較少，異質(zhì)性耐藥的相關(guān)耐藥機(jī)制的研究任重而道遠(yuǎn)。一方面，ESBLs參與了E.coli從異質(zhì)性耐藥到碳青霉烯耐藥的演變，未來(lái)，呼吁對(duì)ESBLs進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)，并闡明其潛在機(jī)制將促進(jìn)新型抗菌藥物的開(kāi)發(fā)，減緩或阻止“不可避免”的進(jìn)化；另一方面，生物被膜是一種重要的耐藥形式，但對(duì)生物被膜的異質(zhì)性耐藥研究十分有限，生物被膜對(duì)于E.coli異質(zhì)性耐藥的影響尚不清楚，異質(zhì)性耐藥在生物被膜中的發(fā)生率不容忽視，仍需開(kāi)展更深入的研究。

此外，盡管諸多有關(guān)異質(zhì)性耐藥的報(bào)道表明了異質(zhì)性耐藥性確實(shí)是一個(gè)臨床問(wèn)題，但仍然缺乏廣泛的研究（特別是前瞻性研究）來(lái)評(píng)估異質(zhì)性耐藥性對(duì)臨床上死亡率和發(fā)病率的臨床影響。且大多數(shù)關(guān)于異質(zhì)性耐藥的研究均采用體外試驗(yàn)或動(dòng)物模型，因此不能完全符合宿主生物體的復(fù)雜機(jī)制，例如病原體和宿主免疫反應(yīng)之間相互作用、不同異質(zhì)性耐藥亞群共存反應(yīng)等，包括難以檢測(cè)的持久細(xì)菌，活的但不可培養(yǎng)（VBNC）細(xì)菌。因此，后續(xù)進(jìn)行臨床研究將是一個(gè)重要的目標(biāo)，通過(guò)使用相關(guān)的臨床結(jié)果參數(shù)來(lái)檢查異質(zhì)性耐藥性的影響，并適當(dāng)分析異質(zhì)性耐藥性表型，以揭示可能導(dǎo)致治療失敗的異質(zhì)性耐藥性的特征。

現(xiàn)階段，全球COIVD-19流行期間，E.coli等病原體的傳播受到一定限制。然而，消毒劑的廣泛使用和抗菌藥物的使用增加可能促進(jìn)其耐藥性的產(chǎn)生和傳播，更應(yīng)重視異質(zhì)性耐藥的流行情況，以防止其多重耐藥性的傳播至關(guān)重要。