李 瀟，張曉黎，高 雅，韓艷秋，王 琛，吳興壯

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學院 食品與加工研究所，遼寧 沈陽 110161）

東北酸菜是以白菜或甘藍經(jīng)發(fā)酵制得的鹽漬菜[1]。作為我國東北地區(qū)特色食品，酸菜因其獨特的風味、爽脆的口感、濃郁醇厚的酸味和營養(yǎng)保健功效深受消費者喜愛。以酸菜為原料烹制的許多菜肴，也已成為我國北方地域飲食文化的一大特色。目前，隨著現(xiàn)代食品加工技術(shù)的不斷發(fā)展，酸菜已逐步由傳統(tǒng)的自然發(fā)酵向人工接種乳酸菌發(fā)酵模式轉(zhuǎn)變[2]。乳酸菌在酸菜的發(fā)酵中起主導作用，通過不同的代謝途徑，豐富的代謝產(chǎn)物在酸菜發(fā)酵的過程中被不斷積累，而這些代謝產(chǎn)物可賦予酸菜獨特的風味[3-4]。因此，其常被用作酸菜工業(yè)生產(chǎn)中的發(fā)酵劑。研究表明，人工接種乳酸菌可縮短酸菜的發(fā)酵周期，降低酸菜亞硝酸鹽含量，穩(wěn)定酸菜質(zhì)量并且改善酸菜品質(zhì)[5]。然而，人工接種乳酸菌發(fā)酵的酸菜由于菌種單一，代謝產(chǎn)物少于由復雜菌系自然發(fā)酵的酸菜，因此在風味上略顯不足[6]。

白酒作為另外一種傳統(tǒng)發(fā)酵飲品，豐富的酯類和醇類物質(zhì)對其飽滿的風味具有重要貢獻[7]。有研究表明，發(fā)酵泡菜的過程中添加一些輔料（如白酒），有助于彌補泡菜風味的不足[8]，而在工業(yè)生產(chǎn)上，為提高泡菜風味品質(zhì)，同時避免生產(chǎn)過程中出現(xiàn)生花現(xiàn)象，部分企業(yè)也會在泡菜水中添加白酒[9]。然而，中國傳統(tǒng)醬香型、濃香型和清香型白酒具有不同的風味特征與感官屬性。相比于香型較濃的醬香型和香型較清爽的清香型，以乙酯類為風味形成關(guān)鍵化合物的濃香型白酒呈現(xiàn)的窖香、花香、果香和甜香的氣味較為適中[10]，更適合作為輔料進行添加。但添加白酒作為輔料對酸菜的風味影響鮮有報道。此外，乳酸菌的生長不可避免會受到乙醇環(huán)境的脅迫[11]。研究表明，過高的乙醇濃度會增加乳酸菌細胞膜的通透性，引起胞內(nèi)物質(zhì)外流同時影響菌體內(nèi)酶的活性，進而影響菌體的代謝與生理活性，抑制其生長甚至造成死亡[12-14]。因此為了有效提高乳酸菌在發(fā)酵后期生長代謝的穩(wěn)定性，選育對醇類脅迫穩(wěn)定的菌種勢在必行。

本研究探究了酸菜中常見的7株乳酸菌的產(chǎn)酸能力與耐乙醇特性，并從中篩選優(yōu)良性能的乳酸菌復配成發(fā)酵劑。將復配的發(fā)酵劑對大白菜進行接種發(fā)酵，通過添加濃香型白酒，對比不同方式發(fā)酵酸菜的揮發(fā)性風味物質(zhì)與感官特性，明確篩選復配的乳酸菌發(fā)酵劑的實際應用效果以及白酒對東北酸菜風味與滋味的改善作用，旨在為東北酸菜的品質(zhì)提升與酸菜發(fā)酵劑的研制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）LNJ005：遼寧省農(nóng)業(yè)科學院食品與加工研究所；發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）BNCC194390、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）BNCC337373、干酪乳桿菌（Lactobacilluscasei）BNCC134415、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）BNCC186447、清酒乳桿菌（Lactobacillus sake）BNCC192620、檸檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）BNCC194779：自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。大白菜、食鹽和白酒（濃香型，酒精度42%vol）：遼寧省沈陽市農(nóng)科院綜合市場。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉粉8.0 g，酵母浸粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，硫酸鎂0.2 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸錳0.05 g，吐溫80 1.0 g，蒸餾水1 L，調(diào)pH為6.0～6.4。121 ℃滅菌20 min。

MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中加入24 g/L瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD型單人單面工作凈化臺：上海滬凈醫(yī)療器械有限公司；CJ50-3疊加式培養(yǎng)箱：上海程捷儀器設(shè)備有限公司；YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；756型紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：安捷倫科技有限公司；SA402B型電子舌：日本INSENT公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化與稀釋

將植物乳桿菌、干酪乳桿菌和檸檬明串珠菌的凍干菌粉分別接入20 mL的MRS液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h。從菌懸液中取0.2 mL接種到20 mL的MRS液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h。將二次傳代培養(yǎng)的菌懸液進行10倍梯度稀釋（10-4、10-5、10-6、10-7），分別從中取0.2 mL涂布于MRS固體培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)48 h。計算乳酸菌菌落總數(shù)。

1.3.2 耐乙醇、產(chǎn)酸能力強乳酸菌的篩選

取0.2 mL從二次傳代培養(yǎng)的菌懸液，接入不同乙醇體積分數(shù)（1%、2%、4%、6%、8%、10%）的MRS固體培養(yǎng)基中進行涂布，30 ℃培養(yǎng)48 h，測定菌株存活率，篩選耐乙醇能力強的乳酸菌。

存活率Rsur計算公式如下：

式中：Na為未添加乙醇的MRS固體培養(yǎng)基中生長的乳酸菌數(shù)，CFU/mL；Nb為添加不同乙醇含量MRS固體培養(yǎng)基中生長的乳酸菌數(shù)，CFU/mL。

將對乙醇具有較高耐受性的乳酸菌在體積分數(shù)4%乙醇的MRS液體培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)24 h。每隔3 h測定菌液pH值，繪制選定乳酸菌在乙醇環(huán)境下的酸度變化曲線，篩選產(chǎn)酸能力強的乳酸菌。

1.3.3 人工接種東北酸菜樣品制備及揮發(fā)性風味成分、感官特性分析

將篩選出的耐乙醇能力和產(chǎn)酸能力較強的乳酸菌的菌懸液以生理鹽水稀釋到相同濃度（菌體數(shù)量級為107CFU/mL）。將耐乙醇能力和產(chǎn)酸能力較強的乳酸菌菌懸液稀釋液等體積混合均勻，制成液體混合菌發(fā)酵劑。

大白菜清洗切絲后，添加2%的食鹽，攪拌均勻。隨后將白菜絲裝入塑料泡菜瓶中并壓實。將液體發(fā)酵劑加入泡菜瓶中，封口前，向每個泡菜瓶中添加2%的白酒，20 ℃密封發(fā)酵30 d。酸菜樣品從泡菜瓶的上、中、下三層收集，并混合均勻，備用[15]。自然發(fā)酵得到的酸菜（未添加發(fā)酵劑和白酒）編號為NF，植物乳桿菌發(fā)酵得到的酸菜編號為L.P，植物乳桿菌、干酪乳桿菌和檸檬明串珠菌混合發(fā)酵得到的酸菜編號為3LAB，3種乳酸菌混合發(fā)酵且添加白酒發(fā)酵得到的酸菜編號為3L+B。測定4種酸菜的理化、微生物指標并分析其揮發(fā)性風味成分及感官特性。

1.3.4 測定方法

可滴定酸：按照參考文獻[16]的方法進行測定。還原糖含量：按照參考文獻[15]的方法進行測定。

揮發(fā)性風味物質(zhì)成分測定：采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用方法（head space-solid phase microextraction-GC-MS，HS-SPME-GC-MS）對樣品風味物質(zhì)進行測定[15]。

樣品處理：取5 g酸菜樣品置于15 mL頂空瓶中，于60 ℃水浴40min，然后插入老化的纖維頭，60℃條件下萃取40min。將萃取好的纖維頭插入GC-MS的進樣口，250 ℃解吸5 min。

氣相色譜條件：Rxi-5Sil MS 色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm），高純度氦氣（He）作為載氣，流速為1 mL/min，以1∶3的分流比運行。升溫程序：柱溫35 ℃保持3 min，以6 ℃/min升至160 ℃，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持3 min。

質(zhì)譜條件：離子源溫度為200 ℃。電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量為70 eV，質(zhì)譜掃描范圍為20～500 m/z。

感官評價：采用衛(wèi)玲玲等[17]的方法并稍作修改。感官評分標準見表1。

表1 酸菜感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standards of Suancai

電子舌測定：采用配備酸、苦、澀、鮮、咸5個傳感器的SA402B型電子舌。取自然發(fā)酵和添加白酒的人工接種發(fā)酵酸菜的發(fā)酵液各50 mL于測量杯中，每種樣品重復測定4次。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

通過“SPSS 20.0”軟件進行方差分析，在P＜0.05水平上進行Duncan檢驗。借助“Excel 2016”軟件進行感官評價的統(tǒng)計與分析。采用“Origin 9.0”軟件進行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐乙醇乳酸菌的篩選

由表2可知，隨乙醇含量的增加，乳酸菌的存活率均下降。發(fā)酵乳桿菌、嗜酸乳桿菌、清酒乳桿菌在乙醇體積分數(shù)為6%時，存活率均降至80%以下。表明這3種菌對乙醇的耐受程度較低。由于干酪乳桿菌、短乳桿菌、檸檬明串珠菌和植物乳桿菌在體積分數(shù)4%乙醇條件下存活率均＞90%，表明這4種菌對體積分數(shù)4%乙醇的耐受程度較高。因此選擇這4種菌進行產(chǎn)酸能力測定。

表2 不同乙醇體積分數(shù)對乳酸菌存活率影響Table 2 Effects of different volume fraction of ethanol on the survival rate of lactic acid bacteria

2.2 乙醇對乳酸菌產(chǎn)酸能力的影響

由圖1可知，未添加和添加體積分數(shù)4%乙醇的植物乳桿菌、檸檬明串珠菌和干酪乳桿菌的產(chǎn)酸趨勢基本相同。其中，植物乳桿菌和檸檬明串珠菌在添加乙醇后，分別在生長3 h和15 h時，環(huán)境的pH已經(jīng)達到5以下。而添加乙醇的干酪乳桿菌初期生長平穩(wěn)，18 h時后pH下降到5以下。相比之下，添加乙醇的短乳桿菌產(chǎn)酸速率較低，生長36 h后環(huán)境pH降到5以下。植物乳桿菌產(chǎn)酸速率快，能力強，生長穩(wěn)定期環(huán)境pH達到3.6左右。檸檬明串珠菌前期生長略受抑制，但其產(chǎn)酸速率較快。而干酪乳桿菌中后期產(chǎn)酸速率快，且生長不受體積分數(shù)4%乙醇影響。因此可以選擇植物乳桿菌、檸檬明串珠菌和干酪乳桿菌復配成生長穩(wěn)定，產(chǎn)酸速率快、能力強的混合發(fā)酵劑。

圖1 乙醇對4株乳酸菌產(chǎn)酸能力的影響Fig.1 Effects of ethanol on the acid production ability of 4 lactic acid bacteria

2.3 白酒結(jié)合耐乙醇混菌發(fā)酵劑對酸菜微生物及理化指標的影響

采用植物乳桿菌、檸檬明串珠菌和干酪乳桿菌混合接種發(fā)酵酸菜，單純植物乳桿菌發(fā)酵和自然發(fā)酵酸菜的菌落總數(shù)、可滴定酸含量和還原糖含量見圖2。

圖2 酸菜的菌落總數(shù)、可滴定酸和還原糖含量測定結(jié)果Fig.2 Determination results the total number of colonies,titratable acid and reducing sugar content of Suancai

通過比較發(fā)現(xiàn)，自然發(fā)酵的酸菜中包含最多的乳酸菌數(shù)為9.22 lg（CFU/mL），而三種菌混合發(fā)酵酸菜的乳酸菌數(shù)又略少于植物乳桿菌接種發(fā)酵的酸菜。這可能是由于外源乳酸菌的添加，尤其是檸檬明串珠菌和植物乳桿菌產(chǎn)酸快，在發(fā)酵初期使得發(fā)酵環(huán)境的pH急劇下降，因此白菜自身或環(huán)境中所夾帶的其他部分乳酸菌的生長因急劇的酸性環(huán)境變化而被抑制[18]。另一方面，韓宏嬌等[19]認為發(fā)酵后期由于營養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗，導致發(fā)酵液中乳酸菌生長所需的碳、氮源不足，因此乳酸菌數(shù)減少。雖然發(fā)酵劑選用的是耐乙醇的乳酸菌，但添加白酒發(fā)酵的酸菜中乳酸菌數(shù)仍有所下降，這可能是由于白酒中的其他物質(zhì)對乳酸菌的生長也有影響。此外，人工接種乳酸菌發(fā)酵酸菜的可滴定酸和還原糖含量均高于自然發(fā)酵的酸菜。由于接種快速產(chǎn)酸的乳酸菌后，乳酸菌代謝產(chǎn)生大量的乳酸、乙酸、丙酸等有機酸，快速增加了發(fā)酵液中可滴定酸的含量[20]。而接種乳酸菌發(fā)酵酸菜的還原糖含量較高，一方面由于大量的外源乳酸菌，對蔗糖具有高的利用率，而減少了對葡萄糖和果糖等還原糖的消耗，保留了部分還原糖[21]；另一方面，自然發(fā)酵酸菜中更多的微生物利用并消耗了還原糖，而人工接種發(fā)酵酸菜的乳酸菌活菌數(shù)少，因此代謝消耗的糖量減少，從而人工接種乳酸菌發(fā)酵酸菜的還原糖高于自然發(fā)酵的酸菜[22-23]。值得注意的是接種發(fā)酵的酸菜中，添加白酒的混菌發(fā)酵酸菜的可滴定酸含量比未添加白酒的混菌發(fā)酵酸菜降低4.02%，比單植物乳桿菌發(fā)酵的酸菜降低6.64%。成品過度酸化往往是發(fā)酵蔬菜工業(yè)生產(chǎn)中的一大難題[24]，而從結(jié)果上來看，白酒的添加，降低了乳酸菌發(fā)酵酸菜的酸度，這表明白酒的添加可以抑制乳酸菌發(fā)酵酸菜的過度酸化，使酸菜口感更加柔和。

2.4 白酒結(jié)合耐乙醇混菌發(fā)酵劑對酸菜風味及揮發(fā)性成分的影響

采用GC-MS對自然發(fā)酵酸菜、植物乳桿菌接種發(fā)酵酸菜、混菌接種發(fā)酵酸菜和添加白酒的混菌發(fā)酵酸菜的揮發(fā)性風味成分進行分析比較，結(jié)果見表3。

表3 不同發(fā)酵方式酸菜揮發(fā)性風味成分Table 3 Volatile components of Suancai under different fermentation modes

續(xù)表

續(xù)表

四種發(fā)酵方式酸菜的風味物質(zhì)及揮發(fā)性成分有明顯差異。自然發(fā)酵的酸菜共檢測出45種物質(zhì)，而接種植物乳桿菌和混菌發(fā)酵的酸菜檢測出的物質(zhì)均較少，分別為27種和30種。自然發(fā)酵酸菜的風味及揮發(fā)性物質(zhì)以醇為主（40.92%），其次是酸（19.09%）、氨基酸（13.08%）和碳氫化合物（8.68%）。接種植物乳桿菌和混菌發(fā)酵酸菜的風味及揮發(fā)性物質(zhì)中醇、酯和氨基酸的含量高于自然發(fā)酵，而碳氫化合物低于自然發(fā)酵酸菜。相比之下，添加白酒并接種混菌發(fā)酵的酸菜檢測出42種物質(zhì)。雖然醇類含量較低（27.34%），但酸、酯和氨基酸的含量較高，分別占總量的6.66%、25.99%和20.80%。含碳數(shù)較低的脂肪酸乙酯是酒類的主體成分，具有鮮花及果香[25]，尤其是己酸乙酯與丁酸乙酯是濃香型白酒的主要香味成分，而添加白酒不僅為酸菜增加了低碳脂肪酸的占比，還引入了獨有的己酸乙酯與丁酸乙酯，增加了酸菜的芳香氣味。與接種發(fā)酵的酸菜相比，白酒增加了酸菜中乙酸的占比。乙酸具有清爽的米醋香味，能夠增加酸菜的爽口度。然而，白酒的添加，導致了酸菜中酸類物質(zhì)種類的減少，與氨基酸含量的增加。這與可滴定酸降低的結(jié)果一致，也表明白酒可以促進酸類向氨基酸的轉(zhuǎn)化。此外，添加白酒的酸菜檢測出了自然發(fā)酵和接種發(fā)酵并未檢測出的酮類和含硫化合物。酮類物質(zhì)具有濃郁的香味，是酒類風味的重要組成[26]，具有香氣的調(diào)節(jié)作用。因此添加白酒接種發(fā)酵的酸菜中檢測到的新的風味物質(zhì)結(jié)構(gòu)能夠賦予酸菜獨特的風味特征，而較少種類與含量的醇、呈味酸以及較高含量的氨基酸又能為酸菜呈現(xiàn)新的滋味。

2.5 白酒結(jié)合耐乙醇混菌發(fā)酵劑對酸菜感官品質(zhì)的影響

酸菜感官品質(zhì)評價結(jié)果見圖3。從圖3A和圖3B中酸菜的感官評分結(jié)果可以看出，自然發(fā)酵的酸菜在感官品質(zhì)上優(yōu)于僅由乳酸菌接種發(fā)酵的酸菜，這一結(jié)果在其他相關(guān)研究中也得到認證[27]。與單植物乳桿菌發(fā)酵的酸菜相比，混合乳酸菌發(fā)酵的酸菜在顏色、香氣、味道和口感上均有優(yōu)勢。而添加了白酒并由混菌發(fā)酵劑發(fā)酵的酸菜在感官評分上明顯高于僅由乳酸菌接種發(fā)酵甚至是自然發(fā)酵的酸菜，尤其是在顏色、味道和口感上具有顯著優(yōu)勢。雖然在香氣品質(zhì)上稍遜于自然發(fā)酵，但也明顯好于僅由乳酸菌接種發(fā)酵的酸菜。

圖3 酸菜的感官品質(zhì)評價結(jié)果Fig.3 Sensory quality evaluation results of fermented suancai

由圖3C可知，添加白酒的接種發(fā)酵酸菜與自然發(fā)酵酸菜相比，酸味和鮮味略有提高。這與可滴定酸含量和風味物質(zhì)成分的測定結(jié)果一致，與自然發(fā)酵相比，添加白酒發(fā)酵的酸菜的酸類物質(zhì)和氨基酸占比增加，因此酸味和鮮味提升。此外，白酒結(jié)合混菌發(fā)酵可以降低酸菜苦味，尤其降低了苦和澀的后味，這與還原糖測定結(jié)果一致，添加白酒導致酸菜還原糖含量增加，因此降低了苦味。而苦澀味降低能有效提高品嘗的愉悅感。綜合主觀和客觀的感官評價結(jié)果，表明篩選的植物乳桿菌、干酪乳桿菌和檸檬明串珠菌混合作發(fā)酵劑在對改善人工接種單一乳酸菌發(fā)酵酸菜的感官品質(zhì)上具有有效作用，而白酒的添加對于人工接種乳酸菌發(fā)酵酸菜的品質(zhì)的進一步提升具有重要意義。

3 結(jié)論

本研究從7種發(fā)酵酸菜常用乳酸菌中篩選出3種耐乙醇型乳酸菌，分別為植物乳桿菌、干酪乳桿菌和檸檬明串珠菌，并復配成發(fā)酵劑，用于酸菜的發(fā)酵。通過對耐乙醇型復配發(fā)酵劑發(fā)酵的酸菜的乳酸菌數(shù)、可滴定酸含量和還原糖以及感官品質(zhì)進行分析，耐乙醇型復配發(fā)酵劑適用于酸菜的發(fā)酵，可以抑制酸菜的后酸化，同時形成以酯、酮、含硫化合物和氨基酸為主的新型風味結(jié)構(gòu)，改善人工接種酸菜的感官品質(zhì)并顯著提升酸菜的鮮味。該結(jié)果為進一步研究人工接種乳酸菌發(fā)酵酸菜的風味形成機理提供理論基礎(chǔ)，同時，對乳酸菌發(fā)酵酸菜的品質(zhì)提升和新產(chǎn)品創(chuàng)制提供思路。