包秀萍，高美玲,2，郭 宇，徐 銘，段雅如，安伯函，劉秀杰，劉繼秀，高 越

(1 齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2 黑龍江省抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3 齊齊哈爾市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

西瓜(Citrulluslanatus(Thunb.) Matsum. et Nakai)是重要的葫蘆科作物，在全世界范圍內(nèi)廣泛種植，我國(guó)是世界上最大的西瓜生產(chǎn)國(guó)?，F(xiàn)有西瓜品種大多屬于長(zhǎng)側(cè)枝品種，栽培過(guò)程中需要消耗大量的勞動(dòng)力去除側(cè)枝，因此短側(cè)枝或少側(cè)枝西瓜品種培育可以減少人工投入，對(duì)實(shí)現(xiàn)西瓜輕簡(jiǎn)化和機(jī)械化栽培具有重要意義。

分枝受基因、激素、自然環(huán)境等因素的影響[1-4]。不同分枝類型植物具有不同的利用價(jià)值，前人發(fā)現(xiàn)并研究了大量植物分枝相關(guān)的突變體，如番茄LS突變體導(dǎo)致腋生分生組織無(wú)法產(chǎn)生[5]；擬南芥LAS突變體會(huì)導(dǎo)致植株在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段無(wú)法形成側(cè)枝[6]；黃瓜無(wú)側(cè)枝基因nlb被定位到1號(hào)染色體[7]；調(diào)控甜瓜側(cè)枝長(zhǎng)度性狀的基因被定位在185 kb候選區(qū)段內(nèi)[8]；編碼TERMINALFLOWER 1蛋白的Clbl基因調(diào)控西瓜的無(wú)分枝性狀[9]。分枝是植物株型的重要組成部分，不同分枝類型植物對(duì)光能的吸收利用能力有所不用。李瑞東等[10]研究發(fā)現(xiàn)，大豆少分枝品種在密植時(shí)光合性能更加穩(wěn)定；水稻矮稈多分蘗突變體因其較多的分蘗導(dǎo)致光合特性受到影響[11]；桑樹(shù)幼苗分枝數(shù)增加可能造成葉片對(duì)光能的競(jìng)爭(zhēng)增大，從而導(dǎo)致凈光合速率下降[12]。在西瓜的光合特性方面也開(kāi)展了一些研究。徐坤等[13]通過(guò)對(duì)不同類型西瓜光合特性研究表明，西瓜的光合作用隨著植株生長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)，并且與坐果節(jié)位鄰近的葉片光合作用最強(qiáng)。Watanabe等[14]研究發(fā)現(xiàn)，垂直生長(zhǎng)西瓜果實(shí)小于水平生長(zhǎng)的西瓜果實(shí)，這是由于隨著葉片位置的降低西瓜垂直生長(zhǎng)葉片的光合速率下降。安力等[15]對(duì)西瓜和旱砂地籽瓜光合特性的研究表明，西瓜的光合能力優(yōu)于籽瓜。西瓜后綠突變體葉片的光合能力在葉色由黃轉(zhuǎn)綠過(guò)程中得到恢復(fù)[16]。饒貴珍等[17]研究發(fā)現(xiàn)，與栽培西瓜相比，野生西瓜是高光效植物，且晴天時(shí)光合午休現(xiàn)象相對(duì)較弱，午休不利于作物的產(chǎn)量。但關(guān)于西瓜分枝情況與其光合特性關(guān)系的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。齊齊哈爾大學(xué)西甜瓜育種課題組前期在田間首次發(fā)現(xiàn)了一個(gè)西瓜短側(cè)枝突變體，并將其命名為slb。本研究以短側(cè)枝突變體slb和正常長(zhǎng)側(cè)枝GWAS-38的功能葉為試驗(yàn)材料，對(duì)2個(gè)品系西瓜的光合色素含量、光合參數(shù)、熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)、氣孔密度、長(zhǎng)度和開(kāi)度進(jìn)行測(cè)定并分析，以期了解短側(cè)枝突變體的光合特性，解析短側(cè)枝突變體的群體結(jié)構(gòu)和光能截獲特性，為西瓜短側(cè)枝突變體的利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

西瓜短側(cè)枝突變體slb和正常長(zhǎng)側(cè)枝GWAS-38，其中slb是齊齊哈爾大學(xué)園藝植物遺傳研究室在田間偶然發(fā)現(xiàn)的一份珍貴短側(cè)枝突變體，但無(wú)法獲得其野生型，為了研究slb的遺傳規(guī)律及其調(diào)控基因，實(shí)驗(yàn)室前期已用西瓜短側(cè)枝突變體slb和正常長(zhǎng)側(cè)枝品系GWAS-38配制了遺傳群體，進(jìn)行了遺傳分析，并定位到候選基因。因此，本研究用雜交群體的母本GWAS-38作為slb的“野生型”比較它們的光合特性。短側(cè)枝突變體slb在10節(jié)之內(nèi)平均側(cè)枝數(shù)為3.3個(gè)，平均長(zhǎng)度為5.14 cm；正常長(zhǎng)側(cè)枝GWAS-38平均側(cè)枝數(shù)為7.2個(gè)，平均長(zhǎng)度為21.59 cm(圖1)。西瓜短側(cè)枝突變體slb和正常長(zhǎng)側(cè)枝GWAS-38的表型性狀詳見(jiàn)表1。短側(cè)枝突變體slb的葉柄長(zhǎng)度、果柄長(zhǎng)度、雄花花柄長(zhǎng)度、節(jié)間長(zhǎng)度和下胚軸長(zhǎng)度分別是長(zhǎng)側(cè)枝品系的2.6,1.6,3.3,1.3和1.3倍。

表1 西瓜短側(cè)枝突變體slb和正常長(zhǎng)側(cè)枝GWAS-38的表型性狀Table 1 Phenotype of short lateral branching mutant slb and normal long lateral branching line GWAS-38

1.2 試驗(yàn)處理

選取slb和GWAS-38外觀飽滿種子各100粒，溫湯浸種，烘箱中催芽，于2021年4月26日播種于育苗穴中，5月25日slb和GWAS-38各定植72株于齊齊哈爾市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心曙光村實(shí)驗(yàn)基地大棚中，地膜覆蓋，滴灌，株行距為40 cm×60 cm，單蔓整枝，留第2～3個(gè)瓜自交授粉，坐果期(播種后58 d)選取長(zhǎng)勢(shì)良好植株第10～15節(jié)功能葉，進(jìn)行光合色素、光合參數(shù)、葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定和功能葉氣孔分布觀察。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 光合色素含量測(cè)定 采用乙醇提取法[18]，取功能葉各10片，分別剪碎、混勻，各稱取0.2 g葉片，放入裝有10 mL體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇中避光浸泡，期間反復(fù)振蕩混勻，直至葉片發(fā)白，每組重復(fù)3次。然后使用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)量663，645和470 nm波長(zhǎng)下的吸光度值，以體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇為對(duì)照，計(jì)算葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)、總?cè)~綠素(Chl)和類胡蘿卜素(Caro)的含量。計(jì)算公式如下：

葉綠素a含量(mg/g)=(12.7A663-2.69A645)×V/(1 000×W)；

葉綠素b含量(mg/g)=(22.9A645-4.68A663)×V/(1 000×W)；

葉綠素總含量(mg/g)=Chl a+ Chl b；

類胡蘿卜素含量(mg/g)=(1 000A470-3.27 Chl a-104Chl b)×V/(229×1 000×W)。

式中：A663、A645、A470分別表示在波長(zhǎng)為663，645，470 nm下的吸光度值，V代表提取液體積，W代表葉片鮮質(zhì)量。

1.3.2 光合參數(shù)測(cè)定 選擇晴朗天氣，在上午用Li-6400便攜式光合儀，在光強(qiáng)1 000 μmol/(m2·s)、CO2濃度400 μmol/(m2·s)測(cè)定凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)，測(cè)定時(shí)避開(kāi)主葉脈，每個(gè)品系測(cè)定7株，取平均值。

1.3.3 熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定 將選好的功能葉用記號(hào)筆標(biāo)記，用大小適宜的錫箔紙包好，對(duì)其進(jìn)行30 min的暗處理后使用Li-6400便攜式光合儀測(cè)定葉片的初始熒光(F0)、最大熒光(Fm)及最大光化學(xué)效率(Fv/Fm，F(xiàn)v=Fm-F0)。隨后摘掉錫箔紙，進(jìn)行30 min以上的光活化[19-21]，再測(cè)定其光下最小熒光(F0′)、最大熒光(Fm′)、實(shí)際光化學(xué)效率(Fv′/Fm′，F(xiàn)v′=Fm′-F0′)、實(shí)際光化學(xué)量子效率(ΦPSⅡ)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)和電子傳遞效率(ETR)[22]。

1.3.4 功能葉氣孔分布觀察 取slb和GWAS-38坐果期功能葉，將葉片平鋪于A4紙上，用刀片在葉片中間避開(kāi)主葉脈部位取大小為1 cm×1 cm的薄片[23]，將薄片轉(zhuǎn)移至滴有水的載玻片上，用吸水紙吸去多余水分，用XSP-8C顯微鏡在10倍鏡下對(duì)氣孔密度、氣孔長(zhǎng)度(保衛(wèi)細(xì)胞的長(zhǎng)度)、氣孔開(kāi)度(氣孔孔徑最寬處)進(jìn)行觀察記錄。對(duì)氣孔長(zhǎng)度及氣孔開(kāi)度進(jìn)行測(cè)量時(shí)，每個(gè)臨時(shí)裝片隨機(jī)選取3個(gè)視野，每個(gè)視野隨機(jī)選取3個(gè)氣孔，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

運(yùn)用Excel對(duì)所有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，GraphPad 8.0.2進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜短側(cè)枝突變體slb功能葉光合色素的變化

由表2可以看出，與正常長(zhǎng)側(cè)枝GWAS-38相比，西瓜短側(cè)枝突變體slb功能葉的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量、葉綠素a/葉綠素b、類胡蘿卜素/總?cè)~綠素差異均不顯著，而類胡蘿卜素含量顯著降低了9.52%。

表2 西瓜短側(cè)枝突變體slb與正常長(zhǎng)側(cè)枝GWAS-38功能葉光合色素含量的比較Table 2 Comparison of photosynthetic pigment content of short lateral branching mutant slb and normal long lateral branching GWAS-38 functional leaves

2.2 西瓜短側(cè)枝突變體slb功能葉光合參數(shù)的變化

從表3可以看出，西瓜短側(cè)枝突變體slb功能葉的Pn、Gs、Ci和Tr較正常長(zhǎng)側(cè)枝GWAS-38分別極顯著降低了46.0%，75.0%，18.8%和47.0%。

表3 西瓜短側(cè)枝突變體slb與正常長(zhǎng)側(cè)枝GWAS-38功能葉光合參數(shù)的比較Table 3 Comparison of photosynthetic parameters of short lateral branching mutant slb and normal long lateral branching GWAS-38 functional leaves

2.3 西瓜短側(cè)枝突變體slb功能葉熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化

如表4所示，西瓜短側(cè)枝突變體slb功能葉的初始熒光極顯著大于正常長(zhǎng)側(cè)枝品系GWAS-38，而其最大熒光、最大光化學(xué)效率、實(shí)際光化學(xué)效率、實(shí)際光化學(xué)量子效率、光化學(xué)淬滅系數(shù)和電子傳遞效率與正常長(zhǎng)側(cè)枝品系GWAS-38之間均無(wú)顯著差異。

表4 西瓜短側(cè)枝突變體slb與正常長(zhǎng)側(cè)枝GWAS-38功能葉熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較Table 4 Comparison of fluorescence kinetic parameters of short lateral branching mutant slb and normal long lateral branching GWAS-38 functional leaves

2.4 西瓜短側(cè)枝突變體slb葉片表皮氣孔分布的變化

如圖2所示，在相同視野下，西瓜短側(cè)枝突變體slb坐果期葉片氣孔數(shù)量明顯多于正常長(zhǎng)側(cè)枝品系GWAS-38。由圖3可以看出，西瓜短側(cè)枝突變體slb氣孔密度為269.33個(gè)/mm2，極顯著大于正常長(zhǎng)側(cè)枝GWAS-38的氣孔密度112.33個(gè)/mm2;短側(cè)枝突變體slb的氣孔長(zhǎng)度和氣孔開(kāi)度分別為20.31 和5.27 μm，極顯著小于正常長(zhǎng)側(cè)枝GWAS-38的29.90 和8.84 μm。

3 討 論

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的重要介質(zhì)，有吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化光能的作用[24-25]。葉綠素a參與植物對(duì)光能的吸收及轉(zhuǎn)化，葉綠素b參與植物對(duì)光能的捕捉和傳遞[26]。類胡蘿卜素同樣是植物光合色素的重要部分，可以捕獲光能以及抵御光的破壞[27]。植物與外界進(jìn)行物質(zhì)交換時(shí)必須通過(guò)氣孔，如果Pn、Gs和Ci值均下降，則說(shuō)明植物的光合作用受到氣孔限制[28-31]，此外，植物的光合作用能力還與葉綠素含量有關(guān)[32]。本研究結(jié)果表明，slb功能葉的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量均與GWAS-38差異不顯著，而slb的光合參數(shù)均極顯著小于GWAS-38，slb的氣孔密度增加，氣孔長(zhǎng)度和氣孔開(kāi)度均小于GWAS-38，由此推測(cè)slb功能葉Pn值的下降可能是由于葉片Gs下降導(dǎo)致進(jìn)入氣孔的CO2變少。Ci值大小與葉片氣孔開(kāi)度、空氣中CO2濃度等因素有關(guān)[33]。由于slb與GWAS-38生長(zhǎng)環(huán)境相同，因此推測(cè)Ci值的變化是受到Gs的影響，這與劉落魚(yú)等[34]的研究結(jié)果一致。Tr值的下降可能是由氣孔開(kāi)度減小，植物體內(nèi)水分和氣體向外散失困難造成的。由此推斷，氣孔限制是導(dǎo)致slb光合參數(shù)極顯著低于GWAS-38的重要因素。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)不僅與植物光合作用緊密相關(guān)，還能夠反映光系統(tǒng)Ⅱ?qū)饽艿睦们闆r[32]。本研究中slb與GWAS-38功能葉的葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、Fv′/Fm′、ΦPSⅡ、qP和ETR值均無(wú)顯著差異，說(shuō)明slb與GWAS-38的光能轉(zhuǎn)化能力、轉(zhuǎn)化效率、電子傳遞活性、電子傳遞效率間均無(wú)顯著差異。本研究中slb的F0值極顯著高于GWAS-38，F(xiàn)0值與葉綠素含量有關(guān)[35]，但slb與GWAS-38間葉綠素含量無(wú)顯著差異，推測(cè)F0的升高可能與葉綠素含量無(wú)關(guān)；光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心受到破壞或可逆失活會(huì)使F0值升高[21]，同時(shí)產(chǎn)生光抑制，但slb與GWAS-38的葉綠素?zé)晒鈪?shù)除F0值升高外均無(wú)顯著差異，所以，西瓜短側(cè)枝突變體slb的F0值升高到底是何原因造成的，有待進(jìn)一步研究。