張學(xué)飛，陳建雄，劉耀霞，姚 強

(青海大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)院 青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西寧作物有害生物科學(xué)觀測實驗站，青海 西寧 810016)

由條形柄銹菌小麥?；?Pucciniastriiformisf. sp.tritici)引起的小麥條銹病是我國小麥主要病害之一，嚴(yán)重危害我國糧食安全。小麥條銹病是一種氣傳病害，小麥可隨氣流進行遠距離傳播[1]。該病害流行時，小麥產(chǎn)量損失可達到10%～70%，嚴(yán)重時導(dǎo)致絕收[2-3]。與農(nóng)業(yè)栽培改進、化學(xué)防治等措施相比，培育和推廣抗性品種是更經(jīng)濟、有效和環(huán)保的防治措施[4-5]。目前生產(chǎn)上應(yīng)用最廣泛的是高抗及免疫的抗條銹品種，這就增加了小麥條銹菌對品種的選擇壓力。平均而言，抗病品種在應(yīng)用3～5年就失去了抗性，從而引發(fā)條銹病的大流行。迄今，中國有34個條銹菌生理小種(CYR1～CYR34)以及多個致病類群被鑒定及正式命名。

建國后的8次小麥品種更替都是由于小麥條銹菌流行和變異引起的[6-8]。2009年發(fā)現(xiàn)新菌系貴農(nóng)22(G22-9)致病類群，對抗病基因Yr24/Yr26表現(xiàn)毒性，導(dǎo)致川麥系、小偃系、蘭天系、綿農(nóng)系、洮字系等在四川、甘肅種植的抗病品種喪失抗性[6,9]。此后，G22-9迅速發(fā)展成為優(yōu)勢小種，2016年正式命名為條中34號[6]。Yr5的親和小種于20世紀(jì)在澳大利亞和印度均已發(fā)現(xiàn)，且最新報道，在甘肅天水也出現(xiàn)了對Yr5基因產(chǎn)生致病性的小種[10]。新小種出現(xiàn)的部分原因是抗病品種的不合理分布以及抗病基因的遺傳分化。因此，為了實現(xiàn)小麥品種抗病性的持續(xù)性利用，合理利用抗病品種和配置抗病基因是基本措施。

青海省是我國重要的小麥條銹菌越夏菌源基地，種植的小麥品種的抗條銹性與越夏菌源相關(guān)[11]。目前，雖然已對青海省部分小麥品種進行了抗條銹性評價，但評價不夠全面，對合理利用小麥抗病品種非常不利。鑒于此，本研究對青海主栽小麥品種及擬報審的小麥后備品系共44份資源，進行了抗病性鑒定以及抗條銹基因檢測，明確供試材料的抗條銹性及抗病基因分布，為綜合利用抗條銹基因種質(zhì)資源、開發(fā)培育新的抗病品種以及品種合理布局提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

供試小麥材料及小麥條銹菌：供試小麥材料44份，包括青海省目前種植的主要小麥品種9份和后備品系(2020年和2021年進入青海省擬報審小麥品系)35份，均由青海省農(nóng)作物種子站提供。小麥條銹病感病品種銘賢169和Taichuang 29，已知抗條銹病基因單基因系品種Avocet S/Yr5 NIL、Avocet S/Yr9 NIL、Avocet S/Yr10 NIL、Avocet S/Yr15 NIL、Avocet S/Yr24 NIL、Avocet S/Yr44NIL，均由青海省農(nóng)林科學(xué)院植物保護研究所提供。小麥條銹菌生理小種CYR31、CYR32、CYR33、CYR34，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院詹剛明副教授提供。

試劑及儀器：2×Taq PCR Master Mix試劑，購于上海生工生物工程有限公司；DL2000 Marker、DL500 Marker，購于寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；離心機(Monad MiniSpeed 3300)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；電泳儀(PowerPac Universal)，愛普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)貿(mào)易(上海)有限公司；細胞組織破碎儀(BBx24B)，凱杰企業(yè)管理(上海)有限公司；PCR儀(ABI 7500 )，美國BIO-RAD公司；微量核酸蛋白測定儀(NanoDrop OneC)，美國Thermo Scientific公司；凝膠成像儀(Champ Gel 6000)，愛普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)貿(mào)易(上海)有限公司。小麥抗條銹病基因Yr5[12]、Yr9[13]、Yr10[14]、Yr15[12]、Yr24[15]和Yr44[16]的側(cè)翼標(biāo)記引物信息見表1，引物由北京奧科鼎盛科技有限公司合成。

表1 抗條銹病基因Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr24和Yr44的連鎖分子標(biāo)記序列Table 1 Sequences of flanking markers linked to strip rust resistance genes of Yr5,Yr9,Yr10,Yr15,Yr24 and Yr44

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥全生育期抗條銹性評價 小麥全生育期抗條銹性鑒定在青海省農(nóng)林科學(xué)院植物保護研究所溫室進行。將供試材料播于方形培養(yǎng)盆，每個培養(yǎng)盆種一個品種(系)10～15粒種子，每個品種(系)設(shè)3次重復(fù)。待第一片葉子完全展開時，將小種CYR31、CYR32、CYR33、CYR34的夏孢子分別與滑石粉按體積比1∶20混合，用抖粉法進行接種，接種后置于10 ℃接種間黑暗保濕24 h，之后放在人工培養(yǎng)室，溫度控制在晝15～18 ℃，夜11～14 ℃，每天光照12～14 h。待感病對照銘賢169充分發(fā)病后，按照0～9級反應(yīng)型標(biāo)準(zhǔn)(表2)調(diào)查，0～6級反應(yīng)型為抗病，7～9級反應(yīng)型為感病[17]。

表2 小麥條銹病全生育期反應(yīng)型分級及鑒定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Classification and identification standard of reactive type of wheat stripe rust during whole growth period

表2(續(xù)) Continued table 2

1.2.2 小麥成株期抗條銹性評價 于2021年3月下旬在西寧市大通縣塔爾鎮(zhèn)王莊村進行。對供試小麥材料按照編號播種，每份材料播種20～25粒，種植2行，行長100 cm，行距25 cm，每份材料設(shè)3次重復(fù)。在實驗田四周分別種植3行感病品種Taichuang 29作為誘發(fā)行。7月下旬當(dāng)對照Taichuang 29發(fā)病嚴(yán)重度達到80%時，對供試材料發(fā)病情況進行調(diào)查。參照農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2953-2016《小麥區(qū)域試驗品種抗條銹病鑒定技術(shù)規(guī)程》記錄反應(yīng)型、嚴(yán)重度和普遍率。其中反應(yīng)型根據(jù)小麥過敏性壞死及孢子堆產(chǎn)生情況分為6級標(biāo)準(zhǔn)，依次為:0級(免疫)、0；級(近免疫)、1級(高抗)、2級(中抗)、3級 (中感)、4級(高感)；嚴(yán)重度指病葉上夏孢子堆面積占葉片總面積的百分率，按9級標(biāo)準(zhǔn)劃分：依次為0(葉片未發(fā)病)，t(微量，發(fā)病但嚴(yán)重度低于1%)，5%，10%，20%，40%，60%，80%和100%；普遍率指發(fā)病葉片數(shù)占調(diào)查總?cè)~片數(shù)的百分率，用來表示發(fā)病程度，按13級標(biāo)準(zhǔn)劃分，依次為0，t(1%以下)，5%，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%和100%。

1.2.3 小麥基因組DNA提取與抗病基因分子標(biāo)記檢測 采集供試小麥材料的葉片，參考Chen等[17]的CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法提取小麥基因組DNA，略作改良。用Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr24和Yr44等抗條銹病基因的側(cè)翼標(biāo)記對供試的小麥材料進行分子檢測。PCR反應(yīng)體系25 μL：Ex Taq溶液12.5 μL，10 μmol/L正反向引物各0.5 μL，100 ng/μL模板DNA 0. 5 μL，ddH2O 11 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性60 s，退火溫度 (見表1) 下退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存擴增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物在2.5%瓊脂糖凝膠120 V下電泳30 min后，用凝膠成像儀(Champ Gel 6000)觀察擴增條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 44份青海小麥品種(系)全生育期抗條銹性評價

全生育期抗條銹性鑒定結(jié)果(表3)表明，供試的44份小麥材料中，青麥1號、青春533和青春38等31份(70.4%)材料對CYR31表現(xiàn)抗病，青麥1號、青春533和青春38等35份(79.5%)材料對CYR32表現(xiàn)抗病，青麥1號、青春38、YZ282等35份(79.5%)材料對CYR33表現(xiàn)抗病，互麥13、云繁105、稷麥8號等35份(79.5%)材料對CYR34表現(xiàn)抗?。?1份(70.4%)材料對CYR31和CYR32均表現(xiàn)抗性，27份(61.4%)材料對CYR31和CYR33均表現(xiàn)抗性，29份(65.9%)材料對CYR31和CYR34均表現(xiàn)抗性，31份(70.4%)材料對CYR32和CYR33均表現(xiàn)抗性，31份(70.4%)材料對CYR32和CYR34均表現(xiàn)抗性，31份(70.4%)材料對CYR33和CYR34均表現(xiàn)抗性；26份(59.1%)材料對CYR31、CYR32和CYR33均表現(xiàn)抗性，28份(63.4%)材料對CYR31、CYR32和CYR34均表現(xiàn)抗性，27份(61.4%)材料對CYR31、CYR33和CYR34均表現(xiàn)抗性，28份(63.4%)材料對CYR32、CYR33和CYR34均表現(xiàn)抗性；15-34-3、互紫麥1號、GY363等25份(56.8%)材料對CYR31、CYR32、CYR33和CYR34均表現(xiàn)抗性。

2.2 44份青海小麥品種(系)成株期抗條銹性鑒定

小麥品種成株期抗條銹性鑒定結(jié)果(表3)顯示，青春533、青春39和稷麥8號等20份材料表現(xiàn)成株抗條銹性，占供試材料的45.4%。其中GY363和GY856表現(xiàn)免疫，青春533、15-34-3和HYNM19-2等11份材料表現(xiàn)高抗，青春38、青春39和稷麥8號等7份材料表現(xiàn)中抗，分別占供試材料總數(shù)的4.5%，25.0%，15.9%，其余的24份材料均表現(xiàn)為感病。

表3 44份青海小麥品種(系)全生育期和成株期抗條銹性鑒定結(jié)果Table 3 Identification of resistance to stripe rust of 44 Qinghai wheat varieties (lines) during whole growth period and adult plant period

2.3 44份青海小麥品種(系)抗條繡病基因分子檢測

對44份青海小麥品種(系)進行Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr24、Yr44的分子側(cè)翼標(biāo)記基因檢測，結(jié)果(表4)表明15-34-3、HYNM19-2、GY363等5份品種可能攜帶Yr5基因，占供試材料的11.3%；云繁105、稷麥8號和15-34-3等11份材料可能攜帶Yr9基因，占供試材料的25.0%；青春533、青春38、40-12-86等4份材料可能攜帶Yr10基因，占供試材料的6.8%；互紫麥1號、YGW-46、GY363等5份材料可能攜帶Yr15基因，占供試材料的11.3%；青麥5號、稷麥8號及15-34-3等15份材料可能攜帶Yr24基因，占供試材料的34.1%；寧春51、15-34-3、19399-11等8份材料可能攜帶Yr44基因，占供試材料的18.1%。

表4 44份青海小麥品種(系)抗條銹病基因檢測結(jié)果Table 4 Detection of stripe rust resistance genes in 44 Qinghai wheat varieties (lines)

由表4還可知， 8份材料可能攜帶有2個抗性基因，其中08-10-8可能攜帶Yr5和Yr24基因，13-16可能攜帶Yr9和Yr10基因，稷麥8號和2018153可能攜帶Yr9和Yr24基因，YZ813可能攜帶Yr9和Yr44基因，互紫麥1號可能攜帶Yr15和Yr24基因，19399-11和04-1可能攜帶Yr24和Yr44基因；2份材料可能攜帶3個抗性基因，其中Hxhm18-3可能攜帶Yr5、Yr24和Yr44基因，40-12-86可能攜帶Yr10、Yr24和Yr44基因；2份材料可能攜帶有4個抗性基因，其中GY363可能攜帶Yr5、Yr9、Yr15和Yr24基因，15-34-3可能攜帶Yr5、Yr9、Yr24和Yr44基因；航遠L621、HL679和青麥1號3個材料未檢測到上述6種抗病基因。

青海省部分供試小麥主栽與后備品種抗條銹病基因分子檢測結(jié)果如圖1所示。

3 討 論

青海省位于我國青藏高原與西北內(nèi)陸接壤地區(qū)，海拔較高，地形地貌復(fù)雜多樣，不同區(qū)域氣候條件差異大，小麥種植垂直分布，具有獨特的條銹病流行環(huán)境。冬、春麥區(qū)存在重疊，為小麥條銹菌周年循環(huán)提供了良好的條件，成為繼甘肅隴南之后的又一小麥周年循環(huán)區(qū)[18]。準(zhǔn)確把握青海省種質(zhì)資源的抗病性以及抗性基因的分布，對遏制小麥條銹菌流行具有重要作用。

青海東部作為我國條銹菌越夏易變區(qū)，條銹菌傳播與秋季自生苗生長相銜接，自生苗發(fā)病情況直接決定了冬前菌源量。姚強等[11]對青海東部麥區(qū)小麥條銹菌越冬條件進行初探，結(jié)果表明冬前菌源量是影響小麥條銹菌越冬的首要因素。因此全生育期抗病性的利用對青海小麥條銹菌防控有重要意義。本研究對44份來自青海的小麥種質(zhì)資源進行全生育期及成株期抗病性鑒定，結(jié)果表明青麥1號、青春39和青麥5號等25份材料可能具有全生育期抗病性，其抗性遺傳資源值得進一步研究。

小麥生產(chǎn)品種要有廣泛而穩(wěn)定的抗病遺傳基礎(chǔ)，抗病育種是一種有效的手段，抗病基因的組合可顯著提高抗病水平，抗病利用周期更加持久。Yr5基因來源于六倍體小麥斯卑爾脫，國內(nèi)目前已經(jīng)出現(xiàn)對其致病的新菌系[11]；來源于土耳其普通小麥P1 178383的Yr10基因已對致病小種CYR34喪失抗性[19]，因此含有單個抗病基因的小麥品種面對流行小種有很大的選擇壓力。黃苗苗等[20]對223份小麥農(nóng)家品種抗病性鑒定結(jié)果顯示，白麥和六十黃同時攜帶有抗病基因Yr5、Yr15、Yr18和Yr26，其中白麥連續(xù)兩年表現(xiàn)高抗。本研究發(fā)現(xiàn)，有8份供試材料可能攜帶有2個抗病性基因, 其中08-10-8可能攜帶Yr5和Yr24基因，13-16可能攜帶Yr9和Yr10基因，稷麥8號和2018153可能攜帶Yr9和Yr24基因，YZ813可能攜帶Yr9和Yr44基因，互紫麥1號可能攜帶Yr15和Yr24基因，19399-11和04-1可能攜帶Yr24和Yr44基因；有2份材料可能攜帶3個抗性基因，其中Hxhm18-3可能攜帶Yr5、Yr24和Yr44基因，40-12-86可能攜帶Yr10、Yr24和Yr44基因；2份材料可能攜帶有4個抗性基因，其中GY363可能攜帶Yr5、Yr9、Yr15和Yr24基因，15-34-3可能攜帶Yr5、Yr9、Yr24和Yr44基因。Hxhm18-3、40-12-86、15-34-3和GY363 4個品種中，除了40-12-86田間表現(xiàn)中感外，其余均表現(xiàn)高抗，需進一步研究和利用。李峰奇等[21]對14份抗CYR32的小麥農(nóng)家品種進行抗病基因檢測，發(fā)現(xiàn)有3份小麥品種含有未知的抗條銹病基因。王吐虹等[22]在40份小麥農(nóng)家品種中發(fā)現(xiàn)有19份品種可能攜帶有未知的抗病基因，這表明小麥農(nóng)家品種含有較豐富的遺傳抗性基因資源，可作為抗病資源用于育種。本研究中航遠L621未檢測到所檢測的6個抗病基因，但其在田間成株期表現(xiàn)高抗，推測可能攜帶有除所檢測的6個抗病基因之外的其他已知或新的抗條銹病基因，有待進一步研究。

Yr9抗病基因來源于小麥-黑麥1BL/1RS易位系[23]，該易位系同時還攜帶有對葉銹、稈銹和白粉病的抗病基因Lr26、Sr31和Pm8，在生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛[24]。張小娟等[25]對95份青海省小麥種質(zhì)資源進行抗病基因分子檢測，結(jié)果顯示Yr9的檢出率為17%；袁飛敏等[26]對青藏高原197份小麥品種(系)及種質(zhì)資源進行抗病基因分子檢測，結(jié)果顯示含Yr9基因的品種占總數(shù)的16.7%；王欣等[27]對青海省育成和引進的137份小麥品種進行抗病基因分子檢測，結(jié)果表明Yr9的檢出率為16.1%，高于大多數(shù)其他檢測抗病基因。本研究中含有Yr9基因的小麥品種有11份，占總數(shù)的25.0%，云繁105、YZ215、15-44-3和YZ361 4份品種只攜帶有Yr9，其中云繁105、YZ215和YZ361在成株期表現(xiàn)高感，所以對于含有Yr9基因的小麥品種在今后的育種中要減少使用。

本研究對青海省44份主栽與后備小麥種質(zhì)資源進行抗病性評價和抗病基因分布情況分析，發(fā)現(xiàn)全生育期抗條銹病材料25份，總體抗條銹性水平較高。這與趙旭陽等[28]對青藏春冬麥區(qū)93份地方小麥品種抗病性評價結(jié)果相差較大，可能是本研究所用小麥品種大部分為近年青海省擬選用的后備品系。鑒于此，為了提高青海省小麥的抗病性水平，要進一步加大抗病小麥種質(zhì)資源的推廣力度和利用。