郭春暉，王蕊蕊，馬洪軒，彭 欣，王瀚棠，周 靜，丁芷柔，王 雪，楊振德

(1 廣西大學 林學院 廣西高校林業(yè)科學與工程重點實驗室，廣西 南寧 530004；2 廣西國有高峰林場，廣西 南寧 530000)

桉樹枝癭姬小蜂(LeptocybeinvasaFisher & LaSalle)屬膜翅目(Hymenoptera)小蜂總科(Chalcidoidea)姬小蜂科(Eulophidae)，是一種嚴重危害多種桉樹的入侵性致癭害蟲[1-3]。桉樹枝癭姬小蜂取食桉樹嫩葉汁液，并產卵在桉樹的嫩枝及葉柄處危害桉樹生長，嚴重時可導致桉樹死亡[1-3]。桉樹枝癭姬小蜂起源于澳大利亞，于2000年首次發(fā)現(xiàn)于中東和地中海地區(qū)，隨后在亞洲、歐洲、非洲、大洋洲和美洲等45個國家和地區(qū)相繼報道該害蟲[1-3]。隨著氣候的不斷變暖以及人類活動的加劇，桉樹枝癭姬小蜂還有繼續(xù)擴散的趨勢[1-6]。在中國，桉樹枝癭姬小蜂首次發(fā)現(xiàn)于中越交界處的廣西壯族自治區(qū)東興市，隨后該蟲迅速擴散入侵到包括廣西，海南，臺灣，廣東，福建，江西，四川，云南和湖南等多個地區(qū)，造成了巨大的經(jīng)濟損失[5,7-13]。目前，關于桉樹枝癭姬小蜂體內的微生物已經(jīng)有了一些研究，如Guo等[14]研究發(fā)現(xiàn)，不同性別桉樹枝癭姬小蜂體內細菌群落結構不同，立克次氏體(Rickettsia)為雌蟲的優(yōu)勢菌；Nugnes等[15]研究發(fā)現(xiàn)，桉樹枝癭姬小蜂體內存在兩個不同種的立克次氏體，主要位于雌蟲卵巢處，并認為與桉樹枝癭姬小蜂的繁殖有關；王蕊蕊等[12-13]利用傳統(tǒng)分離方法發(fā)現(xiàn)，桉樹枝癭姬小蜂體內的細菌會受到季節(jié)的影響，夏季可以分離出更多的細菌。此外，桉樹枝癭姬小蜂體內的細菌還能夠降解桉樹的次生代謝物質，有助于其順利入侵定殖[16]。

昆蟲體內包含大量的微生物，包括真菌、細菌和病毒等[17-19]。在長期協(xié)同進化過程中，許多微生物與宿主昆蟲形成密切關系，并對宿主的繁殖、生存、群落相互作用、以及抵御捕食性和寄生性天敵的能力產生了巨大影響[20-23]。鑒于微生物的重要功能，昆蟲與其體內微生物之間的關系成為當今的研究熱點之一。外界環(huán)境中的微生物能夠隨著食物進入昆蟲體內，比如中華按蚊(Anophelessinensis)體內的細菌主要來源于生存的水體環(huán)境[24]；取食相同食物的舞毒蛾(Lymantriadispar)體內細菌結構具有高度的相似性，而取食不同食物時其體內細菌群落組成就會明顯不同[25]。

為此，本研究利用高通量測序技術，對寄主桉樹、桉樹枝癭姬小蜂及其寄生蜂孟氏胯姬小蜂體內的細菌進行研究，分析其內生細菌的多樣性和群落構成，并比較三者體內細菌組成的相似性，旨在為后續(xù)深入研究桉樹枝癭姬小蜂、寄主桉樹及其天敵孟氏胯姬小蜂三級營養(yǎng)關系，以及其體內細菌的傳遞模式、協(xié)同進化關系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

桉樹葉柄和主脈、無羽化孔蟲癭組織、桉樹枝癭姬小蜂幼蟲和雌成蟲(南寧種群)，均采自廣西大學林學院校內教學實踐基地(22°51′ N，108°17′ E)種植的巨園桉DH201-2(Eucalyptusgrandis×E.tereticornis)；桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲(四川種群)和天敵孟氏胯姬小蜂成蟲，采自攀枝花仁和鎮(zhèn)(26°49′ N，101°75′ E)巨園桉DH201-2。每個樣本的桉樹葉柄和主脈、無羽化孔蟲癭組織各0.6 g。桉樹枝癭姬小蜂幼蟲在無菌室中通過解剖無羽化孔的蟲癭組織獲得。桉樹枝癭姬小蜂幼蟲、剛羽化的雌成蟲(南寧種群和四川種群)和天敵孟氏胯姬小蜂成蟲進行饑餓處理6 h后，各選取50頭大小一致、生長健康的個體作為一組樣本，先用無菌水沖洗掉蟲體表面雜質，再用75%酒精消毒1 min，隨后用無菌水沖洗1 min，重復3次。

1.2 試劑與儀器

試劑：PowerSoil?DNA Isolation kit (MO BIO，12888-100)、Qubit?dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher，Q32854)、MinElute?PCR Purification Kit (Qiagen，28004)等，均購自南寧國拓生物科技有限公司。

儀器：電泳儀電源(DYY-4C)和水平電泳儀(DYCP-31CN)，北京六一生物科技有限公司；微量核酸蛋白測定儀(NanoDrop One)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；PCR儀(EASYCYCLER 96)，德國耶拿分析儀器股份公司；凝膠成像系統(tǒng)(CHEMIDOC XRS)，伯樂生命醫(yī)學產品(上海)有限公司。

1.3 細菌基因組DNA提取與PCR擴增

將1.1節(jié)準備的各個樣本采用PowerSoil?DNA Isolation kit (MO BIO，12888-100)試劑盒進行內生菌基因組DNA提取，具體方法參考試劑盒說明書的步驟進行。采用微量核酸蛋白測定儀測定總DNA的濃度和純度，檢測合格后的樣本保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

以提取的DNA為模板，采用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴增細菌16S rRNA的V3-V4區(qū)。擴增條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性60 s，50 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR擴增體系：DNA模板2 μL，Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 0.2 μL，正反向引物各1.5 μL，dNTP 1 μL，10×Buffer和High GC Enhancer各10 μL，用ddH2O補足50 μL。PCR產物用1.8%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.4 細菌基因組DNA文庫的構建和測序

利用Qubit?dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher，Q32854)對上述PCR產物進行定量，用1.8%瓊脂糖凝膠電泳切取目的片段，利用MinElute?PCR Purification Kit (Qiagen，28004)回收目的片段。使用Qubit 3.0熒光定量儀對按照建庫說明構建好的小片段文庫進行濃度檢測，采用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測其片段范圍，Illumina HiSeq 2500進行雙末端測序(北京百邁克生物科技有限公司)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Overlap對測試得到的原始標簽進行過濾，拼接并去除嵌合體，得到高質量的有效序列(effective Tags)。首先使用FLASH v1.2.11軟件對每個樣本的reads進行PE reads拼接，得原始Tags序列；再使用Trimmomatic v0.33軟件進行過濾，得到高質量的clean Tags序列；最后使用UCHIME v4.2軟件鑒定并去除嵌合體序列，得到有效序列，并計算其堿基質量值。堿基質量值是衡量測序質量的重要指標，其計算公式為Q=-10lgP，其中Q為堿基質量值，P為概率；堿基質量值(Q)越高表明堿基被測錯的概率(P)越小，Q20和Q30分別代表堿基識別正確率大于99%和99.9%，其值越大，說明測序結果越好。

使用QIIME v1.8.0軟件對這些序列進行聚類，相似性大于97% 的序列歸為一個分類單元，即一個OTU(operational taxonomic unit)。使用Mothur v1.30(http://www.mothur.org/)軟件與SILVA數(shù)據(jù)庫(http://www. arb-silva.de/)PyNAST算法和RDP Classifier貝葉斯算法對OTU進行分類學分析及Alpha 多樣性分析。利用QIIME軟件和R語言制作物種豐度表和群落結構圖。采用主成分分析(principal component analysis，PCA)和非加權組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)分析不同樣本中細菌群落的整體相似性和差異性。

2 結果與分析

2.1 桉樹-桉樹枝癭姬小蜂-孟氏胯姬小蜂體內細菌高通量測序結果

經(jīng)過高通量測序，本研究共獲得864 135條有效序列，平均長度均大于400 bp，有效率均高于80%，Q20和Q30值均大于90%(表1)。以97 %相似水平對有效序列進行聚類，共獲得1 102個OTU，其中南寧桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲(NLI)、四川桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲(SLI)、四川孟氏胯姬小蜂成蟲(SQM)、桉樹枝癭姬小蜂幼蟲(YC)、巨園桉DH201-2葉柄和主脈(ZW)及無羽化孔蟲癭內部組織(ZZ)樣本分別有246，238，414，390，736，594個OTU；其中有96個OTU為ZW、ZZ、YC和NLI樣本所共有，說明桉樹枝癭姬小蜂幼蟲和成蟲體內的細菌與所取食植物和蟲癭組織體內的細菌具有一定程度的相似性，表明桉樹枝癭姬小蜂可能通過取食從寄主植物獲取一定的細菌；有133個OTU為YC(占34.10%)和NLI(占54.07%)樣本所共有，表明桉樹枝癭姬小蜂幼蟲和成蟲體內的細菌具有一定的相似性；有168個OTU為NLI和SLI樣本所共有，說明桉樹枝癭姬小蜂體內共有細菌很多；有211個OTU為SQM(占50.97%)和SLI(占88.66%)樣本所共有，表明桉樹枝癭姬小蜂與其天敵孟氏胯姬小蜂體內細菌具有一定的相似性(圖1)。

表1 桉樹-桉樹枝癭姬小蜂-孟氏胯姬小蜂6個樣本內生細菌高通量測序結果Table 1 Sequencing statistics of 6 samples among eucalyptus,L.invasa and Q.mendeli

2.2 桉樹-桉樹枝癭姬小蜂-孟氏胯姬小蜂體內細菌群落組成分析

基于OTU的注釋結果可知，桉樹-桉樹枝癭姬小蜂-孟氏胯姬小蜂體內細菌多樣性差異明顯，6個樣本(NLI、SLI、SQM、YC、ZW和ZZ)共獲得24個門，55個綱，126個目，225個科，497個屬的細菌，其中ZW樣本體內細菌在各分類水平上獲得的個數(shù)最多，而SLI樣本體內細菌在各分類水平上獲得的個數(shù)最少(表2)。

表2 桉樹-桉樹枝癭姬小蜂-孟氏胯姬小蜂6個樣本內生細菌不同分類水平的數(shù)量Table 2 Number of species at each classification level of 6 samples among eucalyptus,L.invasa and Q.mendeli

由圖2-A可知，在門水平上，變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)在所有樣本中均存在，其中變形菌門(Proteobacteria)是所有樣本的優(yōu)勢菌門，在SLI、NLI、YC、SQM樣本中相對豐度分別達到了98.22%，95.43%，86.25%，67.77%。在ZW和ZZ樣本中，厚壁菌門為次優(yōu)勢菌門，其相對豐度分別達到31.39%和31.05%。在YC樣本中，厚壁菌門相對豐度為8.09%。在SQM樣本中，厚壁菌門相對豐度為9.29%，擬桿菌門相對豐度為11.10%，放線菌門相對豐度為6.27%。

由圖2-B可知，在屬水平上，ZW樣本體內菌群中優(yōu)勢菌為甲基桿菌屬(Methylbacillus)，相對豐度為13.01%，次優(yōu)勢菌為埃希氏菌屬(Escherichia-Shigella)，相對豐度為8.31%；ZZ樣本體內優(yōu)勢菌群為鏈球菌屬(Streptococcus)和擬桿菌屬(Bacteroides)，相對豐度分別為7.71%和6.55%。桉樹枝癭姬小蜂的幼蟲(YC)、成蟲(NLI和SLI)以及天敵孟氏胯姬小蜂(SQM)的優(yōu)勢菌均為立克次氏體屬(Rickettsia)，而立克次氏體屬在ZW和ZZ樣本中相對豐度很低，但在YC、NLI、SLI和SQM樣本中的相對豐度分別為81.49%，93.39%，91.92%和39.73%。此外，不動桿菌屬(Acinetobacter)是SQM樣本中的次優(yōu)勢菌，相對豐度為20.37%。

2.3 桉樹-桉樹枝癭姬小蜂-孟氏胯姬小蜂體內細菌群落組成相似性分析

主成分分析結果表明，南寧地區(qū)桉樹枝癭姬小蜂幼蟲、南寧和四川地區(qū)桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲體內細菌群落結構類似；巨園桉DH201-2葉脈和葉柄與無羽化孔蟲癭組織距離較近，說明彼此之間的細菌群落組成有一定的相似性(圖3)。

聚類分析結果表明，ZW和ZZ聚為一分支，而NLI、SLI、YC和SQM聚在另一分支上，說明桉樹枝癭姬小蜂幼蟲、成蟲與孟氏胯姬小蜂體內菌群結構和豐度存在一定的相似性(圖4)。

3 討 論

本研究結果表明，桉樹-桉樹枝癭姬小蜂-孟氏胯姬小蜂三者體內細菌具有一定的相似性。昆蟲體內的細菌可以從外界環(huán)境中獲取，比如翟小戰(zhàn)[24]研究發(fā)現(xiàn),中華按蚊(Anophelessinensis)體內細菌主要來自于所生活的水體環(huán)境中。此外，通過取食昆蟲也可以獲得一些微生物，比如棉鈴蟲體內的大多數(shù)細菌與所取食葉片內的細菌具有高度相似性[26-27]。煙粉虱可將體內的沃爾巴克氏體傳遞給其寄生蜂，而寄生蜂從煙粉虱體內獲得的沃爾巴克氏體也可以傳遞給煙粉虱[28-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，巨園桉DH201-2、無羽化孔蟲癭組織、桉樹枝癭姬小蜂幼蟲和成蟲體內細菌共有96個相同的屬，同時巨園桉DH201-2和桉樹枝癭姬小蜂成蟲體內細菌有133個相同的屬，彼此之間具有一定的相似性，推測桉樹枝癭姬小蜂體內細菌可能是通過取食巨園桉DH201-2獲得的，但還需進一步試驗證明。本研究結果顯示，四川和南寧地區(qū)的桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲體內細菌有168個相同的屬，四川桉樹枝癭姬小蜂和孟氏胯姬小蜂體內細菌共同享有211個屬，且這3個樣本在UPGMA聚類圖上集聚在一個大分支上，由此可推測南寧地區(qū)的桉樹枝癭姬小蜂和孟氏胯姬小蜂體內菌群結構組成具有一定的相似性。昆蟲體內的細菌還可能通過繁殖垂直傳遞給下一代。Knorr等[31]報道了紅粉甲蟲(Triboliumcastaneum)體內的假單胞菌(Pseudomonas)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)等可通過母體垂直傳遞給子代。Koch等[32]在分析歐洲蜜蜂(Bombusterrestris)體內細菌多樣性時發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細菌來自母本體內。Yukuhiro等[33]發(fā)現(xiàn)，褐粉虱(Nilaparvatalugens)體內的共生菌與母本卵巢內共生菌相似，說明昆蟲體內的細菌還可通過卵巢進行傳遞。本研究發(fā)現(xiàn)，桉樹枝癭姬小蜂幼蟲和成蟲體內細菌有11個相同的門、96個相同的屬，主要菌群組成相對豐度較高并且極為相似，說明桉樹枝癭姬小蜂體內細菌可能是通過母體進行傳遞的，后續(xù)還需通過對其卵、卵巢及各發(fā)育階段進行定量PCR、熒光原位雜交等試驗進一步證實。

本研究還發(fā)現(xiàn)立克次氏體(Rickettsia)在南寧地區(qū)的桉樹枝癭姬小蜂幼蟲、成蟲和四川地區(qū)的桉樹枝癭姬小蜂成蟲、孟氏胯姬小蜂體內細菌中相對豐度較高，說明立克次氏體能穩(wěn)定存在于昆蟲體內，并可能是垂直傳遞的。而其在蟲癭組織體內細菌中僅占3.48%。這可能是由于桉樹枝癭姬小蜂取食時將體內的立克次氏體傳遞給植物，也可能是幼蟲在蟲癭內生長過程中將體內的立克次氏體傳遞給植物所造成的。不過目前還沒有證據(jù)表明桉樹枝癭姬小蜂和孟氏胯姬小蜂體內立克次氏體能夠進行水平傳遞，還需要進一步研究[34]。已有研究表明，立克次氏體是一種廣泛分布于節(jié)肢動物體內的母系遺傳共生細菌，能夠在親代和子代之間垂直傳遞，并調控諸多宿主昆蟲的生殖行為，誘導孤雌生殖[35-37]和殺雄等現(xiàn)象[38-39]。立克次氏體主要存在于桉樹枝癭姬小蜂雌性成蟲體內，可能是造成桉樹枝癭姬小蜂孤雌生殖的原因[14-15]。通過飼喂抗生素來消除雌性體內立克次氏體應該可以增加雄性后代的比例，Giorgini等[35]研究發(fā)現(xiàn)含有立克次氏體的寄生蜂 (Pnigaliosoemius)僅產生雌蟲后代，用質量濃度20 mg/mL的利福平處理24 h消除立克次氏體后，幾乎全部為雄性后代。Hagimori等[36]報道了立克次氏體與潛葉蠅類害蟲的優(yōu)勢寄生性天敵昆蟲芙新姬小蜂(Neochrysocharisformosa)的孤雌生殖有關，四環(huán)素處理后出現(xiàn)了大量雄性后代。因此，未來應用抗生素處理去除其體內的立克次氏體，進一步明確立克次氏體是否參與操縱桉樹枝癭姬小蜂繁殖。除此之外，立克次氏體還可以影響宿主的適合度和抵御環(huán)境的能力[40-44]。比如對感染立克次氏體和未感染立克次氏體的兩個B型煙粉虱(BemisiatabaciB-biotype)種群的生物學特性研究后發(fā)現(xiàn)，感染立克次氏體的煙粉虱在卵至成蟲的階段發(fā)育速度更快[41]。Himler[42]研究發(fā)現(xiàn)，感染立克次氏體還可以提高宿主B 型煙粉虱的產卵量、存活率及后代雌蟲的比例，縮短發(fā)育歷期。

4 結 論

本研究首次詳細比較了桉樹-桉樹枝癭姬小蜂-孟氏胯姬小蜂內生細菌群落，發(fā)現(xiàn)三者體內細菌有密切聯(lián)系，且具有一定的相似性。該結果有助于了解桉樹-桉樹枝癭姬小蜂-天敵昆蟲之間的相互作用，進而從共生菌新角度探討桉樹枝癭姬小蜂入侵與爆發(fā)機制，為桉樹枝癭姬小蜂的“共生入侵”假說提供佐證。