付敏婕，張 立，馮 妮

(1.咸寧市中心醫(yī)院/湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，湖北 咸寧 437100；2.咸寧市中心醫(yī)院/湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科)

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種常見的慢性退行性變，病變主要累及關(guān)節(jié)滑膜、關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨重構(gòu)，導(dǎo)致患者疼痛和關(guān)節(jié)活動受限，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，65歲以上人群中近半數(shù)被膝骨關(guān)節(jié)炎困擾[2]。目前認(rèn)為衰老、創(chuàng)傷、肥胖、炎癥和基因水平的易感性等綜合因素下，關(guān)節(jié)軟骨的分解和合成代謝失衡，從而影響關(guān)節(jié)腔內(nèi)微環(huán)境，導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展[3]。非甾體類抗炎鎮(zhèn)痛藥(non-steroid anti-inflammatory drugs，NSAIDs)是治療膝骨關(guān)節(jié)炎的常用藥物，但長期應(yīng)用胃腸道副反應(yīng)大。針灸是治療膝骨關(guān)節(jié)炎的外治法之一，安全性和有效性高，但作用機制尚不完全清楚。本研究采用完全弗氏佐劑(freund’s adjuvant complete，CFA)制作膝骨關(guān)節(jié)炎和炎癥小鼠模型，應(yīng)用溫和灸法治療，為進一步研究艾灸抗炎鎮(zhèn)痛機制做好前期準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

30只雄性C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量22～24g，購自成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[清潔級，合格證號scxk(川)2012-16]。置于12L∶12D(光期7：01～19：00，暗期19：01～次日7：00)光暗對置條件下，室溫(23±1)℃，飼養(yǎng)1周?；A(chǔ)足容積篩選合格的小鼠24只，隨機分為對照組、模型組和模灸組，每組8只。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：WZ-2300R無紙溫度記錄儀，LEICA DM4000B智能生物顯微鏡，5417R高速冷凍離心機，Nano drop 2000微量紫外分光光度計，F(xiàn)LUKO F6/10超細(xì)勻漿機，HH-S4數(shù)顯雙列四孔水浴鍋，ImmunoWash 1575洗板機，iMark Microplate Reader酶標(biāo)儀。主要試劑：小鼠艾灸條(5mm×120mm)由南陽漢醫(yī)艾絨有限責(zé)任公司提供；PBS緩沖液、1%戊巴比妥鈉、75%消毒酒精、0.9%氯化鈉注射液、4%多聚甲醛、10%EDTA-Na2均由成都仁杰醫(yī)療器械有限公司提供；兔抗小鼠TNF-α多克隆抗體(克隆號：BA0312)、免疫組化(SP法)試劑盒均由武漢博士德生物工程有限公司提供；CFA由武漢中科萬通儀器有限公司提供。

1.3 佐劑性炎癥模型的制備

在小鼠右側(cè)足底肉墊注射20μL CFA，對照組用相同的方法注射20μL生理鹽水。注射CFA后第4d測量足容積，自身對照小鼠足容積超過50%則表示造模成功[4]，剔除造模未成功小鼠。

1.4 艾灸治療和足容積測量方法

1.4.1 艾灸干預(yù)方法

造模成功后，模灸組小鼠艾灸右側(cè)“足三里”(艾灸治療前備皮)，根據(jù)衛(wèi)生部“十二五”規(guī)劃教材《實驗針灸學(xué)》取穴。室溫(23±1)℃，穴位皮膚溫度維持在(42±1)℃，20min/次，1次/d，每周治療6d，共治療4周。模型組和對照組相同條件捆綁固定。

1.4.2 測量痛閾和足容積

采用足容積測量器測量小鼠足容積，實驗全程由專人負(fù)責(zé)，減小偏倚，分別于造模前(基線)、造模后第4d測量1次，此后每5d測量1次，共測量6次。小鼠熱痛閾采用熱痛閾測量儀，分別于造模前(基線)、造模后第3d開始，連續(xù)測量19d。

1.5 取材及檢測方法

1.5.1 取小鼠膝關(guān)節(jié)滑膜

末次治療結(jié)束后2h取材，2%異氟醚麻醉斷頸處死小鼠，全程取材在-4℃冰盤上進行。75%乙醇消毒小鼠右側(cè)“足三里”處皮膚，以穴位中心為原點，用眼科剪剪下直徑約1cm的圓形皮膚，放入凍存管，-80℃冰箱保存待測。剝離小鼠右后腿皮膚和肌肉，于膝關(guān)節(jié)上下1cm處截取膝關(guān)節(jié)，置于解剖顯微鏡下取出膝關(guān)節(jié)滑膜，4%多聚甲醛固定，4℃冰箱保存待測。

1.5.2 免疫組化檢測

將標(biāo)本置于10%EDTA-Na2脫鈣10d(4℃冰箱)，梯度乙醇脫水，石蠟包埋切片。免疫組化SP染色法參照試劑盒步驟進行。細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為TNF-α。顯微鏡采集200倍視野下滑膜組織切片，采用Image pro plus 6.0軟件進行量化分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠足容積比較

如圖1示，造模后第4d，與對照組比較，模型組與模灸組足容積顯著增加，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。第4～14d，模型組和模灸組小鼠足容積仍顯著大于對照組，且兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。從第14～24d，模型組和模灸組小鼠足容積均開始減小，但組間無統(tǒng)計學(xué)差異，且兩組小鼠足容積仍大于對照組；第24d測量足容積，顯示模灸組小鼠足容積較模型組小，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；末次治療后模灸組與對照組差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)，模灸組小鼠已痊愈。

(與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01)

2.2 小鼠痛閾比較

如圖2所示，造模后第3d，模型組和模灸組較對照組小鼠痛閾顯著降低(P<0.05)，模灸組和模型組小鼠痛閾無差異。艾灸治療第8d后模灸組小鼠痛閾較模型組降低(P<0.05)，自第14d開始兩組小鼠痛閾有顯著性差異(P<0.01)，第19d時，模灸組與對照組小鼠痛閾無差異。

(與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與對照組比較，#P<0.05，##P<0.01)

2.3 TNF-α免疫組化比較

如圖3所示：治療結(jié)束后，與模型組小鼠比較，模灸組小鼠關(guān)節(jié)滑膜TNF-α水平明顯降低(P<0.05)。

A和B兩圖中褐色為陽性染色區(qū)，藍色為細(xì)胞核，×200；C圖為小鼠滑膜組織陽性染色區(qū)域百分比對比，*P<0.05

3 討 論

溫?zé)嵝?yīng)是艾灸產(chǎn)生生物學(xué)作用的主要途徑，局部溫?zé)岽碳た杉せ钇つw感受器，通過釋放生物活性物質(zhì)、激活信號通路產(chǎn)生作用。而不同的溫度激活的響應(yīng)分子和信號通路可能不盡相同，故不同灸法的艾灸溫度和灸量是我們探討的內(nèi)容。研究表明，艾灸的溫?zé)嵝?yīng)，即灸溫的不同是產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵因素[5-6]。有研究認(rèn)為[7]，艾條燃燒時產(chǎn)生熱、光、煙三要素，其中熱效應(yīng)是其主要的作用形式，艾灸的療效主要取決于灸溫。適宜的溫?zé)岽碳た筛淖儥C體組織代謝、CO釋放以及增加局部血流，有利于帶走炎性物質(zhì)，此外，灸溫產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)可直接起到抑制炎癥因子釋放的作用[8-9]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，灸溫的高低和溫度的滲透深度呈反比，溫和灸的滲透性最好，灸溫越高反而滲透性越低。有學(xué)者研究不同灸溫下，艾灸對炎癥痛小鼠模型鎮(zhèn)痛作用的效應(yīng)特點[10]，發(fā)現(xiàn)42℃灸的鎮(zhèn)痛效果持續(xù)時間最強。本研究采用42℃灸，并發(fā)現(xiàn)艾灸的抗炎作用并非從治療灸開始起效，而是在治療了5次以后才出現(xiàn)顯著療效，這與艾灸的臨床應(yīng)用實踐相符。中醫(yī)學(xué)有“謹(jǐn)守病機，守方不移”的治療原則，針灸療效的產(chǎn)生也需要堅持按照療程治療。此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)45℃灸對CFA大鼠模型中的鎮(zhèn)痛和抗炎作用優(yōu)于38℃灸，45℃灸組大鼠血清IL-1β和TNF-α顯著下降[11]。灸溫差異產(chǎn)生不同生物學(xué)效應(yīng)的分子機制是研究的熱點。43℃是瞬時受體電位香草酸陽離子通道1(TRPV1)的激活溫度，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[12]，在皮膚局部涂抹辣椒素能提高炎癥痛小鼠痛閾，這說明TRP信號通路參與了炎癥痛過程，而進一步在局部使用辣椒素受體拮抗劑能削弱針灸的鎮(zhèn)痛作用，TRPV1參與艾灸的鎮(zhèn)痛過程，但其中的機制仍有待進一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，艾灸治療從第10d開始逐漸產(chǎn)生消腫作用，而艾灸的鎮(zhèn)痛作用在治療的第8d即出現(xiàn)，說明艾灸的鎮(zhèn)痛作用與抗炎機制可能存在不同的神經(jīng)生理學(xué)基礎(chǔ)。最新研究[13]揭示了電針通過激活迷走-腎上腺皮質(zhì)軸產(chǎn)生強大的抗炎作用。本研究肯定了艾灸的抗炎鎮(zhèn)痛作用，并且對小鼠全身炎癥指標(biāo)有抑制，這可能是艾灸抗炎的重要作用機制，但其內(nèi)在聯(lián)系尚需進一步研究驗證。