王 浩，周 權，葛娟娟，2，趙 元，胡美純，朱 薿**

(1.湖北科技學院醫(yī)學部基礎醫(yī)學院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學院醫(yī)學部藥學院；3.湖北科技學院醫(yī)學部生物醫(yī)學工程與醫(yī)學影像學院)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤(glioma)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性原發(fā)性腫瘤，對數(shù)百萬人健康造成嚴重威脅[1]。目前膠質(zhì)瘤可通過外科手術、放療和化療治療[2]，然而接受治療的患者中位數(shù)存活期僅有15個月，預后較差[3]。由此，早期診斷和尋找預后標志物對于提高患者存活率和開發(fā)新治療手段至關重要。SOX4是SOX(SRY-related HMG-box)轉(zhuǎn)錄因子C組家族成員，在腫瘤增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用[4-5]。但是SOX4對膠質(zhì)瘤的診斷和預后的作用價值尚無系統(tǒng)研究。本研究聯(lián)合多組學數(shù)據(jù)，從DNA、mRNA水平分析SOX4在惡性膠質(zhì)瘤(glioblastoma multiforme，GBM)和低級別膠質(zhì)瘤(low-grade glioma，LGG)中的表達差異；探討SOX4表達與GBM和LGG腫瘤發(fā)生相關通路、免疫細胞浸潤、基因突變和DNA甲基化的相關性；評估SOX4對GBM和LGG的診斷和預后價值，為今后基于SOX4分子的臨床運用和靶向藥物開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載及數(shù)據(jù)預處理

從TCGA(https://www.portal.gdc.cancer.gov)數(shù)據(jù)庫和GTEx(https://gtexportal.org/home/datasets)數(shù)據(jù)庫中下載GBM和LGG表達譜數(shù)據(jù)。納入本次研究的GBM樣本包括TCGA數(shù)據(jù)庫166例癌組織樣本和5例癌旁組織、GTEx數(shù)據(jù)庫1152例正常組織樣本；LGG樣本包括TCGA數(shù)據(jù)庫523例癌組織樣本、GTEx數(shù)據(jù)庫1152例正常組織樣本。本研究所有數(shù)據(jù)均來源于TCGA和GTEx公共數(shù)據(jù)庫，因此，無需倫理批準及簽署知情同意書。

1.2 SOX4基因在GBM和LGG中的表達

通過R軟件(R software，version 4.0.0)收集GBM和LGG中HTSeq-FTPM格式的RNAseq數(shù)據(jù)并進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化，表達差異數(shù)據(jù)運用R軟件ggplots2包進行可視化。從單細胞數(shù)據(jù)庫scTIME Portal(scTIME.sklehabc.com)中提取GSE131928數(shù)據(jù)信息，分析SOX4在膠質(zhì)瘤組織各類細胞中的表達情況。

1.3 SOX4共表達基因篩選

根據(jù)SOX4基因表達中位數(shù)分別將GBM和LGG分為高SOX4組和低SOX4組，運用R軟件DESeq2(1.26.0)包[6]，以|log2(FC)|>1.5和adj.p value <0.05為條件，篩選SOX4共表達差異基因。用R軟件ggplot2包繪制火山圖、熱圖和韋恩圖。

1.4 SOX4共表達基因功能富集分析

通過R軟件ClusterProfiler(3.14.3)[7]包對SOX4共表達基因分別進行Gene ontology(GO)和通路Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析，以adj.p value<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。同樣使用R軟件ClusterProfiler包對基因表達矩陣進行GSEA分析，F(xiàn)alse discovery rate(FDR)<0.25且P<0.05具有顯著富集。以adj.p value和標準化富集分數(shù)(normalized enrichment scores，NES)篩選GBM和LGG的TOP10通路。

1.5 SOX4相關蛋白與蛋白互作網(wǎng)絡

STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫對數(shù)據(jù)集中SOX4共表達基因進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(protein interaction network，PPI)構建，并且利用Cytoscape(3.8.0)[8]中MCODE插件獲取Top10關鍵基因(Hub gene)。

1.6 SOX4基因突變

通過cBioPortal(http://cbioportal.org)數(shù)據(jù)庫對GBM數(shù)據(jù)集Glioblastoma(CPTAC，Cell2021)、Glioblastoma(Columbia，Nat Med.2019)、Glioblastoma Multiforme(TCGA，F(xiàn)irehose，Legacy)及LGG數(shù)據(jù)集Brain Lower Grade Glioma(TCGA，F(xiàn)irehose Legacy)、Low-Grade(UCSF，Science2014)中SOX4基因突變信息。

1.7 SOX4 DNA甲基化分析

MethSurv(https://biit.cs.ut.ee/methsurv/)是基于TCGA集中的450K數(shù)據(jù)構建的可視化分析工具。從MethSurv數(shù)據(jù)庫中分別選擇“GBM”和“LGG”，在“gene search”中輸入“SOX4”，分析SOX4基因甲基化水平及其與預后的相關性。

1.8 免疫細胞浸潤分析

24種免疫細胞的標記物是從Bindea及其同事的研究中提取的[9]。采用ssGSEA算法分析GBM和LGG中腫瘤24種免疫細胞的浸潤情況，采用Spearman相關分析SOX4與這24種免疫細胞的相關性。

1.9 統(tǒng)計學方法

所有統(tǒng)計分析均采用R(4.0.0)軟件。使用t檢驗分析不同組織中SOX4的表達差異。Receiver operating characteristic curve(ROC)法分析SOX4對GBM和LGG的臨床診斷價值。采用Kaplan-Meier(KM)方法和單因素及多因素COX回歸分析SOX4的臨床意義與預后(總生存率，Over survival，OS)的相關性。P<0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 SOX4在膠質(zhì)瘤組織中高表達及其臨床診斷價值

分析TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中收集的多種腫瘤和對應正常組織中SOX4 mRNA表達量。與正常組織相比較，SOX4 mRNA在GBM、LGG、ACC、CHOL、LIHC、KIRP、LUAD等多種腫瘤組織中差異表達(圖1A)。在GBM(圖1B)和LGG(圖1C)腫瘤組織中SOX4 mRNA水平顯著高于癌旁組織。單細胞測序分析發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織主要含有Macrophage、Malignant、Oligodendrocyte、T cell等類型細胞(圖1D)，其中SOX4主要在膠質(zhì)瘤Malignant腫瘤細胞中表達(圖1E)。

進一步分析不同臨床特征膠質(zhì)瘤患者中SOX4表達差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GBM患者中SOX4表達與年齡無相關性(圖1F)，但SOX4在IDHMut GBM組織中的表達顯著高于IDH WT者(圖1G，P<0.05)。LGG中，年齡低于40歲的LGG患者組織中SOX4 mRNA表達顯著高于40歲以上的患者(圖1I，P<0.05)。SOX4在IDHMut LGG組織中的表達顯著高于IDH WT者(圖1J，P<0.05)。ROC分析發(fā)現(xiàn)SOX4在GBM中AUC=0.976，95%CI為0.969～0.987(圖1H)；在LGG中的AUC=0.985，95%CI為0.979～0.991(圖1K)，提示SOX4表達可能用于輔助診斷GBM和LGG。

A.TCGA和GETx數(shù)據(jù)庫泛癌腫瘤組織和癌旁組織樣本中SOX4 mRNA差異表達；B-C.TCGA和GETx數(shù)據(jù)庫GBM(B)和LGG(C)樣本中SOX4的差異表達；D-E.單細胞測序分析SOX4在不同膠質(zhì)母瘤種類細胞中表達情況；F-H.SOX4表達與GBM患者中年齡(F)、IDH 狀態(tài)(G)相關性和診斷價值(H)；I-K.SOX4表達與LGG患者中年齡(I)、IDH 狀態(tài)(J)相關性和診斷價值(K)

2.2 膠質(zhì)瘤中SOX4功能富集分析

為了發(fā)現(xiàn)SOX4與共表達基因相關性，我們隨后篩選了SOX4共表達基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GBM患者中SOX4共表達基因有250個上調(diào)和93個下調(diào)(圖2A、B)；LGG中有9個基因上調(diào)和380個基因下調(diào)(圖2C、D)。對GBM和LGG中SOX4共表達差異基因取交集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)37個同時在GBM和LGG中共表達的差異基因(圖2E)。GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)37個差異基因主要與long-chain fatty acid transport，endocytic vesicle lumen，calcium-dependent phospholipase A2 activity等生物學現(xiàn)象有關(圖2F～H)。KEGG結(jié)果顯示這37個差異基因主要富集于Arachidonic acid metabolism，Glycerophospholipid metabolism，Pancreatic secretion等通路(圖2I)。GSEA富集結(jié)果顯示這些共表達基因在GBM中主要與神經(jīng)脊分化、胰島素分泌、炎癥反應等途徑有關(圖2J)。LGG中這些共表達基因主要與有絲分裂合成、DNA的修復、免疫反應等多種相關途徑有關(圖2K)。

2.3 膠質(zhì)瘤中SOX4相關蛋白互作網(wǎng)絡

通過STRING數(shù)據(jù)庫對篩選的37個共表達基因進行PPI分析(圖2L)，設定相互作用閾值為0.15，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白互作網(wǎng)絡圖包含37個節(jié)點，45個邊，節(jié)點的平均度值2.43。使用Cytoscape軟件對該網(wǎng)絡圖進行可視化展示(圖2M)，并篩選Top10關鍵基因(圖2N)。

2.4 膠質(zhì)瘤中SOX4基因突變差異

為了解SOX4在膠質(zhì)瘤組織中是否存在基因突變或拷貝數(shù)擴增等基因改變，我們通過cBioPortal(http://cbioportal.org)數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)SOX4在GBM中基因發(fā)生突變、增加的頻率分別為0.14%和0.29%(圖2O)；760例GBM患者的13個樣本中SOX4發(fā)生改變，SOX4在GBM的突變率為0.4%(圖2P)。LGG中SOX4基因發(fā)生突變、增加、缺失的頻率分別為0.35%、0.87%和0.17%(圖2Q)；591例LGG患者中52個樣本的SOX4發(fā)生改變，SOX4在LGG的突變率為1.5%(圖2R)。

A-B.GBM中SOX4共表達差異基因火山圖(A)、SOX4中TOP20共表達差異基因熱圖(B)；C-D.LGG中SOX4共表達差異基因火山圖(C)、SOX4中TOP20共表達差異基因熱圖(D)；E.SOX4共表達基因韋恩圖；F～H.GO分析共表達基因富集BP(F)、CC(G)MF(H)可視化網(wǎng)絡；I.KEGG富集分析可視化網(wǎng)絡；J-K.GSEA富集分析GBM(J)和LGG(K)中SOX4表達差異基因功能；L.STRING分析SOX4蛋白互作網(wǎng)絡；M.Cytoscape軟件分析SOX4蛋白互作網(wǎng)絡；N.Cytoscape軟件分析TOP10 SOX4蛋白互作關鍵基因；O-P.SOX4在GBM基因突變分析；Q-R.SOX4在LGG中基因突變分析

2.5 SOX4 DNA甲基化水平及其與預后相關性

通過MethSurv數(shù)據(jù)庫分析GBM和LGG中SOX4 DNA甲基化水平。結(jié)果顯示，GBM樣本中有18個SOX4 DNA甲基化水平發(fā)生改變(圖3A)，COX回歸和KM分析發(fā)現(xiàn)Cg22274825、Cg08625851和Cg00792966位點DNA甲基化與GBM預后密切相關(圖3B～E，P<0.05)。LGG樣本中有18個SOX4 DNA甲基化水平發(fā)生改變(圖3F)，其中Cg22274825、Cg23780597、Cg08625851位點DNA甲基化與LGG預后密切相關(圖3G-H，P<0.05)。

A.GBM中SOX4 DNA甲基化位點變化熱圖；B.COX回歸分析SOX4 DNA甲基化位點與GBM預后的相關性(森林圖)；C-F.KM曲線比較高低Cg22274825(C)、Cg08625851(D)和Cg00792966(E)位點DNA甲基化水平GBM患者總生存率；F.LGG中SOX4 DNA甲基化位點變化熱圖；G.COX回歸分析SOX4 DNA甲基化位點與LGG預后的相關性(森林圖)；H-J.KM曲線比較高低Cg22274825(H)、Cg08625851(I)和Cg23780597(J)位點DNA甲基化水平GBM患者總生存率

2.6 SOX4與膠質(zhì)瘤免疫細胞浸潤的相關性

采用ssGSEA分析SOX4與多種腫瘤免疫細胞浸潤的相關性(圖4A)，還分析SOX4與GBM(圖4B)和LGG(圖4C)中24種免疫細胞的相關性。Spearman相關性分析發(fā)現(xiàn)，與SOX4相關程度TOP5的GBM免疫細胞為Th2 cells(圖4D)、Tgd(圖4E)、Tcm(圖4F)、TFH(圖4G)、T helper cells(圖4H)。與SOX4密切相關TOP5的LGG免疫細胞為Tgd(圖4I)、T helper cells(圖4J)、Th2 cells(圖4K)、Tcm(圖4L)、pDC(圖4M)。

A.多種腫瘤中SOX4與免疫浸潤細胞相關性熱圖；B.GBM中SOX4與免疫浸潤細胞相關性熱圖；C.LGG中SOX4與免疫浸潤細胞相關性熱圖；D-H.GBM中SOX4與免疫浸潤TOP5免疫細胞相關性；I-M.LGG中SOX4與免疫浸潤TOP5免疫細胞相關性

3 討 論

本研究通過多組學聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)SOX4 mRNA水平在膠質(zhì)瘤中高表達，提示SOX4可能在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮作用。Luo等[10]證實降低SOX4使miR-133a過表達從而抑制膠質(zhì)瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和EMT。Zhao等[11]證實miR-29a通過抑制SOX4轉(zhuǎn)錄翻譯，促進膠質(zhì)母細胞的侵襲。Liu等[12]證實激活SMAD2/3通路并誘導SOX4和SOX2的表達促進膠質(zhì)瘤細胞遷移能力。Han等[13]通過體內(nèi)外細胞實驗證實降低SOX4表達能夠抑制膠質(zhì)瘤干細胞活性。這些結(jié)果都說明SOX4參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。

為了探討SOX4潛在作用機制，本研究通過SOX4在膠質(zhì)瘤中共表達基因，進行功能富集分析，這些基因大多與有機酸轉(zhuǎn)運、囊腔以及細胞外基質(zhì)有關。本研究對SOX4共表達基因進行KEGG信號通路富集分析顯示，他們參與花生四烯酸代謝、血管平滑肌收縮和RAS信號通路等。研究顯示[14-17]，花生四烯酸代謝途徑在炎癥反應中發(fā)揮關鍵作用，RAS信號通路介導膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程。由此可見，SOX4可能是治療膠質(zhì)瘤的新靶點。此外，本研究通過GSEA發(fā)現(xiàn)，SOX4高表達膠質(zhì)瘤樣本主要富集在有絲分裂、DNA修復、CD22受體、神經(jīng)脊誘導分化、胰島素分泌和炎癥反應。SOX4 通過誘導細胞周期停滯和抑制細胞生長而在膠質(zhì)瘤細胞中發(fā)揮抑癌作用，阻斷輻射誘導的SOX4表達，抑制DNA修復，從而導致膠質(zhì)瘤細胞的死亡[18-19]。本研究進一步證實了SOX4通過有絲分裂和DNA修復發(fā)揮影響腫瘤進展作用。膠質(zhì)瘤的預后較差，治療方法有限，免疫療法是腫瘤治療開創(chuàng)方法[20]。因此，為了提供治療膠質(zhì)瘤的證據(jù)，本研究通過免疫浸潤發(fā)現(xiàn)SOX4與免疫細胞的關系，結(jié)果提示，SOX4與膠質(zhì)瘤多種免疫細胞存在相關性。由此，推斷出SOX4可能成為膠質(zhì)瘤免疫治療標志物。本研究通過ROC曲線分析SOX4對膠質(zhì)瘤具有潛在的診斷價值。

為了探究影響SOX4表達的機制，本研究發(fā)現(xiàn)SOX4 DNA甲基化水平發(fā)生改變。DNA甲基化是一種常見的表觀遺傳機制，存在于所有形式的腫瘤中。本研究發(fā)現(xiàn)4個位點SOX4 DNA甲基化水平與膠質(zhì)瘤預后密切相關，提示SOX4 DNA甲基化水平可作為預后評估分子應用于臨床實踐。另外，基因突變對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用。SOX4在膠質(zhì)瘤中有一定程度的突變，SOX4甲基化水平改變和突變發(fā)生可能是SOX4在膠質(zhì)瘤中高表達原因之一。

綜上所述，本研究中SOX4表達受DNA甲基化和基因突變調(diào)節(jié)，并與腫瘤免疫微環(huán)境有關。同時，SOX4及其DNA甲基化水平是潛在的診斷和預后評估因素，這說明SOX4可能參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此，SOX4可以成為潛在的診斷生物標志物以及膠質(zhì)瘤的治療靶點。SOX4功能的預測為膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制和在膠質(zhì)瘤免疫治療中的作用提供了見解，需要進一步研究，并探索臨床應用和藥物研發(fā)。