謝文靜，周宏福，郭安然，王自瑤，王世越，鄭 敏，李 玲

(湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(transcatheter hepatic arterial chemoembolization,TACE)是不可切除肝癌的首選姑息治療方法，這種常見(jiàn)的介入手段是通過(guò)患者大腿根部的股動(dòng)脈將細(xì)微的導(dǎo)管穿入，運(yùn)用數(shù)字減影血管造影機(jī)的透視引導(dǎo)，將導(dǎo)管送至肝內(nèi)腫瘤部位，并將抗癌藥物、栓塞劑通過(guò)導(dǎo)管注入肝內(nèi)腫瘤動(dòng)脈的治療方式[1]。

聚(N-異丙基丙烯酰胺)類聚合物水凝膠可以解決“流動(dòng)-栓塞”的矛盾問(wèn)題：在體外，它具有良好的流動(dòng)性，容易通過(guò)細(xì)長(zhǎng)導(dǎo)管注射彌散到微小的腫瘤末梢血管內(nèi)，進(jìn)入體內(nèi)以后，其高強(qiáng)度的栓塞可抵抗血流沖刷，防止血管復(fù)通，引起腫瘤的缺血、缺氧、壞死[2]。目前，有關(guān)聚(N-異丙基丙烯酰胺)類聚合物水凝膠在藥物遞送與血管栓塞治療領(lǐng)域的研究廣泛，通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)、物理吸附等方式與藥物組裝，可以實(shí)現(xiàn)較好的載藥目的[3]；此外，在聚(N-異丙基丙烯酰胺)類水凝膠上接枝親水性的單體，可進(jìn)一步提高其最低臨界溫度；其次，與金納米顆粒復(fù)合物組裝，還可以聯(lián)合光熱治療與射頻消融等技術(shù)，對(duì)腫瘤部位實(shí)現(xiàn)全方位的治療，大大降低復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的可能[4]。

然而，針對(duì)如何提高聚(N-異丙基丙烯酰胺)類聚合物水凝膠作為栓塞材料使用時(shí)的顯影效果鮮有研究。目前，臨床常用的血管栓塞材料有超液化碘油、明膠海綿、聚乙烯醇顆粒/微球、高分子微球等[5]，在使用過(guò)程中存在著以下不足：栓塞過(guò)程可控性差，無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)懸浮的栓塞材料進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，易造成異位栓塞；栓塞終點(diǎn)判定難，栓塞劑量難控制，易引起過(guò)度栓塞或者誤栓[6]；栓塞后隨訪不利。本研究首次設(shè)計(jì)合成了一種新型聚(N-異丙基丙烯酰胺)-共聚-四碘磺酸(NIPAM-co-Fisa)水凝膠材料，其溫敏特性來(lái)源于N-異丙基丙烯酰胺水凝膠上的親水結(jié)構(gòu)酰胺基以及疏水結(jié)構(gòu)異丙基，而四碘-2-磺酸苯甲酸酐與甲基丙烯酸羥乙酯化合物的成功接枝，賦予了凝膠以自顯影功能，相比物理混合顯影劑，不易被血液沖刷快速清除，穩(wěn)定性更好，栓塞劑量也能被很好地把握，術(shù)后還可采取影像學(xué)手段對(duì)栓塞材料在病灶內(nèi)的分布情況進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)和隨訪。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與動(dòng)物

N-異丙基丙烯酰胺(分析純,98%)購(gòu)自百靈威化學(xué)試劑網(wǎng)；N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺(分析純，>99%)，十八烷基三甲基氯化銨(分析純，98%)，2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(分析純，97%)，四碘-2-磺酸苯甲酸酐(分析純，>95.0%)，均購(gòu)自阿拉丁試劑網(wǎng)；無(wú)水碳酸鈉(分析純，≥99.9%)，甲基丙烯酸羥乙酯(96%,含250ppm MEHQ穩(wěn)定劑)，水合氯醛(分析純，>99.0%)均購(gòu)自上海麥克林試劑網(wǎng)；碘海醇購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥；C57BL/6J小鼠，成年新西蘭大白兔，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

BSA124S分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；DF-Ⅱ集熱式恒溫磁力攪拌器(江蘇金壇億通電子有限公司)；FT-IR紅外光譜儀(美國(guó)鉑金埃爾默)；凝膠滲透色譜儀(島津)；電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(PerkinElmer Nexion 300X)；ZEN3700激光粒度儀(英國(guó)馬爾文公司)；TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；TESCAN VEGA3掃描電鏡(TESCAN泰思肯貿(mào)易上海有限公司)；TecnaiG2 20透射電子顯微鏡(荷蘭FEI公司)；高級(jí)旋轉(zhuǎn)流變儀(英國(guó)馬爾文公司)；THZ-C-1臺(tái)式冷凍恒溫振蕩器(常州金壇中旺儀器制造有限公司)；真空冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；切片數(shù)字掃描儀(武漢賽維爾生物科技有限公司)；數(shù)字減影血管造影機(jī)(德國(guó)西門子)。

1.3 四碘-2-磺酸苯甲酸酐與甲基丙烯酸羥乙酯的化合物制備

精確稱取0.25g(0.36mmoL)的四碘-2-磺酸苯甲酸酐，置于100mL的無(wú)水干燥兩頸燒瓶中，以20g的四氫呋喃做溶劑，在室溫狀態(tài)下以500rpm/min的轉(zhuǎn)速攪拌混勻，再稱取0.05g(0.38mmoL)的甲基丙烯酸羥乙酯，以10g的四氫呋喃做溶劑，采用恒壓漏斗緩慢滴加在預(yù)先混勻的反應(yīng)液中，繼續(xù)反應(yīng)4h后，停止反應(yīng)，收集所得溶液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀以55℃的水浴加熱，200rpm/min的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去溶劑四氫呋喃，將剩余的固體產(chǎn)物溶解于適量純水中，稱取無(wú)水碳酸鈉0.04g(0.32mmoL)，將pH調(diào)節(jié)至中性，對(duì)固體產(chǎn)物水溶液進(jìn)行多次反復(fù)洗滌，再次旋蒸，最后使用冷凍干燥機(jī)凍干后得到熒光綠色固體粉末，放入錐形瓶中密封保存?zhèn)溆?圖1)，并利用公式計(jì)算產(chǎn)物的實(shí)際收率為72%。

圖1 四碘-2-磺酸苯甲酸酐與甲基丙烯酸羥乙酯化合物反應(yīng)原理圖

1.4 NIPAM-co-Fisa納米水凝膠的制備

精確稱取N-異丙基丙烯酰胺1.7g(15mmoL)，N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺0.03g(0.19mmoL)，2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽0.08g(0.29mmoL)，十八烷基三甲基氯化銨0.05g(0.14mmoL)，超純水140mL，溶解至250mL的三頸燒瓶中，外接冷凝回流裝置和溫度計(jì)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，然后置于油浴鍋中500rpm/min攪拌混勻至所有試劑均溶解后，升溫70℃，恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)直到溶液充分引發(fā)，觀察溶液變藍(lán)以后，稱取0.2g(0.24mmoL)四碘-2-磺酸苯甲酸酐與甲基丙烯酸羥乙酯化合物，充分溶解于10mL純水后，采用恒壓漏斗持續(xù)滴加至聚合物反應(yīng)液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)，可觀察到溶液逐漸由淡藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)槿榘孜ⅫS色，繼續(xù)反應(yīng)約4h后終止反應(yīng)。將反應(yīng)后的溶液冷卻至室溫，冷卻過(guò)程仍保持磁力攪拌，最后裝入透析袋(截留分子量為14000Da)中透析，透析介質(zhì)為超純水，透析4～5d后取出，冷凍后采用真空冷凍干燥機(jī)中凍干得到NIPAM-co-Fisa納米凝膠粉末，放入錐形瓶中密封保存(圖2)。

圖2 NIPAM-co-Fisa納米水凝膠聚合原理圖

1.5 NIPAM-co-Fisa納米水凝膠的表征方法

利用溴化鉀(KBr)壓片法，采用傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)測(cè)試納米凝膠紅外吸收官能團(tuán)，電感耦合等離子體質(zhì)譜儀對(duì)凝膠中的碘元素含量進(jìn)行測(cè)定。采用凝膠滲透色譜(島津，微型苯乙烯HR-6和HR-4柱)，以THF為流動(dòng)相，1.0mL/min的流速測(cè)定分子量。采用加速電壓100→220KV的透射電鏡和掃描電鏡分別對(duì)磷鎢酸染色的凝膠樣品以及噴金處理后的納米凝膠形貌進(jìn)行表征。利用動(dòng)態(tài)光散射粒度儀對(duì)納米凝膠的粒徑和分散性進(jìn)行表征。采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在500nm處對(duì)納米凝膠的透過(guò)率進(jìn)行表征。采用高速旋轉(zhuǎn)流變儀PP50平板，直徑50mm，設(shè)置間隙0.5mm，壓力0.05Pa，升溫范圍25℃～50℃，升溫速率1.0℃/min，頻率1.0Hz，對(duì)納米凝膠的流變性能進(jìn)行表征。

1.6 NIPAM-co-Fisa的生物相容性試驗(yàn)

選取健康成年C57BL/6J小鼠9只，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分成生理鹽水注射組、凝膠注射一周組和凝膠注射一月組，每組3只，將實(shí)驗(yàn)小鼠用0.2mL的10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，采用小動(dòng)物剃毛刀將小鼠背部約0.3cm×0.2cm的毛發(fā)剃去，充分暴露皮膚，分別抽取0.5mL的生理鹽水或NIPAM-co-Fisa水凝膠分散液，注射至小鼠背部皮膚內(nèi)，注射完畢后，可見(jiàn)皮下局部微微隆起，分別于一周、一月后處死小鼠，切開皮膚觀察水凝膠的狀態(tài)，并觀察注射部位皮膚有無(wú)炎癥、膿腫、潰爛，收集注射部位的皮膚組織，采用4%多聚甲醛固定，做病理切片HE染色分析，評(píng)估NIPAM-co-Fisa的生物相容性。

1.7 NIPAM-co-Fisa體內(nèi)腎動(dòng)脈栓塞效果評(píng)價(jià)

為探究NIPAM-co-Fisa體內(nèi)栓塞兔腎動(dòng)脈的可行性、安全性和持久性，采用3只健康新西蘭大白兔作為正常腎動(dòng)脈栓塞模型[8]，實(shí)驗(yàn)兔雌雄不限，體重2.5～3.0kg，將實(shí)驗(yàn)兔禁食、禁飲12h，稱重后，以10%水合氯醛2.5mL/mg進(jìn)行腹腔注射，待家兔麻醉后，仰臥位固定于木板上，行右側(cè)腹股溝備皮，常規(guī)無(wú)菌消毒后，用穿刺針穿刺股動(dòng)脈，引入短導(dǎo)絲，退出穿刺針外管套，引入4F血管鞘并用縫線固定，完成股動(dòng)脈插管。將預(yù)先準(zhǔn)備好的肝素化鹽水與碘海醇造影劑混合液注射至腎動(dòng)脈，觀察到“冒煙”現(xiàn)象后，再注入適量肝素化鹽水沖洗導(dǎo)管，抽取經(jīng)消毒滅菌后的NIPAM-co-Fisa凝膠水分散液1mL，連接高壓注射器開始行腎動(dòng)脈造影，利用數(shù)字減影血管造影機(jī)向兔左腎動(dòng)脈緩慢注入NIPAM-co-Fisa凝膠水分散液，見(jiàn)腎動(dòng)脈主干完全栓塞后，再行DSA復(fù)查造影。

2 結(jié) 果

2.1 NIPAM-co-Fisa水凝膠的分子量、碘含量、結(jié)構(gòu)和形貌表征

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，測(cè)試結(jié)果顯示碘元素接枝濃度占凝膠體系的2%(表1)，計(jì)算公式：

表1 ICP-MS結(jié)果

(1)

(2)

GCP凝膠滲透色譜分析結(jié)果顯示，NIPAM-co-Fisa納米凝膠的重均分子量為7118g/moL、數(shù)均分子量為3082g/moL，Z均分子量為14322g/moL(表2，圖3a)；通過(guò)FT-IR紅外光譜儀分析可知(圖3b)，3435cm-1為N-H的伸縮振動(dòng)峰；3073cm-1為C-H的伸縮振動(dòng)峰；2972cm-1、2932cm-1、2876cm-1為CH3的伸縮振動(dòng)峰；1650cm-1為強(qiáng)酰胺Ⅰ帶的C=O基伸縮振動(dòng)峰；1545cm-1為強(qiáng)酰胺Ⅱ帶的N-H彎曲振動(dòng)峰；1459cm-1為苯環(huán)骨架C=C的動(dòng)；1367cm-1、1387cm-1的雙吸收峰為異丙基的特征吸收峰[9]；1210cm-1、1063cm-1、633cm-1、529cm-1則為磺酸基的特征吸收峰[10]；974cm-1、927cm-1、882cm-1、838cm-1則為苯環(huán)的指紋取代區(qū)吸收峰[11]。綜上分析，紅外結(jié)果顯示其具備N-異丙基丙烯酰胺的基本結(jié)構(gòu)，且含有磺酸基和苯環(huán)的特征基團(tuán)，表明NIPAM-co-Fisa水凝膠已被合成上；納米激光粒度儀結(jié)果顯示(圖3c)，當(dāng)溫度在25℃時(shí)，NIPAM-co-Fisa水凝膠的平均粒徑為630.9nm，分散性為0.626，而當(dāng)溫度接近人體溫度位于37℃時(shí)，NIPAM-co-Fisa水凝膠的平均粒徑為268nm，分散性為0.529。相比25℃時(shí)的凝膠尺寸和分散性而言，37℃時(shí)的凝膠平均粒徑縮小近一半，表現(xiàn)出較強(qiáng)的溫度敏感性，主要的原因在于溫度升高，納米凝膠溶液的疏水性增強(qiáng)，出現(xiàn)了消溶脹，即收縮狀態(tài)，因此，納米凝膠粒徑就隨之減小。此外，通過(guò)掃描電鏡(圖3d)和透射電鏡圖片(圖3e)可以發(fā)現(xiàn)，NIPAM-co-Fisa水凝膠為大小較為均一的核殼球形結(jié)構(gòu)。

表2 GPC結(jié)果

a.GPC色譜圖；b.紅外光譜分析；c.不同溫度下的粒徑變化；d.SEM照片；e.TEM照片

2.2 NIPAM-co-Fisa水凝膠的溫敏特性表征

將裝有NIPAM-co-Fisa水凝膠分散液的透明玻璃瓶，置于30℃～40℃，每個(gè)溫度下穩(wěn)定放置10min，再觀察其在對(duì)應(yīng)溫度下的相應(yīng)變化(圖4a)。在30℃～34℃時(shí)，凝膠為可流動(dòng)的溶膠狀態(tài)；當(dāng)溫度位于35℃～40℃時(shí)，凝膠水分散液則變?yōu)椴豢闪鲃?dòng)的凝膠相，傾斜放置后，仍然固定在瓶底，不再流動(dòng)；此外，通過(guò)紫外分光光度計(jì)，在500nm處評(píng)估NIPAM-co-Fisa水凝膠透過(guò)率為50%的溫度，判斷NIPAM-co-Fisa的濁點(diǎn)溫度為34℃左右(圖4b)，同時(shí)，對(duì)25℃～50℃溫度下的NIAPM-co-Fisa的彈性模量(G′)和粘性模量(G″)進(jìn)行分析(圖4c)，當(dāng)G″>G′，即25℃～34.1℃時(shí)，粘性占主要部分，水凝膠表現(xiàn)為流體；而當(dāng)G″=G′，即34.1℃時(shí)，粘性和彈性模量相等，為溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變點(diǎn)；G″

a.瓶倒轉(zhuǎn)法試驗(yàn)分析；b.紫外光譜分析；c.高速旋轉(zhuǎn)流變儀分析

2.3 NIPAM-co-Fisa水凝膠的生物相容性評(píng)價(jià)

待實(shí)驗(yàn)小鼠麻醉后，剃去背部毛發(fā)，皮下注射0.5mL的生理鹽水或水凝膠，有微微隆起(圖5a)。小鼠蘇醒后繼續(xù)喂養(yǎng)一周或一月，將注射凝膠的小鼠處死切開皮膚，可見(jiàn)一塊狀凝固的凝膠與組織粘連(圖5b)，表明NIPAM-co-fisa水凝膠在注射進(jìn)小鼠皮下以后，受到體內(nèi)溫度響應(yīng)，發(fā)生溶-凝膠相轉(zhuǎn)變現(xiàn)象凝固成團(tuán)，且具有良好的穩(wěn)定性，不易降解，在喂養(yǎng)一月以后，切開小鼠皮膚，仍表現(xiàn)為彈性較好的塊狀凝膠。此外，使用4%的多聚甲醛對(duì)注射部位處的組織進(jìn)行固定，制作病理切片，通過(guò)HE染色進(jìn)行病理學(xué)分析，可以看到，注射生理鹽水組的小鼠正常組織邊界清晰，細(xì)胞核較小(圖5c)；注射水凝膠一周后的小鼠組織切片顯示，組織邊界不清、間隙增大、大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5d)；推測(cè)此時(shí)為水凝膠注射引起的急性炎癥期；而注射水凝膠一月后的小鼠存活狀態(tài)良好，組織切片則顯示經(jīng)過(guò)4周的時(shí)間，其炎癥反應(yīng)逐漸消退，炎性細(xì)胞數(shù)量減少，與正常組織形態(tài)相近(圖5e)。

a.注射水凝膠的第0d；b.注射水凝膠1月后，處死切開皮膚后的水凝膠狀態(tài)；c.正常組織HE染色；d.凝膠注射1周后病理切片HE染色；e.1月后病理切片HE染色

2.4 NIPAM-co-Fisa水凝膠的體內(nèi)腎動(dòng)脈栓塞效果評(píng)價(jià)

正常兔腎栓塞術(shù)前，先注入適量的肝素化鹽水和碘海醇造影劑混合液，通過(guò)數(shù)字減影血管造影結(jié)果可觀察到腎動(dòng)脈血管走向清晰且通暢，左腎動(dòng)脈造影可見(jiàn)“腎樹”形成(圖6a)，然后再向兔左腎動(dòng)脈緩慢注入NIPAM-co-Fisa水凝膠分散液1mL，注射的NIPAM-co-Fisa凝膠水分散體流動(dòng)性良好，數(shù)字減影血管造影顯示NIPAM-co-Fisa能較好分散至腎動(dòng)脈末梢區(qū)，且凝膠自身的溫敏特性致使其能較快出現(xiàn)溶-凝膠相轉(zhuǎn)變，隨溫度上升后逐漸鑄型并原位凝固(圖6b)，栓塞過(guò)程由腎皮質(zhì)區(qū)經(jīng)腎門區(qū)，再到腎動(dòng)脈主干，未出現(xiàn)返流現(xiàn)象。

圖6 數(shù)字減影血管造影下的兔腎動(dòng)脈栓塞

3 討 論

本研究以臨床栓塞材料面臨的缺陷問(wèn)題作為切入點(diǎn)，巧妙地將聚(N-異丙基丙烯酰胺)類水凝膠與含碘化合物接枝，制備獲得了既具有良好溫敏效應(yīng)又具有自顯影效果的NIPAM-co-Fisa水凝膠。通過(guò)研究證明，NIPAM-co-Fisa水凝膠的溫敏性良好，溶-凝膠相轉(zhuǎn)變溫度為34℃，與人體的生理溫度接近，能在體溫環(huán)境下轉(zhuǎn)變?yōu)槟虪顟B(tài)；采用C57BL/6J小鼠水凝膠注射模型模擬體內(nèi)環(huán)境，可發(fā)現(xiàn)NIPAM-co-Fisa水凝膠具有較好的穩(wěn)定性，不易降解，且生物相容性好，安全性高；采用正常兔腎動(dòng)脈栓塞模型，也進(jìn)一步證實(shí)NIPAM-co-Fisa水凝膠在體內(nèi)栓塞運(yùn)用的可行性，有望作為一種新型醫(yī)用栓塞材料運(yùn)用于動(dòng)脈栓塞治療之中。同時(shí)，其具備的自顯影效果，在實(shí)現(xiàn)栓塞的同時(shí)，也為影像學(xué)的長(zhǎng)期隨訪提供便捷，此外，它還可有效解決部分造影劑易被血液沖刷、半衰期短等問(wèn)題。后續(xù)的研究工作也將陸續(xù)深入開展，以進(jìn)一步提高含碘化合物在N-異丙基丙烯酰胺鏈上的接枝濃度，從而增強(qiáng)自顯影的效果，同時(shí)，協(xié)同負(fù)載化療藥物，采用兔VX2肝腫瘤模型，來(lái)全面評(píng)估制備的NIPAM-co-Fisa水凝膠對(duì)腫瘤血管是否也同樣具有較好的栓塞效果，并對(duì)腫瘤的缺氧壞死情況進(jìn)行系統(tǒng)分析，利用CT進(jìn)行隨訪觀察，以了解NIPAM-co-Fisa水凝膠在動(dòng)脈栓塞治療過(guò)程中的穩(wěn)定性和長(zhǎng)期顯影效果。