金科華，向念慈，劉 洋

(1.湖北科技學院醫(yī)學部基礎醫(yī)學院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學院醫(yī)學部藥學院)

正常細胞在氧氣供應充足時，采用氧化磷酸化為其提供能量。旺盛生長的腫瘤細胞即使氧氣充足，也進行旺盛的糖酵解，并為其提供ATP和合成核苷酸的原料，這一特點稱為Warburg效應[1]。糖酵解途徑的抑制劑已有良好的抗腫瘤作用[2-5]。烯醇化酶1(ENO1)是糖酵解通路的重要酶，催化2-磷酸甘油酸轉化為磷酸烯醇式丙酮酸。已發(fā)現(xiàn)ENO1在肺癌、結腸癌、卵巢癌等癌細胞中高表達[6-9]，已成為不少腫瘤細胞的診斷標志物和治療靶點[10]。抑制ENO1能干擾卵巢癌等腫瘤細胞的生長[11-12]。本研究旨在利用重組DNA技術，在原核細胞中表達和純化ENO1，為建立ENO1抑制劑篩選模型奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

ENO1 cDNA(廈門大學韓家淮院士饋贈)；質譜純引物、卡那霉素、IPTG、DNA相關操作試劑盒(生工生物工程股份有限公司)；限制性核酸內切酶(NEB公司)；大腸桿菌、DNAMarker(北京全式金生物技術公司)；DNA聚合酶、DNA連接試劑盒(TaKaRa公司)；可溶性His標簽蛋白純化試劑盒(康為世紀生物科技有限公司)；蛋白質marker(Thermo Scientific公司)；BCA蛋白質定量測定試劑盒(Bio-sharp公司)；15mL截流分子量10KD超濾管(Millipore公司)。其余試劑為國產分析純，實驗儀器略。

1.2 擴增ENO1 cDNA

用Snapgene軟件設計擴增ENO1 cDNA的上游引物PF：CACCATATGATGTCTATTCTCAAGATCCATGC；下游引物PR：ATCCTCGAGTTACTTGGCCAAGGGGTTTCTG。前三個字母是保護堿基，下劃線處分別為限制酶Nde I和Xho I位點。

將含ENO1 cDNA的菌液于37℃，260r/min培養(yǎng)24h，再按1∶100接種至含100μg/mL氨芐青霉素的LB，同法培養(yǎng)過夜，用柱式質粒小量提取試劑盒制備含ENO1 cDNA的質粒，按表1和2 PCR擴增ENO1 cDNA。擴增產物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并切膠回收純化。

表1 PCR體系

表2 PCR參數(shù)

1.3 酶切、連接與轉化

表3酶切ENO cDNA、pET-28a。用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切的cDNA、質粒pET-28a，并用試劑盒回收純化。取酶切的cDNA、pET-28a各2.5μL與5μL Solution I混合，16℃連接1h。連接產物熱激法轉化Top10感受態(tài)細胞，于含100μg/mL卡那霉素的LB平板(LBK培養(yǎng)基)篩選抗性菌落。

表3 酶切ENO1 cDNA、pET-28a及pET-28a-ENO1

1.4 鑒定重組質粒

按表3酶切重組質粒pET-28a-ENO1和空質粒pET-28a，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產物。酶切鑒定與ENO1 cDNA分子量相符的重組質粒送華大基因測序。

1.5 表達與純化ENO1

按方法1.3將pET-28a-ENO1轉化BL21(DE3)細胞，用接種針取一個單菌落接種于4mL LBK培養(yǎng)基，37℃ 260r/m培養(yǎng)過夜，作種子液。將1.5mL種子接種于150mL LBK培養(yǎng)基，平行接種兩份，37℃ 260r/m培養(yǎng)至OD600約0.7，一份加入終濃度0.2mmol/L的IPTG，另一份加蒸餾水作為對照，16℃ 260r/m培養(yǎng)24h。12 000r/min 4℃離心3min，收集菌體，稱重，按每克菌體加10mL蛋白抽提緩沖液(含1mmol/L PMSF)的比例，重懸菌體。以260W超聲10s停10s的程序，裂解菌體1h。裂解液于12 000r/min，4℃離心15min，取上清。預留120μL裂解液上清用于SDS-PAGE檢測。將上清與等體積Binding Buffer混合。向50mL離心管中加入3mL純化填料，12 000r/min，4℃離心2min，棄上清。用5倍體積的超純水重懸，洗滌殘留乙醇，12 000r/min，4℃離心2min，棄上清。重復洗滌一次。用5倍體積的Binding Buffer重懸填料，12 000r/min 4℃離心重懸的填料5min，棄上清。將混合后的上清液與填料4℃混勻10min，12 000r/min 4℃離心5min，吸走上清。20mmol/L咪唑洗滌：向離心管內加入20mL含20mmol/L咪唑的Binding Buffer，4℃混勻5min，12 000r/min 4℃離心5min，取上清，重復此步2次，合并洗滌液，記為洗滌液1。40mmol/L咪唑洗滌：同法用含40mmol/L咪唑的Binding Buffer，洗滌填料3次，合并洗滌液，記為洗滌液2。500mmol/L咪唑洗脫：用60mL含500mmol/L咪唑的Binding Buffer洗脫ENO1，合并洗脫液。

洗脫的ENO1加入截留分子量(molecular weight of cut off，MWCO)10KD的超濾管，4 000×g 4℃離心濃縮至1.5mL，加入10.5mL pH7.2的PBS稀釋濃縮液，混勻，再次離心濃縮至1.5mL，重復稀釋—濃縮步驟10次，最后將ENO1濃縮至4mL。

取濃縮后的ENO1 10μL，用PBS稀釋20倍，BCA試劑盒測定濃度。向ENO1濃縮液加入終濃度2mmol/L的PMSF，與等體積無菌甘油混勻，分裝，保存于-20℃。

1.6 SDS-PAGE鑒定表達產物

向方法1.5中預留的120μL裂解液上清、濃縮后稀釋20倍ENO1中各加入30μL 5×SDS-PAGE Loading Buffer，混勻，98℃變性10min。將蛋白Marker和誘導及未誘導的裂解液各2μL(分別與8μL 1×Loading混勻)、稀釋的ENO1 10μL上樣于SDS-PGAE膠(10%分離膠)。于80V 30min，120V 50min電泳分離。用考馬斯亮藍染色液浸泡凝膠，室溫染色30min?；厥杖旧?，用超純水洗滌，將凝膠浸泡于超純水，微波爐中煮沸脫色5min，棄脫色液。重復煮沸脫色5次，直至背景干凈，條帶清晰。

2 結 果

2.1 ENO1 cDNA的PCR擴增

PCR產物的電泳鑒定結果如圖1，泳道2中最亮條帶的分子量位于1 200～1 400bp，與ENO1 cDNA大小(1305bp)相符(2泳道)，陰性對照無擴增條帶(3泳道)，可見ENO1 cDNA擴增成功。2泳道亮帶下方有一亮度較弱的條帶為非特異性擴增產物，底部200bp左右的條帶可能為引物二聚體。

1:200bp DNA Ladder；2:ENO1 cDNA PCR產物；3:陰性對照PCR產物

2.2 重組質粒的鑒定

酶切鑒定結果見圖2，重組質粒pET-28a-ENO1和空質粒pET-28a(5369bp)經(jīng)Nde I+Xho I酶切后皆有介于5000～6000bp的條帶(2、3泳道)，前者產生的1000～2000bp小片段與ENO1 cDNA分子量(1305bp)相符(3泳道)，后者無此條帶。可見，PCR產物已重組至pET-28a質粒中。

1:1kb DNA Ladder；2:pET-28a Nde I+Xho I 酶切產物；3:pET-28a-ENO1 Nde I+Xho I 酶切產物；4:Trans2KDNA Marker

pET-28a-ENO1的測序結果如圖3所示(僅展示一部分)，DNAman軟件比對顯示連入pET-28a中的序列與ENO1 cDNA堿基序列一致，無突變。藍色下劃線序列為載體pET-28a中的Nde I位點，紅色箭頭序列為ENO1的起始密碼子編碼序列，箭頭指向ENO1 cDNA的3′端。

圖3 pET-28a-ENO1序列測定

2.3 ENO1的表達與純化

ENO1的SDS-PAGE鑒定結果如圖4。pET-28a-ENO1-BL21(DE3)經(jīng)0.2mmol/L IPTG誘導后，上清中有一豐度最高的蛋白，位于40～55Ku(3泳道)，與ENO1分子量(47Ku)一致，可知重組菌表達了可溶性ENO1。經(jīng)Ni2+純化的ENO1(4泳道紅色箭頭所示)純度高，雜帶少。ENO1經(jīng)濃縮和更換緩沖液后，濃度約為16mg/mL，故150mL菌液經(jīng)0.2mmol/L IPTG誘導后，獲得64mg純化的ENO1。由此計算，ENO1的表達量約為427mg/L。未經(jīng)IPTG誘導的菌體也有一條較濃且與ENO1分子量相近的條帶(2泳道紅色虛線箭頭所示)，疑為本底水平表達的ENO1，但未能純化到ENO1，可見此帶為大腸桿菌BL21(DE3)內源表達的其他高豐度蛋白。

1:Protein Marker;2:pET-28a-ENO1-BL21(DE3)未經(jīng)IPTG誘導的上清；3:pET-28a-ENO1-BL21(DE3)0.2mmol/L IPTG誘導后的上清;4:上清中純化的ENO1

3 討 論

本文構建了ENO1原核表達載體pET28a-ENO1。基因工程菌pET28a-ENO1-BL21(DE3)經(jīng)0.2mmol/L IPTG誘導，表達了可溶性的ENO1，經(jīng)組氨酸標簽蛋白純化試劑盒純化，ENO1產量達427mg/L。

組氨酸標簽蛋白純化試劑盒多采用調節(jié)洗滌液和洗脫液的流速來純化重組蛋白，這種操作雖然合理，但耗時長。本文用離心—取上清的方法取代上述法洗滌和洗脫重組蛋白，簡化了操作，極大縮短了純化時間，獲得了高純度的ENO1。

考馬斯亮藍染色的凝膠通常用含甲醇(或乙醇)和醋酸的脫色液來脫色，甲醇和醋酸有強烈的刺激性氣味，對操作者有害，污染環(huán)境，用量大，成本高。本文采用的水煮法脫色，無需使用任何試劑，有縮短時間、降低成本、利于環(huán)保的三重優(yōu)勢，可供同行參考。

ENO1催化2-磷酸甘油酸轉化為磷酸烯醇式丙酮酸，不易檢測的磷酸烯醇式丙酮酸可被丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)轉化為丙酮酸，同時生成ATP。在氧氣存在時，ATP和熒光素可被熒光素酶催化反應[13]，產生熒光，熒光強度與ATP濃度成正比，故可通過測定熒光強度來間接測定ENO1的酶活性。筆者正著手構建PK和熒光素酶表達載體、生產PK和熒光素酶，通過三酶偶聯(lián)法建立基于分光光度法的ENO1抑制劑篩選模型。