周小嬪，王衍廷，劉 斌

目前，顱腦創(chuàng)傷(traumatic brain injury，TBI)在全身創(chuàng)傷發(fā)病率中排第二位，是導致傷殘及死亡的主要原因，嚴重影響患者生活質(zhì)量及生存率[1]，因此，探尋TBI 后腦保護的治療方法，是提高TBI患者生存率及生存質(zhì)量的重要途徑[2，3]。近年來，腸道與心腦等重要臟器關(guān)系的相關(guān)研究越來越被人們所關(guān)注[4]。在嚴重創(chuàng)傷、感染等機體應激狀態(tài)下，腸黏膜缺血、壞死，腸道屏障功能破壞，通透性增加，出現(xiàn)腸道菌群移位，腸道細菌崩解產(chǎn)物脂多糖(lipopolyssacharide, LPS)內(nèi)毒素的主要成分進入人體血液循環(huán)，與單核-巨噬細胞及中性粒細胞通過受體相互識別，導致細胞活化，引起致炎細胞因子(TNF、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12)釋放，同時誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)合成大量的一氧化氮，隨之引起多肽類物質(zhì)-腎上腺髓質(zhì)素(adrenomdullin, AM)表達增加，誘發(fā)嚴重的循環(huán)衰竭和組織損傷，最終導致感染性休克、多器官功能障礙綜合征等，病死率極高[5]。正常機體具有一定清除LPS的能力，但是LPS過多則無法全部清除。臨床研究發(fā)現(xiàn)，LPS清除劑多黏菌素B(polymycin B, PMB)對多種炎癥有抗菌作用，在臨床上應用廣泛[5]。本研究主要探討PMB干預顱腦創(chuàng)傷后大鼠外周血腸道LPS表達變化規(guī)律，旨在對TBI后的腦保護作用及相關(guān)藥物治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取 SPF級雄性7周齡SD大鼠50只(由解放軍軍事醫(yī)學科學院動物實驗中心提供)，體重(310±15)g，進行編號和稱重，隨機分為5組，即正常組(Normal)、假手術(shù)組(Sham)、創(chuàng)傷性腦損傷組(TBI)、創(chuàng)傷性腦損+生理鹽水組(TBI+NS組)及創(chuàng)傷性腦損+多黏菌素組(TBI+PMB組)，每組10只。

1.2 材料與試劑 選取FITC-Dextran(美國，Sigma)；PMB(美國，Sigma)。電子皮質(zhì)損傷撞擊儀(electric cortical contusion impactor，eCCI)，試劑(廈門市試劑有限公司)，LS55全波長分光光度計(美國，Bio-Rad)。

1.3 模型復制 Normal組同環(huán)境下正常飼養(yǎng)。Sham組用5%水合氯醛(0.6 ml/100 g)溶液腹腔麻醉后固定于立體定向儀，頭部備皮消毒，手術(shù)刀片沿正中切開頭皮，剝脫分離骨膜，以牙科鉆在冠狀縫后5 mm、矢狀縫右側(cè)5 mm交匯處，擴大骨窗至5 mm×5 mm，保持硬膜完整。TBI組待夾尾反射出現(xiàn)后，將其固定于eCCI儀設(shè)置打擊深度4 mm，持續(xù)時間120 ms，打擊1次，速率4 m/s。正常造模后，TBI+PMB組，使用1ml注射器經(jīng)腹腔注射給予PMB溶液(2.5 μg/ml)，TBI+ NS組給予等體積生理鹽水[6]。

1.4 神經(jīng)功能缺損評分(neurological severity score，NSS) 行電子皮質(zhì)損傷撞擊儀打擊，動物完全蘇醒后，由不了解實驗分組情況、經(jīng)過專業(yè)培訓的研究人員在造模24、48 h兩個時間點參照文獻[6]神經(jīng)功能缺損評分表，對大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分。

1.5 SD大鼠急性TBI后腸道通透性的測定 取Normal組、Sham組、TBI組在造模后第3天給予FD4(0.4 mg/g)灌胃。灌胃3 h后通過頜下靜脈叢方式進行取血。將取出的外周血滴入含有EDTA抗凝劑的EP管內(nèi)，血液與抗凝劑混勻后置于冰上，配平，離心(3000 r/min, 4 ℃)20 min, 然后取血清50 μl用高壓MilliQ水稀釋，調(diào)整熒光分光光度計波長為488 nm，取100 μl稀釋后的血清檢測。利用標準曲線計算出樣品的FD4的濃度。

1.6 SD大鼠急性TBI后外周血LPS濃度測定 血漿樣品用樣品處理液稀釋10倍， 70°C水浴加熱10 min后置于冰水中冷卻待測。配制LPS標準溶液，本實驗中標準曲線的溶液濃度為0.10、0.05、0.025、0.01、0.00 EU/ml。BET水作為陰性對照。設(shè)定全波長分光光度計，設(shè)置溫育溫度為37 ℃，生物光模式，讀取波長為405 nm，提前預熱儀器30 min。之后分別溶解試劑和顯色基質(zhì)，將1.7 ml的BET水加入試劑中，用手搖動使試劑完全溶解。試劑溶解后10 min內(nèi)盡快用完。將0.1 ml BET水加入到顯色基質(zhì)中，用手搖動使顯色基質(zhì)完全溶解。溶解的顯色基質(zhì)溶液應盡快用完(無污染、4 ℃、8 h以內(nèi))。溫度37 ℃，無熱源96孔檢測板預熱5 min；依次加入50 μl BET水、LPS標準溶液或樣品；加入50 μl試劑；孵育60 min后加入顯色基質(zhì)溶液100 μl，中速振搖10 s充分混勻后，孵育6 min后，加入反應終止劑50 μl，中速振搖10 s混勻后，設(shè)置波長405 nm，自動讀取吸光度值。計錄實驗前，試驗第1、3、5、7 天 共5個時間點外周血中LPS的濃度。

1.7 SD大鼠急性TBI后HE染色結(jié)合炎癥評分的半定量測定 1周后取各組大鼠腦組織石蠟包埋，切片放在60 ℃烘箱中烘烤30 min，常規(guī)脫蠟，流水沖洗10 min后，蘇木精染色2 min。隨后用流水沖洗10 min，伊紅復染2 min，流水沖洗10 min，乙醇脫水，二甲苯兩次透明，中性樹膠封固。每張HE染色切片目標區(qū)域隨機選取5個視野，用Image Pro Plus 4.5軟件分析圖像，描記切片炎性反應區(qū)域的輪廓，得到炎癥浸潤面積的比例。腦組織炎癥評分按照表格中的方法分為0～4級，按照炎癥浸潤面積<10%、10%～25%、>25%～50%、>50%，分別記1～4分，進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能缺損NSS評分的結(jié)果 Normal組和sham組未傷及正常腦組織，神經(jīng)功能未缺損，評分正常。TBI組神經(jīng)功能出現(xiàn)明顯受損，主要表現(xiàn)為無法沿直線行走，平衡功能明顯障礙，外周感知能力下降，NSS評分均升高(P<0.01，表1)，即創(chuàng)傷性腦損傷干預明確。在24、48 h兩次測定NSS評分，結(jié)果一致。

表1 不同時間點創(chuàng)傷性腦損傷大鼠NSS評分

2.2 SD大鼠急性TBI后外周血FD4濃度的變化 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Sham組比較，TBI組外周血中FD4的濃度明顯增加[(4228±203)ng/mlvs.(2743±279) ng/ml]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Sham組與Normal組比較，外周血中FD4的濃度增高[(2743±279)ng/mlvs.(1850±80) ng/ml]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1)。

圖1 各組大鼠外周血FD4的濃度差異統(tǒng)計結(jié)果

與Sham組比較，①P<0.01；與Normal組比較，②P<0.05

2.3 SD大鼠急性TBI后外周血LPS濃度的變化 試劑終點顯色結(jié)果顯示，在基線水平，TBI組和Sham組大鼠LPS濃度差異無統(tǒng)計學意義。與基線比較，TBI組LPS濃度從術(shù)后第1天即有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，在第3天達到高峰，之后迅速下降，在第5、7天即恢復基線水平；與基線比較，Sham組各時間點LPS濃度差異無統(tǒng)計學意義。與Sham組比較，TBI組術(shù)后第3天 LPS濃度顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)，其余時間點差異無統(tǒng)計學意義。

表2 各時間點SD大鼠急性TBI后外周血LPS濃度的變化

2.4 LPS清除劑PMB減輕SD大鼠急性TBI后的LPS濃度 在基線水平上，與TBI+NS組比較，TBI+PMB組和TBI組大鼠外周血LPS濃度差異均無統(tǒng)計學意義。TBI+PMB組第3天的LPS濃度低于同一時間點TBI+NS組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，其余時間點TBI+PMB組和TBI+NS組比較差異無統(tǒng)計學意義。TBI+NS組第1天和第5天的LPS濃度低于第3天時的濃度，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，表3)。

表3 各時間點LPS清除劑PMB減輕SD大鼠急性TBI后的LPS濃度

2.5 LPS清除劑PMB可降低梗死區(qū)域炎癥反應 腦組織HE染色后鏡下可見,Sham組神經(jīng)細胞排列整齊，長度一致，胞膜完整，染色質(zhì)清楚。間質(zhì)未見明顯水腫及炎癥細胞浸潤。TBI組均可見不同程度異常神經(jīng)纖維排列紊亂，局部紅細胞及炎癥細胞浸潤，部分神經(jīng)細胞胞膜破壞，排列不規(guī)律，可見大片狀壞死區(qū)域(圖2)。TBI+NS組與TBI組炎癥反應差異無統(tǒng)計學意義，TBI+PMB組炎癥反應低于TBI+NS組(TBI+PMBvs.TBI+NS: 1.64±0.11vs.2.36±0.17,P<0.01)。

圖2 大鼠腦組織HE染色(×200)

3 討 論

研究表明，近年來有關(guān)TBI的實驗多采用電子皮質(zhì)損傷撞擊儀(eCCI)造模，均報道了TBI模型未見死亡[6]，神經(jīng)功能缺損評分有效證明此造模效果可靠。通過成功建立大鼠TBI模型，探討大鼠急性TBI后腸道菌群易位引起外周血LPS增加及LPS清除劑PMB對大鼠急性TBI后外周血炎癥反應進程的影響。結(jié)果證實，大鼠急性TBI后腸道通透性增加，進而引起外周血LPS增加；急性TBI后外周血LPS濃度呈動態(tài)變化；LPS清除劑PMB在炎癥反應初期能夠有效地抑制外周血LPS濃度，進而影響急性TBI的病理生理進程。

3.1 急性TBI后腸道通透性增加 在20世紀70年代人們就發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷及感染可引起腸黏膜通透性改變，進而導致腸道細菌及其代謝產(chǎn)物進入機體[7]，即為菌血癥或內(nèi)毒素血癥。急性TBI后腸道通透性增加，與TBI導致腸蠕動減弱、各種細胞因子、炎癥介質(zhì)的釋放等因素相關(guān)[8, 9]。其中主要是細菌及其代謝產(chǎn)物通過腸黏膜入血，LPS可使誘導一氧化氮合酶(iNOS)合成增加，產(chǎn)生大量的NO，機體的過氧化物會與NO發(fā)生反應，形成的產(chǎn)物過氧化亞硝酸鹽可通過氧化蛋白質(zhì)巰基、Fe-S中心，破壞細胞肌動蛋白骨架等方式引起腸上皮細胞屏障功能破壞，增加腸壁通透性。而且LPS還能通過與單核-巨噬細胞作用，促使其分泌更多介質(zhì)分子如TNF-α、IL-1等，再借助這些介質(zhì)分子在腸道局部發(fā)揮作用，致使腸壁通透性增加[10]。本研究使用目前國外常用的FD4作為腸道通道性的檢測物[11-13],以SD大鼠作為研究對象，利用FD4于TBI造模后第3天灌胃，取外周血檢測FD4的分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Sham組比較，在大鼠急性TBI后第3天血中FD4的濃度增加，證實急性TBI后出現(xiàn)腸道通透性增加。腸道通透性增加作為急性TBI后的一種病理生理變化，可能引起機體內(nèi)環(huán)境改變，進而對急性TBI產(chǎn)生進一步影響。同時發(fā)現(xiàn)，與Normal組比較，Sham組也出現(xiàn)了腸道通透性增加的現(xiàn)象，這說明開顱對機體來說也是一種應激，同樣會引起腸道內(nèi)的生理病理改變。

3.2 急性TBI后血漿LPS的變化 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，急性TBI后血漿LPS的濃度呈現(xiàn)一過性增高后又下降的周期性變化。腸道直接與外界環(huán)境相通，是機體內(nèi)最大的細菌及LPS聚集地。正常情況下，腸黏膜屏障具有保護作用，僅有極少量的LPS可以通過腸道黏膜進入血液，隨即迅速被肝臟的kupffer細胞清除滅活。急性TBI后腸道通透性增加，LPS大量入血，不能被有效清除而出現(xiàn)腸源性內(nèi)毒素血癥[14]。在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)，急性TBI后血漿LPS濃度呈現(xiàn)動態(tài)變化，從第1天即有升高的趨勢，第3天達到高峰，之后逐漸下降，第5、7天基本恢復基線水平；而Sham組LPS濃度無明顯動態(tài)變化。以往實驗證明LPS可快速激活全身免疫系統(tǒng)，免疫細胞活化，細胞因子和炎癥介質(zhì)大量釋放，使神經(jīng)細胞發(fā)生“再損傷”，LPS濃度越高，這種激活效應及損傷作用越重，因此TBI后針對LPS繼發(fā)性升高的治療也是TBI治療和后續(xù)康復的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。說明TBI發(fā)生后的前3 d是關(guān)鍵治療窗口，在LPS達到峰值前進行干預，可以減輕LPS介導的炎癥反應，提高TBI的治療效果。對于Sham組血漿LPS的濃度無明顯改變的情況，這可能與Sham組腸道通透性改變不同，尚未達到在血中能檢測到LPS濃度變化的程度有關(guān)。

3.3 降低急性TBI后早期炎癥反應 本研究通過HE染色結(jié)合炎癥反應評分，對TBI后炎癥反應進行半定量研究，PMB可降低TBI后早期炎癥反應；PMB作為一種抗生素，其減輕炎癥反應方面的作用非常明確，研究結(jié)果表明，PMB可能通過清除循環(huán)外周血LPS，進而降低TBI后大鼠腦組織炎癥反應，這提示PMB可能對急性TBI的治療有益。既往抗生素用于治療急性TBI的研究存在爭議，有關(guān)治療機制的研究仍不充分，其作用可能與除抗生素常規(guī)作用以外的其他生物學作用有關(guān)，比如調(diào)節(jié)中性粒細胞、單核巨噬細胞等的免疫活性[15]。McCafferty等[16]采用口服萬古霉素用于大鼠缺血再灌注模型，在排除了抗生素的直接作用后發(fā)現(xiàn)，抗生素能減少心肌梗死的面積并具有心臟保護作用。同時，應用糖皮質(zhì)激素單向抑制TBI急性期的炎癥反應，也被證明對于疾病本身的恢復作用并不明確[17]。多項研究認為，雖然急性TBI后過度的炎癥反應對長期預后不利，但單向抑制炎癥反應并不可取，炎癥反應在急性TBI后組織修復中具有“雙刃劍作用”[18，19]。

綜上所述，本研究成功地證明了大鼠急性TBI后可出現(xiàn)腸道菌群易位及外周血LPS水平一過性增加。證實LPS清除劑PMB可降低急性TBI后早期LPS濃度，降低急性TBI后腦組織炎癥反應。下一步，將繼續(xù)探討其降低炎癥反應的分子學機制。