朱偉垚，林夢婷，吳仲義，許曉晨，趙文寶，宋 漳，張清華*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院森林保護(hù)研究所，福州 350002；2.建陽區(qū)華家山毛竹采育場，福建 南平 354203）

內(nèi)生細(xì)菌普遍存在于植物中，與寄主植物形成共生、互利、共棲和營養(yǎng)共生，直接或間接促進(jìn)植物生長，提高植物對惡劣環(huán)境與病害的抵抗能力[1-7]。植物生長階段的不同會影響其內(nèi)生細(xì)菌的組成，某些內(nèi)生細(xì)菌只會在植物特定生長階段出現(xiàn)，并且隨植物生長階段的不同，其優(yōu)勢內(nèi)生細(xì)菌也不同[8-13]。內(nèi)生細(xì)菌群落組成會隨植物生長階段動態(tài)變化[14]，并且與宿主基因型相比，植物生長階段對內(nèi)生細(xì)菌的影響更加顯著。

竹子是一種高生態(tài)價值和高經(jīng)濟(jì)價值的植物，我國竹林面積有601萬hm2，其中毛竹林面積最大。毛竹（Phyllostachys heterocycla）為禾本科（Gramineae）竹亞科（Bambusoideae）剛竹屬（Phyllostachys）植物，毛竹生長迅速，1～2 a完成增粗長高過程，之后便著重細(xì)胞木質(zhì)化和細(xì)胞壁加厚方向，5 a后結(jié)束幼林期[15-17]，在毛竹幼林期（1～5 a）中，毛竹對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和積累并不是逐年遞增，而是在特定的年份集中吸收和積累某種營養(yǎng)元素[18]，而在毛竹細(xì)胞內(nèi)木質(zhì)素及其相關(guān)物質(zhì)則與竹齡呈線性相關(guān)[19]。

有關(guān)毛竹的研究主要集中在毛竹病害及其預(yù)防和治理[20-21]、土壤理化性質(zhì)[22]和不同毛竹林結(jié)構(gòu)特征及其毛竹林植物多樣性以及毛竹根際可培養(yǎng)微生物種群多樣性[23-25]等方面，對于不同竹齡的毛竹內(nèi)生細(xì)菌多樣性研究鮮有報道，研究不同竹齡內(nèi)生細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)及功能變化，對于探究毛竹與其共生菌的相互作用，毛竹的高效培育將有重要意義。隨著高通量測序的技術(shù)發(fā)展，該技術(shù)在植物內(nèi)生細(xì)菌的研究中應(yīng)用廣泛，高通量測序不需要將植物內(nèi)生細(xì)菌分離培養(yǎng)，可以直接從DNA層面對研究材料中的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行種群組成分析，相對傳統(tǒng)研究方法可以更加完整、準(zhǔn)確地展現(xiàn)植物內(nèi)生細(xì)菌的多樣性信息，彌補了由于大部分植物內(nèi)生細(xì)菌不能體外培養(yǎng)而導(dǎo)致的多樣性評價不完全的缺陷[26]。本次研究以不同竹齡的福建毛竹莖干組織為材料，通過Illumina NovaSeq進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌多樣性測序，分析各樣本物種組成、群落結(jié)構(gòu)及多樣性和內(nèi)生細(xì)菌功能，揭示毛竹莖干內(nèi)生細(xì)菌生物信息和隨時間群落演替情況，為植物內(nèi)生細(xì)菌生態(tài)功能及與植物互作機制研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

采樣地點福建省南平市華家山林場（N27°12′0.02，E117°50′21.41），采樣時間為2021年4月，選取同一片地點，生長狀態(tài)良好的1～5 a生毛竹（S1、S2、S3、S4、S5），取距離地面1m處莖干組織片，表面用75%的酒精擦拭干凈，用消毒電鋸割下月5 cm×10 cm的竹片，放入冰盒中，帶回實驗室進(jìn)一步消毒處理。每個年齡段取3棵竹子分別采樣。

1.2 材料處理

樣品表面消毒：樣本使用無菌水沖洗3 min，75%醫(yī)用酒精浸泡30 s，無菌水浸泡清洗3次，2%次氯酸鈉溶液浸泡3 min，最后使用無菌水清洗4次。使用天根高效植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。將同一竹齡的3個樣本DNA混合成一管，最終5個竹齡共5個樣本（S1、S2、S3、S4、S5）送去上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.3 高通量測序與數(shù)據(jù)處理

上海派森諾生物科技有限公司提供高通量測序服務(wù)，采用Illumina NovaSeq平臺對樣本DNA片段進(jìn)行雙端（Paired-end）測序，測序引物為正向：AACMGGATTAGATACCCKG反向：ACGTCATCCCC ACCTTCC，測序區(qū)域為16S rRNA V3～V4區(qū)域。使用QIIME2（2019.4）平臺DADA2方法進(jìn)行序列處理。調(diào)用qiime cutadapt trim-paired切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列；然后通過qiime dada2 denoise-paired調(diào)用DADA2進(jìn)行質(zhì)控、去噪、拼接和去嵌合體。得到ASVs（amplicon sequence variants）?；诩?xì)菌數(shù)據(jù)庫silva 132采用QIIME2的classify-sklearn算法進(jìn)行物種分類學(xué)注釋。

1.4 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性是指局部均勻生境下的物種在豐富度（richness）、多樣性（diversity）和均勻度（evenness）等方面的指標(biāo)，也被稱為生境內(nèi)多樣性(within-habitat diversity)[27]。Chao1代表ASV數(shù)目，Observed species代表物種指數(shù)，Chao1和Observed species指數(shù)代表群落的豐富度，值越大，豐富度越高[28]。Simpson描述從一個群落種連續(xù)兩次抽樣所得到的個體數(shù)屬于同一種的概率。Shannon來源于信息熵，香農(nóng)指數(shù)越大，表示不確定性大，Shannon和Simpson指數(shù)群落的多樣性，Shannon指數(shù)值越大，群落多樣性越高，Simpson指數(shù)范圍0～1，越接近1表示多樣性越高[29-30]。Faith′s PD指數(shù)表示群落的遺傳多樣性，值越大，遺傳多樣性越高[31]。

1.5 距離矩陣與PcoA分析及層次聚類

根據(jù)抽平后的ASV表計算Bray-Curtis距離矩陣，并對這些距離矩陣做主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis，PCoA)分析，對bray-curtis距離矩陣采用UPGMA算法（即聚類方法為average）進(jìn)行聚類分析。

1.6 功能潛能預(yù)測

基于KEGG數(shù)據(jù)庫(https://www.kegg.jp/)使用PICRUSt2進(jìn)行功能潛能分析。將各樣本測序得到的16S rRNA基因序列構(gòu)建進(jìn)化樹，使用Castor隱藏狀態(tài)預(yù)測算法，依據(jù)進(jìn)化樹中參考序列所對應(yīng)的基因家族拷貝數(shù)，推測特征序列的最近序列物種，進(jìn)而獲得其基因家族拷貝數(shù)。結(jié)合各樣本特征序列的豐度，計算各樣本的基因家族拷貝數(shù)。最后，將基因家族“映射”到KEGG數(shù)據(jù)庫中，默認(rèn)使MinPath推斷代謝通路的存在，進(jìn)而獲得各樣本中代謝通路的豐度數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列數(shù)據(jù)處理與評價

對所有樣本有效序列進(jìn)行拼接，去除嵌合體和singleton后的序列量為473 959，不同竹齡的樣品最終的序列reads數(shù)量分別是108 663、99 655、86 821、93 434和85 386。序列長度分布為322～384 bp，大多數(shù)分布在378 bp中。使用DADV2進(jìn)行序列處理，不以序列相似度聚類，只進(jìn)行去重（相當(dāng)于以100%序列相似度聚類），生成ASV單元。5個樣本共得到5 524個ASVs。1～5 a生毛竹莖干的ASV數(shù)量分別是127、800、1 522、1 513和 1 562，3～5 a生（S5）之間的毛竹莖干樣本ASVs數(shù)量比其他樣本明顯增多，并且2 a生毛竹與1 a生毛竹莖干樣本ASV數(shù)量差異顯著（P=0.001）。

Chao1、Faith′s PD、Observed species、Shannon和Simpson的稀疏曲線（圖1A-E）表明，隨著測序深度的增加即抽樣數(shù)的增加，Chao1、Faith′s PD、Observed species、Shannon和Simpson指數(shù)已經(jīng)平緩，說明更多的測序量并不會對群落豐富度、多樣性、遺傳多樣性和均勻度有影響，所以基于現(xiàn)有測序數(shù)據(jù)得到的分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

圖1 稀疏曲線Figure 1 Rarefaction curves

2.2 群落物種組成分析

2.2.1 不同竹齡毛竹內(nèi)生細(xì)菌群落物種數(shù)量

不同竹齡的毛竹莖干內(nèi)生細(xì)菌群落物種數(shù)量不同，1 a生的毛竹（S1）莖干中各分類地位的細(xì)菌群落物種數(shù)量均少于其他竹齡的毛竹（表1）。從門到屬之間，1 a生毛竹莖干中所含種類數(shù)量最少，只有4門6綱12目23科33屬，4 a生毛竹莖干所含種類最多，有19個門30綱70目102科194屬，3～5 a生之間在科及以上分類單元上數(shù)量差異不明顯（表1）。

表1 不同竹齡毛竹莖干內(nèi)生細(xì)菌分類單元群落組成Table 1 Community composition of endophytic bacterial taxa in the stems of Phyllostachys edulis at different ages

2.2.2 不同竹齡毛竹內(nèi)生細(xì)菌群落組成及優(yōu)勢種群

所有樣本內(nèi)生細(xì)菌共包含21個門，在各個竹齡毛竹莖干內(nèi)生細(xì)菌中，變形菌門（Proteobacteria）均為其優(yōu)勢門（圖2A）。在各樣本中所占相對豐度為76.93%、73.73%、59.77%和53.35%。厚壁菌門（Firmicutes）在樣本中相對豐度僅次于變形菌門，分別為0.8%、14.58%、15.26%、28.73%和33.62%；

在綱水平上（圖2B），所用樣本共注釋到41的綱，1 a生和5 a生樣本相對豐度最高的綱為γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria），相對豐度分別為96.67%和43.21%。2～4 a生樣本中相對豐度最高的綱均為α-變形菌綱（Alphaproteobacteria），相對豐度為59.42%、64.46%和50.16%。

在屬水平上（圖2C），所有樣本一共注釋到337個屬，不同年竹齡毛竹莖干內(nèi)生細(xì)菌群落組成與相對豐度有明顯差異，1 a生毛竹（S1）莖干內(nèi)生細(xì)菌鑒定到34個屬，其中相對豐度最高是歐文氏菌屬（Erwinia），相對分度78.18%，也是該樣本中唯一的優(yōu)勢菌群，其他菌群相對分度均小于1.00%（圖2 S1），2 a生毛竹（S2）莖干內(nèi)生細(xì)菌鑒定到157個屬，優(yōu)勢菌群是蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、鏈球菌屬（Streptococcus）、根瘤菌科多個屬（GenusofRhizobiaceae）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）和水小桿菌屬（Aquabacterium），相對豐度別為22.49%、7.99%、5.72%、5.35%和5.09%。3 a生毛竹（S3）莖干內(nèi)生細(xì)菌鑒定到222個屬，優(yōu)勢菌群是蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）和根瘤菌科多個屬（GenusofRhizobiaceae），相對分度分別為30.97%和5.26%，除此之外，相對豐度＞1.00%的菌群有甲基桿菌屬（Methylobacterium）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、鏈球菌屬（Streptococcus）、梭菌屬（Clostridium）、水小桿菌屬（Aquabacterium）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、德沃斯氏菌屬（Devosia）和Pseudolabrys，相對豐度分別為 4.83%、2.03%、1.90%、1.86%、1.80%、1.80%、1.70% 和1.19%。4 a生毛竹（S4）莖干內(nèi)生細(xì)菌鑒定到224個屬，優(yōu)勢菌群是蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）和梭菌屬（Clostridium），相對豐度為22.30%和6.53%。除此之外相對豐度＞1.00%有根瘤菌科多個屬（GenusofRhizobiaceae）、鏈球菌屬（Streptococcus）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、Terrisporobacter、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、德沃斯氏菌屬（Devosia）、勞爾氏菌屬（Ralstonia）和普氏菌屬（Prevotella），相對豐度分別為 4.50%、4.37%、2.71%、1.85%、1.63%、1.36%、1.29%和1.21%。5 a生毛竹(S5)莖干內(nèi)生細(xì)菌鑒定到195個屬，優(yōu)勢菌群是歐文氏菌屬（Erwinia）、梭菌屬（Clostridium）和泛菌屬（Pantoea），相對豐度分別為25.91%、14.59%和5.39%。除此之外相對豐度＞1.00%的有黃桿菌屬（Flavobacterium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、Terrisporobacter、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、密螺旋體屬（Treponema）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、Christensenellaceae_R-7_group、鏈球菌屬（Streptococcus）和Lachnospiraceae，相對豐度分別為 4.46%、4.32%、3.48%、2.65%、2.04%、1.89%、1.75%、1.67%、1.42%和1.15%。

圖2 各樣本內(nèi)生細(xì)菌在門（A）、綱（B）和屬（C）水平上的相對豐度Figure 2 Relative abundance of endophytic bacteria at phylum(A),class(B)and genus(C)levels in each sample

2.3 Alpha多樣性指數(shù)

多樣性指數(shù)分析（表2）顯示，內(nèi)生細(xì)菌群落豐富度（Chao1和Observed species）最高是5 a生毛竹（S5）莖干，群落豐富度最低為1 a生（S1）毛竹莖干。4 a生（S4）毛竹莖干內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性最該，Shannon和Simpson指數(shù)分別為7.009和0.943，最低同樣為內(nèi)生細(xì)菌種類多樣性，Simpson指數(shù)僅為0.415，未超過0.5。在群落遺傳多樣性（Faith′s PD指數(shù)）中最高是5 a生毛竹莖干，最低是1 a生毛竹莖干。在群落均勻度中最高的是4 a生毛竹莖干，最低的是1 a生毛竹莖干。在群落物種覆蓋度（Good′s coverage指數(shù)）中最高的是1 a生毛竹莖干，最低的是4 a生。除群落物種覆蓋度外，1 a生毛竹莖干在其他各方面均為最低。

表2 不同竹齡毛竹莖干內(nèi)生細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)分析Table 2 Analysis of Alpha diversity index of endophytic bacteria in Phyllostachys edulis stems of different ages

2.4 主成分分析與層次聚類

從PCoA分析圖（圖3A）可以得到主坐標(biāo)分析1（PCoA1）和主坐標(biāo)分析2（PCoA2）的樣品差異性貢獻(xiàn)率分別為66.9%和21.3%，合計為88.2%，是差異的主要來源。2 a生（S2）與3 a生（S3）毛竹莖干內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性差異最小，其次二者與4 a生（S4）差異較小，1 a生（S1）和5 a生（S5）毛竹莖干內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性差異較大，分別位于第二象限與第三象限。從層次聚類分析（圖3B）中看到，其中2 a生（S2）和3 a生（S3）聚在一起，并且與4 a生（S4）比較接近，1 a生與5 a生與其他竹齡距離遠(yuǎn)。

圖3 PcoA分析與層次聚類分析Figure 3 PcoA analysis and hierarchical clustering analysis

2.5 ASV venn圖與共有物種分析

對所有樣本ASV豐度情況進(jìn)行venn圖分析（圖4A），結(jié)果表面5個竹齡毛竹莖干樣本中共有的物種數(shù)量為24，各樣本獨有物種數(shù)量分別為67、479、1 065、992和1 196。共有物種基于屬水平注釋到16個屬，樣本總相對豐度＞1.00%分別為蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、根瘤菌科多個屬（GenusofRhizobiaceae）、鏈球菌屬（Streptococcus）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、水小桿菌屬（Aquabacterium）、Terrisporobacter、勞爾氏菌屬（Ralstonia）、柄桿菌屬(Caulobacter)、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、新鞘脂菌屬(Novosphingobium)、Pseudolabrys（圖4B）。各樣本獨有屬的物種相對豐度均在1.00%以下。

圖4 各樣本中內(nèi)生細(xì)菌venn圖與共有物種分析Figure 4 The venn diagram and common genus analysis

2.6 功能潛能預(yù)測

從KEGG一級功能預(yù)測結(jié)果中看出各竹齡毛竹莖干內(nèi)生菌功能有所差異，KEGG分析中1 a生毛竹（S1）樣本中內(nèi)生細(xì)菌在環(huán)境信息處理中相對豐度要比其他竹齡樣本高，而在新陳代謝、遺傳信息處理和細(xì)胞進(jìn)程則相反。遺傳信息處理和生物體系統(tǒng)最高為5 a生樣本，2、3和4 a生在各類通路中有著相似的豐度水平。

表3 不同竹齡毛竹莖干內(nèi)生細(xì)菌KEGG代謝通路分析Table 3 Analysis of KEGG metabolic pathways of endophytic bacteria in the stems of Phyllostachys edulis at different ages

在二級功能結(jié)果中取相對豐度前25繪制功能熱圖，從圖5中發(fā)現(xiàn)5個樣本的功能集中在代謝與降解方面，其中關(guān)于碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism）的相對豐度最高，氨基酸代謝（amino acid metabolism）、輔助因子和維生素的代謝（metabolism of cofactors and vitamins）和萜類化合物和聚酮類化合物的代謝（metabolism of terpenoids and polyketides）也具有較高的相對豐度。2～4 a生樣本中外源生物降解與代謝（xenobiotics biodegradation and metabolism）、其他氨基酸的代謝（metabolism of other amino acids）和脂質(zhì)代謝（lipid metabolism）有著一定的相對豐度，而這些功能在1 a生和5 a生樣本中有著明顯下降，這表示1 a生與5 a生毛竹在抵抗外界影響的能力不如其他竹齡樣本。

圖5 二級功能預(yù)測熱圖Figure 5 Secondary function prediction heatmap

3 討論

毛竹幼林（1～5 a）生長速率較快，新竹長成后便不再進(jìn)行干形生長，一般生長3～4 a后便可采伐利用，與木材的十幾年甚至幾十年的生長期相比有著巨大優(yōu)勢。因此，關(guān)于毛竹撫育和材質(zhì)方面的研究頗多。植物在不同的生長階段其內(nèi)部環(huán)境差異明顯，內(nèi)生細(xì)菌所處的生長環(huán)境在不斷變化，環(huán)境的變化促使內(nèi)生細(xì)菌群落不斷演替更新。關(guān)于毛竹不同生長階段內(nèi)生細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)變化尚未見研究報道。本次研究不同竹齡的毛竹莖干內(nèi)生細(xì)菌的多樣性，發(fā)現(xiàn)在不同分類水平上，各個竹齡內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢種群與豐度信息有顯著差異，在內(nèi)生細(xì)菌的豐富度與竹齡呈現(xiàn)正相關(guān)，且在內(nèi)生細(xì)菌多樣性會隨著竹齡增加逐漸升高，但在到達(dá)第5年時卻出現(xiàn)下降的趨勢，在內(nèi)生細(xì)菌差異上2～4 a生毛竹莖干樣本差異較小，2 a生與3 a生之間內(nèi)生細(xì)菌群落相似度極高，分析可能的因素，1～4 a毛竹生長活躍，合成大量的碳水化合物，這些物質(zhì)可為內(nèi)生菌的生長提供充足的養(yǎng)分，而在5 a后，毛竹生長減緩，木質(zhì)素積累，內(nèi)生菌生長受到一定的抑制作用。這樣的變化，在內(nèi)生細(xì)菌功能上也同樣存在，2～4 a生竹竿內(nèi)生細(xì)菌的生物學(xué)功能表現(xiàn)出來相似的結(jié)果，2～4 a生樣本中外源生物降解與代謝、其他氨基酸的代謝和脂質(zhì)代謝相對分度較高，這與1 a生和5 a生的竹竿中內(nèi)生細(xì)菌功能差別較大，這同樣表示1 a生與5 a生毛竹在抵抗外界影響的能力不如其他竹齡樣本。

在本次研究發(fā)現(xiàn)，歐文氏菌屬和蒼白桿菌屬在樣本中占據(jù)優(yōu)勢地位，對毛竹生長的影響占據(jù)主導(dǎo)作用。并且蒼白桿菌屬只發(fā)現(xiàn)在毛竹莖干組織中分布，在對武夷山一度（1 a生）毛竹不同部位的內(nèi)生細(xì)菌研究生中，同樣只在莖干部位中發(fā)現(xiàn)蒼白桿菌屬，并且也是屬于該樣本中的優(yōu)勢菌屬，而在根、鞭、葉以及根際土壤中并未發(fā)現(xiàn)蒼白桿菌屬有明顯分布的情況[32-33]。該菌屬在水稻、棉花和葡萄等常見在作物組織中也被發(fā)現(xiàn)，并在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)其不會對宿主植株造成病害，反而發(fā)現(xiàn)其有一定的抗病能力[34-36]。與武夷山一度毛竹莖干內(nèi)生細(xì)菌不同的還有鏈球菌屬根瘤菌科的一些屬在樣本中屬于優(yōu)勢菌屬，但在以往研究中卻未被發(fā)現(xiàn)，說明傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法有很大弊端，毛竹體內(nèi)還有大量內(nèi)生細(xì)菌未被分離出來進(jìn)行研究。在1 a生和5 a生毛竹莖干中豐度占比最大的是歐文氏菌屬，此菌屬在毛竹其他部位的內(nèi)生細(xì)菌研究中均未報道，歐文氏菌屬是常見植物病原菌，但同時也有促生抗病能力的報道[37]，歐文氏菌只在特定竹齡的毛竹莖干中分布，可能與毛竹莖干內(nèi)部環(huán)境的不同有關(guān)，毛竹前期生長迅速，莖干內(nèi)有較大差異，導(dǎo)致歐文氏菌屬的定殖效率所有變化，從而導(dǎo)致其相對豐度產(chǎn)生變化。

毛竹莖干中的內(nèi)生細(xì)菌與其他部位有著明顯差異，在毛竹根部以芽孢桿菌為主，鞭部以節(jié)細(xì)菌屬為主。在毛竹根部更多分布的是芽孢桿菌、假單胞菌這種有著固氮促生抗病的細(xì)菌群落，這些細(xì)菌的富集和根部在植物所承擔(dān)的功能有關(guān)，但這些菌屬均未在莖干中有明顯分布。毛竹莖干內(nèi)生細(xì)菌的分布和生長發(fā)育造成的內(nèi)生細(xì)菌群落演替以及外部細(xì)菌選擇性定殖在植株特定部位這些現(xiàn)象是受到哪些因素影響，還需后續(xù)進(jìn)一步的研究。