王 帆，楊 梅，陳章銘，楊 樺*，楊 偉，黃 瓊

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院/四川省林業(yè)生態(tài)工程省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130；2.四川省南江縣林業(yè)局，四川 南江 635600）

長足大竹象Cyrtotrachelus buquetiGuerin-Meneville，又名竹橫錐大象，是我國叢生竹的主要鉆蛀性害蟲[1]，主要分布于我國長江以南的地區(qū)以及越南、緬甸、泰國等東南亞國家[2-3]。長足大竹象寄主廣泛，以幼蟲蛀食危害箣竹屬Bambusa、綠竹屬Dendrocalamopsis、牡竹屬Dendrocalamus等28 個(gè)竹種的竹筍，幼蟲生長速度快、危害性極強(qiáng)、隱蔽性高以至于防治困難[4]。近年來，由于國家實(shí)施天然林保護(hù)工程，大力發(fā)展經(jīng)濟(jì)林，禁止砍伐樹木，以竹代木已經(jīng)成為造紙?jiān)习l(fā)展的趨勢。在四川長足大竹象是制約竹林經(jīng)濟(jì)發(fā)展的主要因素之一[5]。而王嘉雯等[6]利用Matlab分析了長足大竹象的發(fā)生規(guī)律以及全球氣候變暖條件下適生區(qū)的變化，進(jìn)一步闡述了對其防治的重要性。

昆蟲生長調(diào)節(jié)劑(insect growth regulators,IGR’s)是一類以破壞昆蟲正常生長發(fā)育或生殖作用，達(dá)到控制害蟲發(fā)生的仿生合成殺蟲劑[7]。此類藥劑因其毒性低、污染少和對害蟲的天敵影響小，符合害蟲綜合治理及農(nóng)林業(yè)持續(xù)發(fā)展的要求。目前根據(jù)其不同的作用方式以及化學(xué)結(jié)構(gòu)分為保幼激素類似物、幾丁質(zhì)合成抑制劑和蛻皮激素類似物3個(gè)大類[8]?，F(xiàn)已廣泛用于防治農(nóng)林、衛(wèi)生和畜牧業(yè)害蟲，如韭菜遲眼蕈蚊Bradysia odoriphaga、杜鵑冠網(wǎng)蝽Stephanitis pyrioides和麥蛾繭蜂Habrobracon hebetor等[7,9-13]。但是，目前昆蟲生長調(diào)節(jié)劑在防治蛀干害蟲方面的研究很少，因此，本試驗(yàn)測定了昆蟲生長調(diào)節(jié)劑中的幾丁質(zhì)合成抑制劑氟鈴脲，保幼激素類似物吡丙醚與昆蟲蛻皮激素類似物甲氧蟲酰肼對長足大竹象兩個(gè)齡期幼蟲的毒力、溫度效應(yīng)和相關(guān)酶活性測定，旨在為長足大竹象的治理和叢生竹安全生產(chǎn)提供理論和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 供試蟲源

在2018年8月上旬長足大竹象Cyrtotrachelus buquetiGuerin-Meneville成蟲產(chǎn)卵期，于四川省蘆山縣思延鄉(xiāng)銅頭村(102°91′E，30°13′N)慈竹林采集蟲卵。帶回實(shí)驗(yàn)室，在培養(yǎng)皿(Φ=10 cm)中進(jìn)行人工孵化，初孵幼蟲轉(zhuǎn)置筒形牙簽盒內(nèi)(Φ=5 cm;H=10 cm)，以新鮮慈竹筍為飼料單頭飼養(yǎng)。人工氣候箱溫度為(28±1)℃、相對濕度(70±10)%，黑暗飼養(yǎng)。

1.2 供試藥劑

97.5%氟鈴脲(hexaflumuron)原藥、95.3%吡丙醚(pyriproxyfen)原藥、98.6%甲氧蟲酰肼(methoxyfenozide)原藥（均購自武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司，中國武漢）；99.5%丙酮分析純（成都市科龍化工試劑廠，中國成都）；考馬斯亮藍(lán)G-250，磷酸緩沖液PB，以及過氧化物酶(POD)，超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，乙酰膽堿酯酶(AchE)靶標(biāo)酶和羧酸酯酶(CarE)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，中國北京）。

1.3 藥劑對長足大竹象幼蟲的毒力測定

采用飼喂法，分別測定氟鈴脲、吡丙醚和甲氧蟲酰肼對長足大竹象2齡和4齡幼蟲的毒力(長足大竹象幼蟲共5個(gè)齡期，2齡為低齡組，4齡為高齡組)。每種供試藥劑均用丙酮溶液稀釋成5個(gè)濃度(低齡組：2.5、5、10、20和40 mg/L；高齡組：10、20、40、80和160 mg/L)，分別以丙酮溶液和蒸餾水作為對照，每個(gè)濃度重復(fù)3次。每處理濃度挑取2齡和4齡幼蟲各20頭，分別放入筒形牙簽盒內(nèi)(Φ=5 cm;H=10 cm)。將配好的藥液浸漬慈竹筍Neosinocalamus affinis10 min，自然晾干后放入盒內(nèi)作為飼料，并放入人工氣候箱中，溫度(28±1)℃、相對濕度(70±10)%，黑暗飼養(yǎng)。處理后1～7 d，每天統(tǒng)計(jì)幼蟲存活數(shù)，并計(jì)算各藥劑的毒力回歸方程及LC50。

1.4 藥劑對4齡幼蟲毒力的溫度效應(yīng)測定

采用飼喂法，將藥劑原藥稀釋成系列濃度，處理方法同1.3。處理后分別置于溫度為(22±1)、(24±1)、(26±1)、(28±1)、(30±1)和(32±1)℃，相對濕度(70±10)%的人工氣候箱中，黑暗飼養(yǎng)。每個(gè)溫度對應(yīng)5種濃度，每處理分別挑取4齡幼蟲20頭，重復(fù)3次，以丙酮溶液和蒸餾水作為對照。每天更換浸漬藥液的慈竹筍，記錄7 d后幼蟲存活數(shù)，并計(jì)算各藥劑在不同溫度下的毒力回歸方程及LC50。

1.5 酶液制備

采用飼喂法，挑選出大小一致的4齡幼蟲，用3種昆蟲生長調(diào)LC50的濃度浸泡的慈竹筍10 min后進(jìn)行飼喂，蒸餾水為對照，飼養(yǎng)方法同1.3。參照高歡歡等[14]和武海斌等[15]的酶液提取法，分別處理1、2、3、4和5 d后，收集每個(gè)處理存活的蟲體稱重后置于6 cm研缽中，加入1 mL PB(0.05 mol/L，pH 7.0)和少量石英砂，冰浴充分研磨，混勻，在超速冷凍離心機(jī)8 000 r/min 4℃離心10 min。取上清液分裝入0.5 mL的Eppendorf離心管中，-80℃保存?zhèn)溆?，用于POD、SOD和GSTs活性測定，每處理重復(fù)3次。

參照任學(xué)祥等[16]的AchE酶液和徐偉等[17]的CarE酶液提取方法，分別于處理1、2、3、4和5 d后，收集每個(gè)處理存活的蟲體稱重后置于6 cm研缽中，加入1 mL PB(0.05 mol/L，pH 7.0)和少量石英砂，冰浴充分研磨，混勻，在超速冷凍離心機(jī)15 000 r/min 4℃離心10 min，取上清液作為酶液，每處理重復(fù)3次。

1.6 酶活性測定

POD、SOD、GSTs、AchE和CarE酶活性的測定均嚴(yán)格按照試劑盒中的說明進(jìn)行檢測。酶活性值根據(jù)試劑盒說明書中的公式進(jìn)行計(jì)算。POD、SOD、GSTs、AchE和CarE酶活性測定波長分別為470、560、340、412和450 nm。POD活性單位定義為每克組織蛋白在每1 mL反應(yīng)體系中每分鐘470 nm吸光值變化0.01為一個(gè)酶活力單位；SOD活性單位定義為每克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中抑制率為50%時(shí)所需的酶量為一個(gè)酶活力單位；GSTs活性單位定義為在25℃下，每克樣品每分鐘催化1 μmol還原性谷胱甘肽與2,4-二硝基苯結(jié)合為一個(gè)酶活性單位；AchE活性單位定義為每克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol 5-巰基硝基苯甲酸的酶量為一個(gè)酶活力單位；CarE活性單位定義為在37℃下，每1mL反應(yīng)體系中每克組織鮮重每分鐘催化吸光值增加1定義為一個(gè)酶活力單位。

蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度用考馬斯亮藍(lán)(G-250)法進(jìn)行測定[18]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件計(jì)算毒力回歸方程及LC50值，GraphPad Prism 6進(jìn)行制圖。對POD、SOD、GSTs、AchE和CarE活性采用單因素方差分析，處理與對照間采用配對t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 昆蟲生長調(diào)節(jié)劑對兩個(gè)齡期幼蟲的毒力

3種昆蟲生長調(diào)節(jié)劑對長足大竹象2齡幼蟲的毒力大小為甲氧蟲酰肼＞氟鈴脲＞吡丙醚，而對4齡幼蟲的毒力為吡丙醚＞甲氧蟲酰肼＞氟鈴脲。2齡幼蟲處理24 h，甲氧蟲酰肼LC50為28.13 mg/L。4齡幼蟲處理中，吡丙醚LC50為111.55 mg/L。3種供試藥劑對2齡幼蟲的毒力均大于對4齡幼蟲的毒力，即2齡幼蟲對藥劑更敏感。其中，氟鈴脲對2齡和4齡幼蟲的毒力差異達(dá)到11.95倍，幼蟲齡期對藥劑毒性效果的影響最大(表1)。

表1 3種昆蟲生長調(diào)節(jié)劑對長足大竹象不同齡期幼蟲的毒力比較Table 1 Toxicity of five kinds of IGRs to different instars of Cyrtotrachelus buqueti

2.2 3種藥劑對4齡幼蟲致毒的溫度效應(yīng)

氟鈴脲在22℃時(shí)對長足大竹象4齡幼蟲的LC50最大，為755.80 mg/L，而28℃最小，為294.11 mg/L；吡丙醚也在28℃時(shí)LC50最小，71.51 mg/L，32℃時(shí)LC50最大，175.68 mg/L；根據(jù)實(shí)驗(yàn)溫度的不同，甲氧蟲酰肼的LC50變化差異不明顯(表2)。

表2 不同溫度下3種昆蟲生長調(diào)節(jié)劑對長足大竹象4齡幼蟲的毒力比較Table 2 Toxicity of three insecticides to the 4thinstar larvae of C.buqueti at different temperature

2.3 3種藥劑對4齡幼蟲體內(nèi)抗氧化酶的影響

2.3.1 POD活性

由圖1可知，經(jīng)甲氧蟲酰肼處理后的POD活性只在第5天顯著高于對照(P＜0.05)；在不處理間比較中，第5天的POD活性顯著高于其余4個(gè)時(shí)間段(P＜0.05)。

圖1 3種生長調(diào)節(jié)劑亞致死劑量下長足大竹象4齡幼蟲體內(nèi)POD的活力變化Figure 1 Dynamics of POD activities in 4thinster larvae of C.buqueti treated with sublethal doses of three insect growth regulators

經(jīng)氟鈴脲處理后的POD活性只在第4天的顯著低于對照(P＜0.05)；在不同處理間比較中，第1天和第2天的POD活性顯著高于其余3個(gè)時(shí)段(P＜0.05)。

吡丙醚處理后的POD活性都顯著高于對照(P＜0.05)；在不同處理間比較中，第5天的POD活性顯著高于其余4個(gè)時(shí)段(P＜0.05)

2.3.2 SOD活性

3種生長調(diào)節(jié)劑亞致死濃度在對4齡幼蟲的SOD活性影響中(圖2)，經(jīng)甲氧蟲酰肼、氟鈴脲和吡丙醚處理后的SOD活性均只在第5天顯著低于對照(P＜0.05)。而在不同處理間比較中，甲氧蟲酰肼、氟鈴脲和吡丙醚均是第1天的SOD活性顯最高。甲氧蟲酰肼和氟鈴脲第1天、第2天差異不顯著(P＞0.05)。

圖2 3種生長調(diào)節(jié)劑亞致死劑量下長足大竹象4齡幼蟲體內(nèi)SOD的活力變化Figure 2 Dynamics of SOD activities in 4thinster larvae of C.buqueti treated with sublethal doses of three insect growth regulators

2.4 3種藥劑對4齡幼蟲體內(nèi)解毒酶活性的影響

2.4.1 AchE活性

由圖3可知，經(jīng)甲氧蟲酰肼、和氟鈴脲處理后的AchE活性均顯著高于對照(P＜0.05)。在不處理間比較中，甲氧蟲酰肼是第1天的AchE活性顯著高于其余4個(gè)時(shí)間段(P＜0.05)，而氟鈴脲在不同處理間比較中差異不顯著(P＞0.05)。

圖3 3種生長調(diào)節(jié)劑亞致死劑量下長足大竹象4齡幼蟲體內(nèi)AchE的活力變化Figure 3 Dynamics of AchE activities in 4thinster larvae of C.buqueti treated with sublethal doses of three insect growth regulators

吡丙醚處理后的AchE活性只在第3天顯著低于對照(P＜0.05)；在不同處理間比較中，第5天的AchE活性顯著高于其余4個(gè)時(shí)段(P＜0.05)。

2.4.2 CarE活性

由圖4可知，經(jīng)甲氧蟲酰肼和氟鈴脲處理后的CarE活性均顯著低于對照(P＜0.05)。在不同處理間比較中，甲氧蟲酰肼是第1天的CarE活性顯著高于其余4個(gè)時(shí)間段(P＜0.05)，而氟鈴脲是第4天的CarE活性顯著高于其余4個(gè)時(shí)間段(P＜0.05)。

圖4 3種生長調(diào)節(jié)劑亞致死劑量下長足大竹象4齡幼蟲體內(nèi)CarE的活力變化Figure 4 Dynamics of CarE activities in 4thinster larvae of C.buqueti treated with sublethal doses of three insect growth regulators

吡丙醚處理后的CarE活性在第3天和第4天顯著高于對照(P＜0.05)；在不同處理間比較中，第4天和第5天的CarE活性顯著高于其余3個(gè)時(shí)段(P＜0.05)。

2.4.3 GSTs活性

由圖5可知，經(jīng)甲氧蟲酰肼處理后的GSTs活性都顯著高于對照(P＜0.05)；在不處理間比較中，第5天的GSTs活性最高，但與第4天差異不顯著(P＞0.05)。

圖5 3種生長調(diào)節(jié)劑亞致死劑量下長足大竹象4齡幼蟲體內(nèi)GSTs的活力變化Figure 5 Dynamics of GSTs activities in 4thinster larvae of C.buqueti treated with sublethal doses of three insect growth regulators

經(jīng)氟鈴脲處理后的GSTs活性在第3天和第4天的顯著低于對照(P＜0.05)；在不同處理間比較中，第1天和第5天的GSTs活性顯著高于其余3個(gè)時(shí)段(P＜0.05)。

經(jīng)吡丙醚處理后的GSTs活性都顯著高于對照(P＜0.05)；但在不處理間比較中差異不顯(P＞0.05)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3種昆蟲生長調(diào)節(jié)劑對長足大竹象2齡幼蟲的毒力都較高，最高的是蛻皮激素類似物甲氧蟲酰肼，毒力倍數(shù)為保幼激素類似物吡丙醚的2.25倍。而甲氧蟲酰肼以其獨(dú)特的作用機(jī)制，良好的防治效果，已成為替代有機(jī)磷和擬除蟲聚酯類殺蟲劑，防治蔬菜以及其他農(nóng)作物、林業(yè)上多種害蟲的理想藥劑[19-21]。但是3種藥處理2齡幼蟲得到的半致死濃度均小于處理4齡幼蟲的半致死濃度，氟鈴脲和處理2、4齡幼蟲半致死濃度相差最大，為11.95倍，表明幼蟲齡期對毒力的影響較大。

殺蟲劑對受體的毒力，不僅取決于藥劑本身與受體之間內(nèi)在的特殊關(guān)系，還與環(huán)境條件等因素密切相關(guān)，其中溫度是重要的因子之一[22]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，長足大竹象4齡幼蟲對氟鈴脲和吡丙醚的敏感度受溫度的影響程度較大，并在28℃時(shí)的敏感度達(dá)到了最大值，而對甲氧蟲酰肼的敏感度受溫度變化的影響較小。

在藥物的作用下，昆蟲體內(nèi)會產(chǎn)生一類可代謝藥劑與其他有毒物質(zhì)的酶[23]。昆蟲對藥物抗性的作用機(jī)制之一是相關(guān)的酶活力顯著升高，或某些酶活性降低，使其解毒代謝能力增強(qiáng)而對殺蟲劑形成抗性[24-25]，而涉及代謝抗性的保護(hù)、解毒酶主要包括乙酰膽堿酯酶(AChE)靶標(biāo)酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、羧酸酯酶(CarE)和過氧化物酶(POD)等[25]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在LC50濃度下氟鈴脲對長足大竹象4齡幼蟲體內(nèi)GST活性是激活-抑制-激活的趨勢，對AChE活性，從處理的第1天到第5天，一直處于激活狀態(tài)，但對CarE活性則是抑制；甲氧蟲酰肼對體內(nèi)幼蟲GST和AChE活性的影響表現(xiàn)出激活的狀態(tài)，但對CarE則是表現(xiàn)出抑制效果；吡丙醚對體內(nèi)GSTs是激活的狀態(tài)，對AchE則是先激活，在處理3 d時(shí)為轉(zhuǎn)折再抑制，再激活的狀態(tài)，而對CarE活性表現(xiàn)為抑制-激活-抑制的趨勢。說明保護(hù)、解毒酶在長足大竹象幼蟲體內(nèi)是一種不斷變化的過程。呂林蘭等[26]研究馬拉硫磷對雙齒圍沙蠶Perinereis aibuhitensis體內(nèi)解毒酶和保護(hù)酶的影響，發(fā)現(xiàn)沙蠶在低濃度下暴露3 d和6 d時(shí)，體內(nèi)AchE活性受到顯著性抑制，體內(nèi)CAT活性隨處理濃度的增加呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢?？稻礉透呦Ｎ鋄27]研究了殺蟲劑對豆蚜Aphis craccivora解毒酶的影響，結(jié)構(gòu)顯示吡蟲啉、溴氰菊酯無顯著抑制作用，氧樂果和辛硫磷處理組的解毒酶活性顯著降低。湯芳等[28]研究發(fā)現(xiàn)用低濃度2-十三烷酮處理?xiàng)钚≈鄱闙icromelalopha troglodyta時(shí)，其GST活性顯著降低，但隨著處理濃度增高，體內(nèi)GST活性也有所增高。

劉麗華等[29]研究發(fā)現(xiàn)，北烏頭乙醇提取物對菜青蟲Pieris rapaeSOD活性的影響是先激活后抑制，并在處理后24 h活性達(dá)到最大值，體內(nèi)POD表現(xiàn)為先抑制后激活的現(xiàn)象。任曉亞等[30]發(fā)現(xiàn)嗜菌異小桿線蟲涿州品系Heterorhabditissp.處理光肩星天牛Anoplophora glabripennis幼蟲后，其體內(nèi)SOD和POD隨處理時(shí)間的增加表現(xiàn)出先升后降的現(xiàn)象；同時(shí)，體內(nèi)過氧化氫酶(CAT)卻呈現(xiàn)出被激活、抑制、再激活和再抑制的現(xiàn)象，并推測這是被侵染后，體內(nèi)保護(hù)酶協(xié)同作用的表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)顯示，甲氧蟲酰肼和氟鈴脲對長足大竹象幼蟲體內(nèi)SOD活性主要表現(xiàn)先激活后抑制作用，而經(jīng)吡丙醚處理后SOD活性主要表現(xiàn)為激活，且體內(nèi)SOD活性隨處理時(shí)間延長逐漸減小。對于體內(nèi)POD活性，氟鈴脲主要表現(xiàn)為抑制；而甲氧蟲酰肼對體內(nèi)POD活性是先抑制后激活；吡丙醚主要是表現(xiàn)為激活。

昆蟲體內(nèi)的保護(hù)酶(POD和SOD)相互協(xié)調(diào)，參與細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除，其中SOD的功能是催化超氧陰離子自由基(O2-)歧化生成過氧化氫(H2O2)，POD具有分解H2O2的能力[31]。本實(shí)驗(yàn)中，3種生成調(diào)節(jié)劑處理后，只有甲氧蟲酰肼的POD整體低于對照，推測長足大竹象4齡幼蟲體內(nèi)很難被誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的POD分解甲氧蟲酰肼產(chǎn)生的H2O2。昆蟲解毒酶系(AChE、CarE、GSTs)對農(nóng)藥的代謝起重要作用，解讀能力增強(qiáng)是昆蟲對農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的主要原因之一[32]。而經(jīng)氟鈴脲處理的CarE和GSTs顯著低于對照，推測長足大竹象4齡幼蟲對氟鈴脲更敏感。

本實(shí)驗(yàn)中對長足大竹象幼蟲體內(nèi)保護(hù)酶和解毒酶活性的測定均是在短期脅迫下進(jìn)行的，要明確某種酶是否參與了長足大竹象對3種生長調(diào)節(jié)劑的代謝還需要進(jìn)一步的系統(tǒng)研究。