周朝彬，張小新，劉國蓉，龔 偉，楊永建，田正友，楊志武

（1.遵義師范學院生物與農(nóng)業(yè)科技學院，貴州 遵義 563006；2.四川農(nóng)業(yè)大學林學院，林業(yè)生態(tài)工程省級重點實驗室，成都 611130；3.九龍縣農(nóng)牧農(nóng)村和科技局，四川 九龍 626200；4.四川省林業(yè)科學研究院，成都 610084）

花椒為蕓香科（Rutaceae）花椒屬植物，廣泛分布于亞洲、非洲、大洋洲和北美洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)。在中國，主要分布于四川、甘肅、陜西、云南、重慶、山東、山西、貴州和河南等省市[1]。其果實（果皮）主要用作香料，同時也被用作傳統(tǒng)中藥，明確列入中華人民共和國藥典[2]，經(jīng)濟價值高。近年來從花椒體內(nèi)有效成分提取和活性鑒定表明，不同的提取物具有不同的藥理活性，如抗抑郁[3]、抗腫瘤[4]和免疫調(diào)節(jié)活性[5]。

開花過程是植物生命周期中的重要事件[6]，決定結實情況，影響種植戶經(jīng)濟收益。正?；ń芬源苹橹?，偶見雄花和兩性花。近年來，貴州省關嶺縣和貞豐縣等地廣泛種植的頂壇花椒（Zanthoxylum planispinumvar.dintanensis）出現(xiàn)大量開雄花現(xiàn)象，部分植株雄花比例高達80%?；ń方Y實過程不需要授粉，可通過無融合生殖完成結實過程[7]，雄花花粉不是結實的必需條件[8]。有研究表明，大量開雄花表明頂壇花椒人工林退化，并可能與土壤水分含量下降導致的土壤養(yǎng)分供應不足有關[9]。由于雌花進一步發(fā)育為果實或種子，因而認為大量開雄花將顯著節(jié)約資源[10]，可能是對養(yǎng)分缺乏的積極響應。

蛋白質組學通過研究蛋白質結構和功能，已經(jīng)成為植物生理和生化過程研究的常用工具[11]。目前，蛋白質組學主要集中在楊樹（Populussp.）、云杉（Picea glauca）、橡樹（Quercus ilex）、桃樹（Amygdalus persica）和桉樹（Eucalyptus urophylla）等樹種上，研究內(nèi)容主要涉及器官（組織）發(fā)育、生物或非生物逆境脅迫響應等方面[12-14]。在花器官發(fā)育過程中，需要消耗物質和能量，且有各種激素如赤霉素、生長素、細胞分裂素以及脫落酸等參與[15]。在花器官發(fā)育過程中可鑒定到激素代謝、碳代謝和能量代謝等通路[16-18]?；ㄆ鞴侔l(fā)育過程中往往遭受環(huán)境脅迫，因而還可鑒定到脅迫相關蛋白[18]。對月季（Rosa hybrida）花瓣發(fā)育研究發(fā)現(xiàn)大量脅迫相關蛋白，如過氧化物酶（peroxidase）、過氧化氫酶（catalase）以及熱休克蛋白（HSPs）等[19]。單性花中，雌花與結實密切關聯(lián)，而雄花的花粉在植物的繁殖中起著決定性作用[20]，因而雌花（柱頭）和雄花（花粉或花藥）發(fā)育相關的差異蛋白及調(diào)控途徑也受到學者關注。在雌雄異株紅瓜（Coccinia grandis）雌花芽中顯著上調(diào)蛋白為乙烯生物合成（ethylene biosynthesis）相關差異蛋白如UBP1-associated protein 2A、UBP1-associated protein 2C、乙烯形成酶（ethylene-forming enzyme），并鑒定到一些與花粉萌發(fā)和花粉管伸長有關的差異蛋白[21]。歐洲油菜（Brassica napus）的柱頭發(fā)育相關蛋白主要參與代謝過程（metabolic processes）、刺激或脅迫響應（responses to stimulus or stress）、發(fā)育過程（developmental processes）和運輸（transport）等過程，與小黑麥非常相似[22]。在果梅（Prunus mumeSieb.et Zucc.）完全花中發(fā)現(xiàn)了1個上調(diào)蛋白、21個下調(diào)蛋白，在不完全花中僅鑒定到2個差異蛋白，推測這些蛋白差異點與雌蕊的敗育關聯(lián)[23]。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）成熟花粉發(fā)育過程中，鑒定到的135個特異蛋白，主要參與能量代謝（energy metabolism）、細胞壁代謝（cell wall metabolism）、細胞結構和蛋白質合成（cell structure and protein synthesis）。其中，糖基水解酶（glycosyl hydrolases）、果膠甲酯酶抑制劑（pectin methylesterase inhibitor）等是花粉發(fā)育特異蛋白[24]。有關雌雄異花同株的木本植物花芽發(fā)育的蛋白質組學研究十分缺乏。

目前，已有學者初步研究了頂壇花椒大量開雄花的生態(tài)學機制，發(fā)現(xiàn)樹體退化程度與雄花比例密切相關，而植株衰老退化越嚴重，土壤養(yǎng)分含量越低[25]。然而，對頂壇花椒花芽發(fā)育的蛋白質組學研究報道還極少。頂壇花椒雌雄花芽發(fā)育的差異蛋白表達有何特征，雄花發(fā)育過程中是否體現(xiàn)出對土壤養(yǎng)分貧瘠的適應特征，尚不清楚。為此，本文比較了不同發(fā)育階段雌雄花芽蛋白表達及代謝通路特征，以期從蛋白水平上揭示頂壇花椒雌雄花芽發(fā)育的分子機制，同時為頂壇花椒雌雄花調(diào)控提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

在貴州省關嶺布依族苗族自治縣板貴鄉(xiāng)（25.676°N，105.657°E）設置樣地并采集頂壇花椒花芽樣品。樣地氣候為亞熱帶濕潤季風氣候，年降水量1 100 mm，年均氣溫18.4℃。樣地海拔530 m，該區(qū)域石漠化嚴重，基巖裸露率高達50%～80%。土壤主要為石灰土。頂壇花椒主要為2010年左右栽植（樹齡10～12年生）。在花椒人工林內(nèi)隨機選擇樣樹8株（其中大量開雄花植株4株，僅開雌花植株4株），在樹冠中部外圍的東南西北4個方向進行取樣。頂壇花椒雄花先于雌花開放。分別于2020年11月上旬、2021年2月下旬和3月中旬采集花序軸分化期的花芽、雄花芽和雌花芽，各時期分別采集花芽3～4 g，3種花芽均設置3個重復。部分花芽濕巾包裹后，置于4℃冷藏箱帶回實驗室采用DMSZ8視頻一體機拍照（圖1）。另一部分立刻放入液氮中帶回實驗室，置于-80℃冰箱中保存，用于蛋白質組學分析。

圖1 頂壇花椒不同發(fā)育時期花芽形態(tài)特征Figure 1 Morphological characteristics of Zanthoxylum planispinum var.dintanensis flower buds in different development stages

1.2 蛋白質組學分析

1.2.1 蛋白提取

將頂壇花椒不同發(fā)育時期花芽樣品從-80℃冰箱中取出，稱取適量樣品至液氮預冷的研缽中，加液氮充分研磨至粉末。蛋白提取具體步驟參照黃嶠璟關于小麥旗葉蛋白提取方法[26]。

1.2.2 胰酶酶解

頂壇花椒不同發(fā)育時期花芽樣品蛋白取等量進行酶解，具體酶解過程參照文獻[26]。

1.2.3 串聯(lián)質譜標簽（TMT）標記

用Strata X C18（Phenomenex）對胰酶酶解的肽段進行除鹽后，真空冷凍并干燥。采用0.5 M TEAB溶解肽段，標記肽段參考TMT試劑盒的操作說明。

1.2.4 高效液相色譜（HPLC）分級

用高pH反相HPLC對肽段進行分級，色譜柱為Agilent 300Extend C18。詳細分級操作步驟參照文獻[26]。

1.2.5 液相色譜-質譜聯(lián)用分析

將超高效液相系統(tǒng)分離后的肽段注入NSI離子源中進行電離，然后開展Orbitrap Exploris?480質譜分析。離子源電壓水平、FAIMS補償電壓(CV)水平、一級質譜掃描范圍和分辨率、二級質譜掃描范圍和分辨率等設置及操作步驟參照文獻[26]。

1.3 PRM定量

1.3.1 液相色譜-質譜聯(lián)用分析

肽段用液相色譜流動相A相溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系統(tǒng)進行分離。流動相A為含甲酸（0.1%）和乙腈（2%）的水溶液；流動相B為含甲酸（0.1%）和乙腈（90%）的水溶液。液相梯度設置：0～16 min，7%～25%B；16～22 min，25%～35%B；22～26 min，35%～80%B；26～30 min，80%B，流速維持在500 nL/min。

采用超高效液相系統(tǒng)分離肽段后，將肽段注入NSI離子源中進行電離，隨后進行Q ExactiveTM Plus質譜分析。具體步驟參照李琳[27]方法并略有改動。改動之處為：設置一級和二級質譜最大離子注入時間（maximum IT）分別為50 ms和200 ms，設置隔離窗口（isolation window）為1.6 m/z。

1.3.2 數(shù)據(jù)處理

參照文獻進行肽段參數(shù)設置[28]。

1.4 差異蛋白功能分析和通路富集

采用基因本體（gene ontology，GO）基于eggNOG數(shù)據(jù)庫對差異蛋白功能進行注釋，從3個類型（生物學過程、細胞組分和分子功能）進行功能富集。采用KEGG數(shù)據(jù)庫(http：//www.kegg.jp/)進行差異蛋白的通路富集分析，采用費希爾精確檢驗（Fisher′s exact test）對蛋白功能和合成通路富集分析進行顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 差異蛋白及功能鑒定

頂壇花椒不同發(fā)育階段花芽中總計鑒定到4 742個差異蛋白。皮爾森相關分析表明，3個發(fā)育階段頂壇花椒花芽的生物學重復的重現(xiàn)性非常好(圖2a)。與花序軸分化期花芽相比，雄花芽中鑒定到2 511個差異蛋白，雌花芽中鑒定到2 195個差異蛋白。而與雌花芽相比，雄花芽中僅鑒定到667個差異蛋白(圖2b)。表明大部分差異蛋白是雄花芽和雌花芽發(fā)育共同需要的，僅有部分差異蛋白是雄花芽或雌花芽發(fā)育過程中所必需的。

進一步對差異蛋白特征采用韋恩分析發(fā)現(xiàn)，與花序軸分化期花芽相比，雄花中顯著上調(diào)蛋白1 329個，顯著下調(diào)蛋白1 182個，雌花中顯著上調(diào)蛋白1 196個，顯著下調(diào)蛋白999個（圖2b）。在雄花芽中上調(diào)且在雌花芽下調(diào)的差異蛋白共有9個，在雄花芽中下調(diào)且在雌花芽中上調(diào)的差異蛋白共有7個(圖3，表1)，表明這些蛋白分別與雄花和雌花發(fā)育特異相關。

表1 與頂壇花椒雄花/雌花發(fā)育特異相關的差異蛋白Table 1 Differential proteins specially associated with male/female flower buds development

圖2 采用TMT標記定量法對差異蛋白進行定量鑒定結果Figure 2 Quantitative identification of differential proteins by TMT quantification

圖3 不同發(fā)育階段花椒花芽差異蛋白的韋恩分析Figure 3 The differential proteins of Zanthoxylum planispinum var.dintanensis flower buds in different development stages showed in Venn diagrams

2.2 差異蛋白的GO功能分析

對不同發(fā)育階段花椒花芽差異蛋白GO注釋發(fā)現(xiàn)，在生物過程中，有11個功能存在顯著差異。其中，細胞過程、代謝過程和刺激響應等功能有關的差異蛋白占比較大。在細胞組分中，細胞、細胞內(nèi)和含蛋白質復合物在不同花芽間差異蛋白顯著。在分子功能中，不同花椒花芽差異蛋白在催化活性、結合以及轉運體活性等7個功能方面有顯著差異（圖4）。

圖4 差異蛋白的GO功能注釋Figure 4 GO function annotation of differential expressed proteins

2.3 KEGG通路分析

與花序軸分化期花芽相比，在雄花芽中，上調(diào)蛋白顯著富集到12條通路中，差異蛋白主要與萜類化合物骨架生物合成（terpenoid backbone biosynthesis）、類黃酮生物合成（flavonoid biosynthesis）以及吞噬體（phagosome）等通路相關；在雌花芽中，上調(diào)蛋白顯著富集到11條通路中，差異蛋白主要與核糖體（ribosome）、類黃酮生物合成以及吞噬體等相關。與雌花芽相比，雄花芽中的上調(diào)蛋白主要富集于10條通路中，差異蛋白主要與類黃酮生物合成、類胡蘿卜素生物合成（carotenoid biosynthesis）以及泛素酮和其他萜醌生物合成（ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis）等有關（表2）。

表2 頂壇花椒雌雄花芽上調(diào)差異蛋白的KEGG通路富集結果（-log10（費希爾精確檢驗P值））Table 2 KEGG pathway enrichment results of up-regulated differential proteins in male and female flower buds of Zanthoxylum planispinum var.dintanensis（-log10(Fisher’s exact test p value)）

2.4 PRM驗證

在差異蛋白中，隨機挑選了8個蛋白進行PRM驗證。驗證結果表明，不同花芽比較組中，8個差異蛋白的PRM和TMT的定量結果一致(表3)。

表3 TMT標記定量與平行反應監(jiān)測(PRM)結果的比較Table 3 Comparison between the TMT-tagged quantification techniques(TMT)and parallel reaction monitoring(PRM)results

3 討論

3.1 參與頂壇花椒雌雄花芽發(fā)育的代謝通路

頂壇花椒雌雄花芽發(fā)育中大部分通路（8條）相同（表2），共同通路主要參與萜類和多酮的代謝和次生代謝。在這些通路中，萜類化合物骨架生物合成通路，屬于萜類和多酮的代謝。萜類化合物是植物體內(nèi)的一種代謝產(chǎn)物，與脫落酸等植物激素合成密切關聯(lián)，一些萜類在提高植物對環(huán)境的適應上發(fā)揮著重要作用[29-30]。在Ceratopteris研究中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源脫落酸可能會抑制雄蕊發(fā)育[31]。錐栗雌花中脫落酸含量比雄花低[32]，表明脫落酸參與調(diào)控花芽發(fā)育過程。本實驗研究也發(fā)現(xiàn)，頂壇花椒雌雄花芽發(fā)育過程中均有類胡蘿卜素生物合成通路，該通路可合成ABA，表明內(nèi)源激素如ABA可能參與頂壇花椒雌雄花芽發(fā)育調(diào)節(jié)。類黃酮生物合成通路的產(chǎn)物類黃酮在促進授粉以及提高植物防御能力等方面具有顯著作用[33]。在菊花（Chrysanthemum morifolium）、杜鵑（Rhododendron×pulchrumSweet cv.Oomurasaki）等植物中發(fā)現(xiàn)該通路參與調(diào)控花器官發(fā)育過程[34-35]。單萜生物合成（monoterpenoid biosynthesis）的產(chǎn)物單萜，在植物吸引昆蟲傳粉、防御植食性動物和控制病蟲害發(fā)生等方面發(fā)揮著重要功能[36]。

試驗中還發(fā)現(xiàn)上調(diào)差異蛋白顯著富集的核糖體通路僅出現(xiàn)在雌花芽發(fā)育過程中（表2）。該通路屬于遺傳信息加工中的翻譯，對植物繁殖和生存有重要作用[37]。深入分析發(fā)現(xiàn)，相對于雌花芽而言，頂壇花椒雄花芽發(fā)育過程中的上調(diào)差異蛋白顯著富集的通路中，鑒定到脂肪酸降解（fatty acid degradation），纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解（valine，leucine and isoleucine degradation）等代謝通路，表明與雌花芽相比，雄花芽發(fā)育對氨基酸和脂肪酸需求更低，可能有利于對喀斯特石漠化地區(qū)土壤養(yǎng)分貧瘠的適應[38]。

3.2 特異參與頂壇花椒雌雄花發(fā)育的差異蛋白

與花序軸分化期花芽相比，在雄花芽中上調(diào)且雌花芽中下調(diào)的差異蛋白共鑒定到9個，這些蛋白很明顯參與了花椒雄花芽的發(fā)育過程，在雌花芽中上調(diào)且雄花芽中下調(diào)的差異蛋白共鑒定到7個，這些蛋白顯著參與了花椒雌花芽的發(fā)育過程(表1)。其中，脂肪酰-CoA還原酶（Fatty acyl-CoA reductase）參與調(diào)控花粉外壁物質的合成[39]。與花序軸分化期花芽相比，在雄花芽中顯著上調(diào)（差異倍數(shù)達2.665），而在雌花芽中顯著下調(diào)（差異倍數(shù)為0.763），表明該蛋白與雄花發(fā)育密切相關。含果膠裂解酶3結構域的蛋白（Pectate_lyase_3 domaincontaining protein）的GO注釋表明其參與生殖、花粉發(fā)育、花粉壁組裝以及花粉外膜形成等生物學過程，調(diào)節(jié)頂壇花椒雄花發(fā)育。α-半乳糖苷酶（alpha-galactosidase）可能通過介入細胞壁松弛和細胞壁擴張，進而調(diào)節(jié)器官的發(fā)育[40]，參與花椒雄花發(fā)育。

特異參與雌花發(fā)育的差異蛋白中，含核酸外切酶的結構域蛋白（exonuclease domain-containing protein）在GO注釋中的功能為DNA結合、復制和聚合酶活性，參與遺傳信息處理中的真核生物中的核糖體生物發(fā)生通路。內(nèi)質網(wǎng)跨膜蛋白的GO注釋中，功能為可能在膜蛋白從內(nèi)質網(wǎng)向高爾基體的順行轉運中起作用。含H15的結構域蛋白（H15 domain-containing protein）的GO注釋功能為DNA結合、核小體組裝功能。腺嘌呤磷酸核糖轉移酶（adenine phosphoribosyltransferase）參與嘌呤代謝通路，催化回收反應并生成AMP（單磷酸腺苷），可能有助于腺嘌呤循環(huán)生成腺苷酸[41]。含酰胺酶的結構域蛋白（amidase domain-containing protein）的GO注釋功能為水解酶活性。綜上，這些特異參與雌花發(fā)育的差異蛋白通過提供遺傳代謝物質，或在DNA復制、結合等過程中發(fā)揮作用，確保DNA復制的效率和準確性[42]。