周 力，張峰碩，高占紅，李鵬翔，侯生珍，桂林生*，王志有*

（1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016；2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；3.寧夏回族自治區(qū)反芻動物分子細(xì)胞育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021）

羔羊出生后2～3月，胃腸道結(jié)構(gòu)與功能逐漸趨于完善，日糧也由母乳轉(zhuǎn)變成飼料[1]。瘤胃作為反芻動物特有的消化器官，養(yǎng)分能夠通過瘤胃上皮直接被機(jī)體消化吸收[2]。飼料進(jìn)入瘤胃內(nèi)經(jīng)過充分的發(fā)酵、消化后，再次送入小腸被完全吸收[3]。瘤胃組織的形態(tài)發(fā)育主要包括瘤胃重量、容積、乳頭長度及胃壁厚度等指標(biāo)的變化。研究證實(shí)，瘤胃的形態(tài)發(fā)育與飼養(yǎng)方式、環(huán)境條件、斷奶時(shí)間以及營養(yǎng)調(diào)控等有關(guān)[4]。瘤胃壁上分布密集的乳頭，增加了瘤胃壁吸收養(yǎng)分的表面積，對瘤胃上皮的營養(yǎng)物質(zhì)吸收以及離子的轉(zhuǎn)運(yùn)能力具有決定性作用。

高原土著動物（例如牦牛、藏羊、藏豬和藏雞等）長期生活于青藏高原，為了在極端惡劣的環(huán)境下生存，其生理行為、表觀形態(tài)以及分子水平等方面發(fā)生了一系列適應(yīng)性變化[5]。而藏羊作為高原畜牧產(chǎn)業(yè)的特色資源，主要生活在海拔3 000 m以上，具有體質(zhì)強(qiáng)健、耐嚴(yán)寒、抗缺氧等[6]優(yōu)勢，已經(jīng)進(jìn)化出發(fā)達(dá)的消化器官，能夠?qū)⒘鑫竷?nèi)非結(jié)構(gòu)性碳水化合物轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性脂肪來維持機(jī)體代謝[7]。此外，由于斷奶羔羊消化器官尚未發(fā)育完善，易受多種因素影響和調(diào)節(jié)[8]。瘤胃結(jié)構(gòu)與功能的變化能夠反映機(jī)體消化吸收的能力，所以維持良好狀態(tài)的瘤胃形態(tài)能夠發(fā)揮正常的消化功能。因此，本試驗(yàn)擬以高海拔地區(qū)藏羊?yàn)檠芯繉ο螅荚诹私饩d羊消化生理特性來充分發(fā)揮青海特色資源優(yōu)勢，同時(shí)為在實(shí)際生產(chǎn)中飼料的配制提供基本理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用發(fā)育良好、胎次一致且初始體重相近的2～3月齡高原型藏羊公羔60只，隨機(jī)分為兩組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6只羊，即對照組飼喂玉米飼糧，試驗(yàn)組飼喂10%小麥粉替代精料中玉米。整個(gè)試驗(yàn)期為100 d，其中預(yù)飼期10 d，正試期90 d。

1.2 基礎(chǔ)飼糧組成

基礎(chǔ)飼糧參照中國《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 816-2004）[9]進(jìn)行設(shè)計(jì)（其組成及營養(yǎng)水平見表1）。整個(gè)試驗(yàn)分2個(gè)階段，第1階段為0～30 d，基礎(chǔ)飼糧由60%精料補(bǔ)充料+40%粗飼料（燕麥青干草與燕麥青貯各占1/2）組成。第2階段為31～90 d，基礎(chǔ)飼糧由70%精料補(bǔ)充料+30%粗飼料（燕麥青干草與燕麥青貯各占1/2）組成。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets（DM basis） %

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)期間每天通過人工將飼料攪拌均勻后分別于08:30和16:30各飼喂羔羊1次。自由采食，自由飲水。試驗(yàn)開始前對羊舍進(jìn)行消毒滅菌，同時(shí)按照常規(guī)方法進(jìn)行驅(qū)蟲與免疫。

1.4 樣品采集及處理

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組隨機(jī)挑選5只羔羊屠宰，然后迅速打開腹腔，找到胃部，結(jié)扎各胃室的連接處，分別采集1 cm3的組織樣品，使用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液沖洗干凈，然后將其浸泡在4%甲醛溶液中固定24 h，用于制作復(fù)胃組織形態(tài)指標(biāo)觀察。同時(shí)收集15 mL瘤胃液，經(jīng)4層紗布過濾后，分裝于無菌凍存管，置于液氮中保存，用于瘤胃消化酶活性及抗氧化指標(biāo)的檢測。

1.5 測定指標(biāo)及方法

1.5.1 復(fù)胃組織形態(tài)發(fā)育分析

復(fù)胃組織切片的制作采用石蠟法，經(jīng)蘇木精-伊紅（H.E）染色后在光學(xué)顯微鏡（Olympus BX51）下觀察并拍照，再使用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行測量復(fù)胃組織形態(tài)學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)。每個(gè)樣本觀察3個(gè)非連續(xù)切片，每張切片選取5個(gè)視野，每個(gè)視野分別測定3～5個(gè)數(shù)據(jù)。

1.5.2 瘤胃消化酶活性和抗氧化指標(biāo)檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定瘤胃消化酶活性和抗氧化指標(biāo)，試劑盒購自江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司，具體操作按照說明書步驟進(jìn)行。所測瘤胃消化酶活性包括α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、纖維素酶及脂肪酶活性;所測瘤胃抗氧化指標(biāo)包括丙二醛、總抗氧化能力含量，過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶及超氧化物歧化酶活性。

1.5.3 瘤胃pH值測定

瘤胃pH：藏羊屠宰后，使用數(shù)字式pH計(jì)（PHS-3C，上海儀天科學(xué)儀器有限公司）立即測定瘤胃液pH值，測定前應(yīng)使用相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行校正。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

原始數(shù)據(jù)先用Microsoft Excel 2019進(jìn)行初步分析，運(yùn)用t檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性分析，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）”表示，以P＜0.05作為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥替代玉米對藏系綿羊復(fù)胃形態(tài)發(fā)育的影響

由表2和圖1可見，試驗(yàn)組瘤胃的角質(zhì)層厚度顯著高于對照組（P＜0.05），兩組間瘤胃的乳頭長度、乳頭寬度、顆粒層厚度、肌層厚度及中央肌層厚度差異不顯著（P＞0.05）。對照組網(wǎng)胃的乳頭長度和乳頭寬度顯著低于試驗(yàn)組（P＜0.05），兩組間網(wǎng)胃的角質(zhì)層厚度、顆粒層厚度、肌層厚度及中央肌層厚度差異均不顯著（P＞0.05）。兩組間瓣胃的乳頭長度、乳頭寬度、角質(zhì)層厚度、顆粒層厚度、肌層厚度、中央肌層厚度差異不顯著（P＞0.05）。與對照組相比，試驗(yàn)組皺胃的黏膜層厚度顯著提高（P＜0.05），兩組間皺胃的角質(zhì)層厚度、肌層厚度及黏膜下層厚度差異均不顯著（P＞0.05）。

圖1 兩組間高原型藏羊復(fù)胃組織的石蠟切片F(xiàn)igure 1 paraffin section of compound stomach tissue of Plateau Tibetan sheep between the two groups

表2 小麥替代玉米對藏系綿羊復(fù)胃形態(tài)發(fā)育的影響Table 2 Effect of wheat replacing corn on morphological development of restomach in Tibetan sheep

2.2 小麥替代玉米對藏系綿羊瘤胃消化酶活性的影響

從表3可見，相較于對照組，試驗(yàn)組瘤胃的胰蛋白酶活性顯著提高（P＜0.05），兩組間瘤胃的α-淀粉酶、纖維素酶、糜蛋白酶以及脂肪酶活性差異均不顯著（P＞0.05）。

表3 小麥替代玉米對藏系綿羊瘤胃消化酶活性的影響Table 3 Effect of wheat replacing corn on digestive enzyme activity in rumen of Tibetan sheep

2.3 小麥替代玉米對藏系綿羊瘤胃抗氧化功能的影響

從表4可見，兩組間瘤胃的總抗氧化能力，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶以及過氧化氫酶活性差異均不顯著（P＞0.05）；而對照組瘤胃丙二醛含量卻顯著高于試驗(yàn)組（P＜0.05）。

表4 小麥替代玉米對藏系綿羊瘤胃抗氧化能力的影響Table 4 Effect of wheat replacing corn on antioxidant capacity in rumen of Tibetan sheep

2.4 小麥替代玉米對藏系綿羊瘤胃pH的影響

從圖2可見，與對照組相比，試驗(yàn)組瘤胃的pH值差異不顯著（P＞0.05），說明小麥替代玉米對藏系綿羊瘤胃pH值無明顯影響。

圖2 小麥替代玉米對藏系綿羊瘤胃pH的影響Figure 2 Effect of wheat replacing corn on pH of rumen of Tibetan sheep

3 討論與小結(jié)

3.1 小麥替代玉米對藏系綿羊復(fù)胃形態(tài)發(fā)育的影響

胃具有儲存食物、消化、吸收以及防御功能，其中瘤胃內(nèi)棲居著大量微生物，能將飼料中蛋白質(zhì)、淀粉和碳水化合物轉(zhuǎn)化成揮發(fā)性脂肪酸，以滿足宿主的能量需求[10]。而瘤胃組織形態(tài)的發(fā)育主要體現(xiàn)于解剖結(jié)構(gòu)與生理變化，如瘤胃重量、體積以及胃壁厚度等的改變[11]。瘤胃的乳頭長度和寬度是評價(jià)其形態(tài)發(fā)育的重要指標(biāo)[12]。本試驗(yàn)對照組網(wǎng)胃的乳頭長度、寬度顯著小于試驗(yàn)組，推測其原因可能是小麥+玉米組合效應(yīng)豐富了綿羊瘤胃微生物多樣性，加速了有益微生物的生長繁殖，繼而促進(jìn)了網(wǎng)胃乳頭的形態(tài)發(fā)育。本試驗(yàn)中，兩組間各胃室的肌層厚度差異不顯著，說明兩組間各胃室的強(qiáng)烈收縮和舒張活動提供的動力無顯著差異，可能是因?yàn)樗胁匮蚓鶠樯犸?，限制其運(yùn)動量，導(dǎo)致兩組羔羊運(yùn)動量基本相同所致。角質(zhì)層作為物理屏障具有保護(hù)瘤胃底層上皮細(xì)胞的功能[13]。而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對照組瘤胃的角質(zhì)層厚度顯著低于試驗(yàn)組，可能是因?yàn)樾←溨泻休^多的淀粉，提高了可發(fā)酵物質(zhì)的含量，進(jìn)而促進(jìn)了瘤胃發(fā)酵功能所致。顆粒層無皮脂腺分泌，水分可以自由通過。在本試驗(yàn)中，兩組間顆粒層的厚度差異不明顯。本研究表明兩組間前胃（瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃）的中央肌層厚度差異不顯著。在羔羊初生時(shí)皺胃已發(fā)育到一定程度，出生后可立即執(zhí)行消化功能，與其他胃室相比不易受日糧的影響。而本試驗(yàn)研究卻證實(shí)，對照組皺胃的黏膜層厚度顯著低于試驗(yàn)組，提示使用10%小麥替代玉米飼喂藏羊可以完善其黏膜結(jié)構(gòu)，促進(jìn)其形態(tài)發(fā)育。

3.2 小麥替代玉米對藏系綿羊瘤胃消化酶活性的影響

當(dāng)綿羊進(jìn)食后，飼料首先會在瘤胃內(nèi)進(jìn)行微生物發(fā)酵，再流入其他胃室進(jìn)行消化吸收[14]。消化酶在消化、吸收和利用營養(yǎng)物質(zhì)上發(fā)揮著重要作用[15]。瘤胃內(nèi)微生物數(shù)量、活力決定了消化酶活性以及飼料消化速率[16]。其中纖維素酶活性可直觀評估瘤胃纖維分解菌的數(shù)量以及能力[17]。本試驗(yàn)表明，兩組間瘤胃的纖維素酶活性差異不顯著，其原因可能是由于兩組飼料中纖維水平相近所致。在本試驗(yàn)中，對照組瘤胃的胰蛋白酶活性顯著低于試驗(yàn)組，表明與對照組相比，試驗(yàn)組藏羊的瘤胃能夠使蛋白質(zhì)發(fā)生水解生成更多的氨基酸以滿足機(jī)體需要。另外，本研究也發(fā)現(xiàn)兩組間瘤胃的糜蛋白酶活性差異不顯著。α-淀粉酶活性與動物的采食量、淀粉的攝入量均有關(guān)[18]。從本試驗(yàn)研究結(jié)果來看，α-淀粉酶活性差異不顯著，可能是由于兩組藏羊的采食量、淀粉的攝入量基本一致所造成。脂肪酶能將飼料中的甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯與甘油單酯，從而被機(jī)體所吸收。本試驗(yàn)表明，兩組間瘤胃的脂肪酶活性差異不顯著，揭示10%小麥替代玉米未對藏羊瘤胃的脂肪酶活性產(chǎn)生不利影響。由于目前脂肪酶合成與分泌的機(jī)理尚不明確，加上有關(guān)小麥與綿羊胃腸道消化酶活性的關(guān)系報(bào)道較少，因而小麥對綿羊瘤胃中脂肪酶作用機(jī)理還有待進(jìn)一步的深入研究。

3.3 小麥替代玉米對藏系綿羊瘤胃抗氧化特性的影響

由于活性氧和活性氮的生成量增加、酶活性受損或外源性物質(zhì)攝入減少而產(chǎn)生的過量自由基從而引起氧化應(yīng)激反應(yīng)[19]。所以，通過檢測羔羊瘤胃的谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶以及超氧化物歧化酶活性，可以用來衡量機(jī)體抗氧化損傷能力。在正常生理?xiàng)l件下，谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶及超氧化物歧化酶活性越大表明機(jī)體抗氧化能力越強(qiáng)[20]。本研究證實(shí)，兩組間瘤胃的谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶及超氧化物歧化酶活性差異均不顯著，表明精料中使用10%小麥替代玉米對藏羊瘤胃的抗氧化酶活性無負(fù)面影響。丙二醛能夠直接衡量脂質(zhì)過氧化與細(xì)胞受損的程度，其含量越高表明細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化程度越高，細(xì)胞膜遭受的傷害也就越嚴(yán)重[21]。在本試驗(yàn)中，對照組瘤胃的丙二醛含量顯著高于試驗(yàn)組，說明使用10%小麥替代精料補(bǔ)充料中玉米能夠明顯減輕瘤胃脂質(zhì)氧化程度?？偪寡趸芰κ呛饬繖C(jī)體總體抗氧化能力的綜合性指標(biāo)，能夠代表機(jī)體的總抗氧化防御水平[22]。而本研究條件下，兩組間瘤胃的總抗氧化能力含量無顯著差異，揭示了飼喂10%小麥替代精料中部分玉米對瘤胃總抗氧化能力無明顯影響。

3.4 小麥替代玉米對藏系綿羊瘤胃pH的影響

pH是反芻動物瘤胃發(fā)酵參數(shù)的重要指標(biāo)之一，同時(shí)可以用來衡量瘤胃的生理狀況[23]。瘤胃pH值主要受多種因素的影響，如飼糧組成、流通速度以及唾液分泌量等。pH值高低影響瘤胃消化酶的活性，而消化酶活性的高低又反映反芻動物對養(yǎng)分的吸收能力，從而影響機(jī)體生長發(fā)育。研究證實(shí)，瘤胃pH在5.8以上，說明瘤胃微生物菌群較為穩(wěn)定[24]，然而pH低于5.8時(shí)，瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)則處于失衡狀態(tài)[25]。以牦牛為研究對象[26]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)放牧組瘤胃液中pH極顯著低于補(bǔ)飼組，其原因可能是經(jīng)過補(bǔ)飼精料后，非纖維性碳水化合物在牦牛瘤胃中迅速發(fā)酵產(chǎn)生大量的揮發(fā)性脂肪酸，故造成瘤胃液pH顯著下降，這與本試驗(yàn)結(jié)果不一致。在本試驗(yàn)條件下，兩組藏羊瘤胃pH值均處于正常范圍內(nèi)，且試驗(yàn)組羔羊瘤胃pH值低于照組，但未達(dá)到顯著水平，分析其原因可能是小麥替代玉米的比例不足以引起瘤胃揮發(fā)性脂肪酸升高造成pH值顯著下降，表明飼喂10%小麥替代玉米具有降低高原型藏羊瘤胃pH值的趨勢。

綜上，在精料補(bǔ)充料中使用10%小麥替代玉米可促進(jìn)高原型藏羊復(fù)胃形態(tài)發(fā)育，同時(shí)能增強(qiáng)瘤胃消化酶活性和抗氧化能力。