符艷 趙四林 王偉 肖雪飛

哮喘是一種以氣道反應(yīng)過度、支氣管炎癥和氣道重塑為特征的炎癥綜合癥，嚴(yán)重危害人類的生命健康。氣道平滑肌細(xì)胞(ASMC)增殖，是導(dǎo)致氣道結(jié)構(gòu)改變的病理學(xué)基礎(chǔ)，在氣道重塑的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子等生長因子，是促進(jìn)ASMC增殖的主要炎癥介質(zhì)[2]，抑制或減少這些生長因子誘導(dǎo)的ASMC增殖，對(duì)控制氣道重塑的發(fā)生及哮喘治療尤為重要，也是當(dāng)前哮喘研究的熱點(diǎn)。布地奈德(budesonide，Bud)是一種糖皮質(zhì)激素，具有顯著局部抗炎作用，其可抑制人體抗原合成，減少炎性因子生成[3]。研究顯示，布地奈德可改善支氣管哮喘患者肺功能，縮短臨床癥狀轉(zhuǎn)歸時(shí)間，提高哮喘患者治療療效[4]。但目前，布地奈德治療哮喘的分子機(jī)制尚未明確。微小RNA(miRNA)是一類參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激等生理或病理過程的小分子非編碼RNA，在哮喘等炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要調(diào)控作用[5-6]。有報(bào)道稱，下調(diào)miR-620可抑制轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的氣道平滑肌細(xì)胞增殖[7]，提示miR-620可能是改善氣道重塑、治療哮喘的分子靶點(diǎn)。因此，本研究以小鼠ASMC為研究對(duì)象，旨在觀察布地奈德對(duì)血小板衍生生長因子(PDGF)誘導(dǎo)的小鼠ASMC增殖和炎性因子表達(dá)的影響及其能否調(diào)控miR-620發(fā)揮作用。

材料與方法

一、 細(xì)胞和試劑

小鼠ASMC，上海澤葉生物科技有限公司；布地奈德(Bud)，遼寧玉皇藥業(yè)有限公司；PDGF，武漢優(yōu)爾生公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)和二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒，北京索萊寶公司；胎牛血清(FBS)，浙江天杭生物科技公司；LipofectamineTM 2000試劑盒和Trizol試劑，美國Invitrogen公司；miR-620模擬物(mimics)、模擬對(duì)照序列(miR-mimics-NC)、miR-620抑制劑(inhibitor)、抑制劑陰性對(duì)照序列(miR-inhibitor-NC)和PCR引物，上海生工生物工程有限公司；IL-4、IL-5和IL-13試劑盒，南京建成生物工程研究所；兔抗細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、P21和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)，美國Santa Cruz公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司。

二、 方法

1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇ASMC，用含10 % FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基(常規(guī)培養(yǎng)基)培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長期的ASMC以5.0×105個(gè)/孔接種于6孔板中，采用LipofectamineTM 2000脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染miR-620 inhibitor、miR-inhibitor-NC、miR-620 mimics、miR-mimics-NC。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞備用。

2 細(xì)胞分組處理 未轉(zhuǎn)染的ASMC分為Control組、PDGF組、PDGF+Bud-200組、PDGF+Bud-400組、PDGF+Bud-600組，Control組細(xì)胞用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，PDGF組細(xì)胞用含20 ng/mL[1]PDGF的培養(yǎng)基培養(yǎng)，PDGF+Bud-200組、PDGF+Bud-400組、PDGF+Bud-600組細(xì)胞分別用含200、400、600 μg/mL Bud與20 ng/mL PDGF的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染miR-620 inhibitor、miR-inhibitor-NC的細(xì)胞用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，記為PDGF+miR-620 inhibitor組、PDGF+miR-inhibitor-NC組。轉(zhuǎn)染miR-620 mimics、miR-mimics-NC的細(xì)胞用含600 μg/mL Bud與20 ng/mL PDGF的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)，記為PDGF+Bud-600+miR-620 mimics組、PDGF+Bud-600+miR-mimics-NC組。

3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 將未轉(zhuǎn)染的ASMC、轉(zhuǎn)染miR-620 inhibitor、miR-inhibitor-NC、miR-620 mimics、miR-mimics-NC的ASMC均以1.0×104個(gè)/孔接種于96孔板中，按照1.2.2分組處理，培養(yǎng)24 h后，加10 μL CCK-8試劑。孵育2 h后，酶標(biāo)儀450 nm檢測各孔光密度(OD)值。

4 Western Blot法檢測細(xì)胞中CyclinD1、P21蛋白表達(dá) 將未轉(zhuǎn)染的ASMC、轉(zhuǎn)染miR-620 inhibitor、miR-inhibitor-NC、miR-620 mimics、miR-mimics-NC的ASMC均以5.0×104個(gè)/孔接種于6孔板中，按照1.2.2分組處理，培養(yǎng)24 h后，RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白。BCA法檢測蛋白含量后，以20 μg/孔蛋白行SDS-PAGE電泳。電泳后，將分離蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，并于5 %脫脂奶粉溶液中封閉1 h。然后分別于CyclinD1、(1 ∶500)、P21(1 ∶500)和β-actin(1 ∶1000)一抗孵育液中4℃過夜。再于山羊抗兔二抗(1 ∶3000)孵育液中37℃孵育1 h。最后加顯影液避光顯影，曝光拍照。

5 試劑盒法檢測細(xì)胞中IL-4、IL-5和IL-13表達(dá) 將未轉(zhuǎn)染的ASMC、轉(zhuǎn)染miR-620 inhibitor、miR-inhibitor-NC、miR-620 mimics、miR-mimics-NC的ASMC均以5.0×104個(gè)/孔接種于6孔板中，按照1.2.2分組處理，培養(yǎng)24 h后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，3500 r/min離心5 min，保留上清。分別參照IL-4、IL-5和IL-13試劑盒說明書，檢測上清中其含量。

6 RT-qPCR檢測細(xì)胞中miR-620表達(dá) 細(xì)胞接種及處理情況同1.2.4。Trizol試劑提取各組細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，行PCR擴(kuò)增。引物序列：miR-620上游5′-GCCGAGATGGAGATAGATAT-3′，下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGG-3′；內(nèi)參U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。2-△△Ct法計(jì)算miR-620相對(duì)于內(nèi)參U6的表達(dá)水平。

三、 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、 布地奈德對(duì)PDGF誘導(dǎo)的小鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖的影響

與Control組比較，PDGF組細(xì)胞OD值升高(P<0.05)，細(xì)胞中CyclinD1蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，而P21蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。與PDGF組比較，PDGF+Bud-200組、PDGF+Bud-400組、PDGF+Bud-600組細(xì)胞OD值降低(P<0.05)，細(xì)胞中CyclinD1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，而P21蛋白表達(dá)升高(P<0.05)(見表1，圖1)。

表1 布地奈德對(duì)PDGF誘導(dǎo)的小鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖的影響

圖1 布地奈德對(duì)PDGF誘導(dǎo)的氣道平滑肌細(xì)胞CyclinD1和P21蛋白表達(dá)的影響

二、 布地奈德對(duì)PDGF誘導(dǎo)的小鼠氣道平滑肌細(xì)胞炎癥因子的影響

與Control組比較，PDGF組IL-4、IL-5和IL-13水平升高(P<0.05)。與PDGF組比較，PDGF+Bud-200組、PDGF+Bud-400組、PDGF+Bud-600組IL-4、IL-5和IL-13水平降低(P<0.05)(見表2)。

表2 布地奈德對(duì)PDGF誘導(dǎo)的小鼠氣道平滑肌細(xì)胞炎癥因子的影響

三、 布地奈德對(duì)PDGF誘導(dǎo)的小鼠氣道平滑肌細(xì)胞中miR-620表達(dá)的影響

與Control組比較，PDGF組miR-620水平升高(P<0.05)。與PDGF組比較，PDGF+Bud-200組、PDGF+Bud-400組、PDGF+Bud-600組miR-620水平降低(P<0.05)(見表3)。

表3 布地奈德對(duì)PDGF誘導(dǎo)的小鼠氣道平滑肌細(xì)胞中miR-620的影響

四、 沉默miR-620對(duì)布地奈德對(duì)PDGF誘導(dǎo)的小鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖和炎癥因子的影響

與PDGF+miR-inhibitor-NC組比較，PDGF+miR-620 inhibitor組miR-620水平降低(P<0.05)，細(xì)胞OD值降低(P<0.05)，CyclinD1蛋白水平降低(P<0.05)，而P21蛋白水平升高(P<0.05)，IL-4、IL-5和IL-13水平降低(P<0.05)(見表4，圖2)。

圖2 沉默miR-620對(duì)PDGF誘導(dǎo)的氣道平滑肌細(xì)胞CyclinD1和P21蛋白表達(dá)的影響

五、 過表達(dá)miR-620逆轉(zhuǎn)布地奈德對(duì)PDGF誘導(dǎo)的小鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖和炎癥因子的影響

與PDGF+Bud-600+miR-mimics-NC組比較，PDGF+Bud-600+miR-620 mimics組miR-620水平升高(P<0.05)，細(xì)胞OD值升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白水平升高(P<0.05)，而P21蛋白水平降低(P<0.05)，IL-4、IL-5和IL-13水平升高(P<0.05)(見表5，圖3)。

圖3 過表達(dá)miR-620逆轉(zhuǎn)布地奈德對(duì)PDGF誘導(dǎo)的氣道平滑肌細(xì)胞CyclinD1和P21蛋白表達(dá)的影響

討 論

氣道重塑是指哮喘時(shí)氣道壁結(jié)構(gòu)發(fā)生一系列改變，包括氣道壁增厚、氣道纖維化、平滑肌細(xì)胞增生和肥大等，與哮喘患者預(yù)后密切相關(guān)[8]。氣道平滑肌細(xì)胞是氣道壁結(jié)構(gòu)的主要組成細(xì)胞，也是參與氣道重塑的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，其過度增殖除了加重氣道高反應(yīng)性之外，還可導(dǎo)致氣道壁變性，引起不可逆的氣道損傷[9]。因此，抑制氣道平滑肌細(xì)胞增殖對(duì)防治哮喘具有積極意義。PDGF是重要的促有絲分裂原，可促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞增殖，引起氣道平滑肌細(xì)胞表型改變，促進(jìn)氣道重塑的發(fā)生[10]。本研究顯示，PDGF促進(jìn)了小鼠氣道平滑肌細(xì)胞的增殖及炎性因子IL-4、IL-5和IL-13的表達(dá)，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致[11]。

布地奈德具有治療哮喘的功效。研究顯示，布地奈德可協(xié)同骨化三醇抑制哮喘小鼠氣道重塑[12]；細(xì)辛腦聯(lián)合布地奈德可顯著減少炎癥因子骨橋蛋白和血管內(nèi)皮生長因子的產(chǎn)生，減弱哮喘小鼠氣道炎癥損傷和氣道重塑程度[13]。本研究將一定劑量的布地奈德作用于PDGF誘導(dǎo)的小鼠氣道平滑肌細(xì)胞，結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖能力降低，說明布地奈德抑制了PDGF誘導(dǎo)的小鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖。細(xì)胞增殖受多種基因分子的調(diào)控，其中CyclinD1是細(xì)胞周期調(diào)控分子，其可激活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK4，誘導(dǎo)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖[14]，而P21則減弱細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的活性，抑制細(xì)胞的增殖能力[15]。本研究顯示，一定劑量的布地奈德可降低PDGF誘導(dǎo)的小鼠氣道平滑肌細(xì)胞中CyclinD1蛋白表達(dá)，而促進(jìn)P21蛋白表達(dá)，進(jìn)一步說明布地奈德抑制了PDGF誘導(dǎo)的小鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖，其作用可治療哮喘氣道重塑。IL-4、IL-5和IL-13是重要的炎性介質(zhì)，在支氣管哮喘的發(fā)病中起重要作用。本研究顯示，布地奈德可抑制PDGF誘導(dǎo)的小鼠氣道平滑肌細(xì)胞表達(dá)IL-4、IL-5和IL-13炎性因子，提示布地奈德可降低哮喘氣道炎癥反應(yīng)。

研究已表明，多種miRNA參與調(diào)控哮喘氣道平滑肌細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)，可作為哮喘氣道重塑的分子治療靶點(diǎn)。miR-326可通過抑制TNFSF14降低TGF-β1誘導(dǎo)的ASMC的基質(zhì)蛋白沉積和細(xì)胞增殖[16]；上調(diào)miR-204-5p通過負(fù)調(diào)節(jié)Six1抑制TGF-β1誘導(dǎo)的氣道平滑肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)生成，是哮喘氣道重塑的潛在治療靶點(diǎn)[17]。本研究顯示，沉默miR-620抑制了PDGF誘導(dǎo)的小鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖及炎性因子IL-4、IL-5和IL-13的表達(dá)，與Chen等[7]報(bào)道的下調(diào)miR-620抑制了轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的氣道平滑肌細(xì)胞增殖的結(jié)果一致，提示miR-620是可能用作哮喘氣道重塑的分子靶點(diǎn)。本研究還顯示，布地奈德可抑制PDGF誘導(dǎo)的小鼠氣道平滑肌細(xì)胞表達(dá)miR-620，而過表達(dá)miR-620逆轉(zhuǎn)了布地奈德對(duì)PDGF誘導(dǎo)的小鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖及IL-4、IL-5和IL-13的表達(dá)，提示布地奈德可能通過下調(diào)miR-620來抑制PDGF誘導(dǎo)的小鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖及炎性因子表達(dá)。

綜上，布地奈德可抑制PDGF誘導(dǎo)的小鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖及炎性細(xì)胞因子表達(dá)，其作用機(jī)制可能與下調(diào)miR-620表達(dá)有關(guān)。