沈思巧，楊培龍，曲音波，余曉斌，羅瑋*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京，100081) 3(山東大學(xué),微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島，266237)

三孢布拉霉是目前大規(guī)模生產(chǎn)β-胡蘿卜素的工業(yè)化菌株[1]，在該菌株中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)類胡蘿卜素合成調(diào)控基因,如crgA[2]、wc-1c[3]。在卷枝毛霉中類胡蘿卜素光誘導(dǎo)合成的效應(yīng)主要由wc-1c基因介導(dǎo)[4]，通過將三孢布拉霉來源的btwc-1c導(dǎo)入到卷枝毛霉相應(yīng)功能缺失菌中，初步證明了btwc-1c參與光誘導(dǎo)的類胡蘿卜素合成[3]。然而，目前缺乏針對三孢布拉霉的高效遺傳轉(zhuǎn)化方法[5]，難以對類胡蘿卜素合成關(guān)鍵調(diào)控基因的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。

目前文獻(xiàn)已報(bào)道的關(guān)于三孢布拉霉的轉(zhuǎn)化方法包括聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化[6]、農(nóng)桿菌侵染原生質(zhì)體[5]與電擊轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體[7]等。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化通常使用聚乙二醇介導(dǎo)將核酸導(dǎo)入原生質(zhì)體中，鞏尊洋等[6]采用該方法篩選到陽性轉(zhuǎn)化子，然而受限于三孢布拉霉細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的復(fù)雜及對細(xì)胞壁水解酶的了解使該方法轉(zhuǎn)化效率較低[8]。農(nóng)桿菌侵染原生質(zhì)體是依靠T-DNA在誘導(dǎo)條件下轉(zhuǎn)移基因到宿主基因組中的一種轉(zhuǎn)化方法[9]，廣泛應(yīng)用于絲狀真菌和植物的轉(zhuǎn)化過程。李娜等[5]采用該方法篩選到了轉(zhuǎn)化子，然而該方法操作復(fù)雜耗時(shí)且后期農(nóng)桿菌難以完全去除，篩選出的轉(zhuǎn)化子即使在含有頭孢噻肟鈉的培養(yǎng)基上繼代多次仍然有可能攜帶農(nóng)桿菌[10]。相對于前兩種方法，電擊轉(zhuǎn)化法可使外源核酸立即轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)[8]，轉(zhuǎn)化耗時(shí)短，另外還能導(dǎo)入雙質(zhì)粒。WANG等[7]采用該方法成功篩選到了轉(zhuǎn)化子，但其轉(zhuǎn)化效率依然不高，可能的原因包括影響真菌原生質(zhì)體制備的因素，如菌齡、酶解時(shí)間與溫度、滲透壓穩(wěn)定劑的種類等會(huì)影響原生質(zhì)體的數(shù)量與質(zhì)量[11]，而電擊轉(zhuǎn)化時(shí)的電壓大小與電脈沖時(shí)間，再生培養(yǎng)時(shí)搖床轉(zhuǎn)速及培養(yǎng)時(shí)間等會(huì)影響轉(zhuǎn)化子的獲得。

本研究基于電擊轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體存在的問題，利用可以提高轉(zhuǎn)化效率的含有AMA1自主復(fù)制元件[12]的復(fù)制型質(zhì)粒pFC332進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，優(yōu)化了電擊轉(zhuǎn)化三孢布拉霉原生質(zhì)體多個(gè)參數(shù)。同時(shí)，以轉(zhuǎn)化含有btwc-1c的重組載體為例，成功構(gòu)建了btwc-1c過表達(dá)菌株。本研究為在三孢布拉霉中進(jìn)行代謝工程和解析類胡蘿卜素合成的代謝調(diào)控機(jī)制奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

菌株三孢布拉霉(Blakesleatrispora)負(fù)菌NRRL2896、大腸桿菌JM109(EscherichiacoliJM109)由本實(shí)驗(yàn)室保藏。質(zhì)粒pFC332和pUC57-AMA1-pgpdA-cas9-TrpC-hph由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基與溶液

麥汁培養(yǎng)基 (1 L)：5°麥汁，25 g瓊脂；

種子培養(yǎng)基 (g/L)：玉米粉30，大豆粉50，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 0.5；

再生培養(yǎng)基 (g/L)：蔗糖200，馬鈴薯200，葡萄糖20，KH2PO41、MgSO4·7H2O 0.1；

LB培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 10、蛋白胨10、酵母提取物5。如需配制LB固體平板，再加入2%的瓊脂粉后滅菌。

溶液 (mol/L)：穩(wěn)滲液：NaCl 0.6；電脈沖緩沖液：蔗糖0.6、磷酸緩沖液0.005、山梨醇1，pH 7。

1.1.3 主要試劑

Prime STAR?Max DNA Polymerase，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；溶菌酶、溶壁酶、蝸牛酶、氨芐青霉素、潮霉素B，無錫特達(dá)生物技術(shù)有限公司；DNA小量抽提試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；RNApure Plant Kit，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；MolPure?Plant DNA Kit植物DNA提取試劑盒、Hifair?Ⅲ 1 st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)、Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox Plus)，翌圣生物科技(上海)股份有限公司；ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；引物合成與測序等服務(wù)，蘇州金唯智生物科技有限公司或上海生物工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 三孢布拉霉潮霉素最低抑制濃度試驗(yàn)

利用pFC332載體上的潮霉素抗性作為抗性篩選標(biāo)記，對三孢布拉霉NRRL2896野生型進(jìn)行潮霉素敏感性測試。將利用酶解制備的三孢布拉霉原生質(zhì)體通過血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后在含有不同濃度潮霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，確定潮霉素對三孢布拉霉的最低抑菌濃度。

1.2.2 電轉(zhuǎn)化三孢布拉霉原生質(zhì)體條件的確立及優(yōu)化

圖1為電擊轉(zhuǎn)化三孢布拉霉原生質(zhì)體的基本流程，初始轉(zhuǎn)化條件如下：

(1)三孢布拉霉原生質(zhì)體的制備

將三孢布拉霉按1%接種量接種于50 mL種子液中，28 ℃培養(yǎng)48 h，8 000 r/min離心5 min，收集菌絲體，無菌水水洗2次，添加10 mL由0.6 mol/L的蔗糖溶液配制的酶解液(3 g/100mL溶壁酶+1.5 g/100mL溶菌酶+1.5 g/100mL蝸牛酶)，避光孵育1.5 h，使用4層擦鏡紙過濾后用0.6 mol/L的蔗糖溶液清洗2次，4 000 r/min，10 min離心，調(diào)整原生質(zhì)體個(gè)數(shù)為1×107個(gè)/mL后備用。

(2)電轉(zhuǎn)化三孢布拉霉原生質(zhì)體

將200 μL的原生質(zhì)體與0.5 μg的線性質(zhì)粒充分混合后移入規(guī)格為0.2 cm的電轉(zhuǎn)杯，設(shè)置4 kV/cm的條件，電轉(zhuǎn)1 ms。電轉(zhuǎn)3次(第1次間隔2 s，第2次間隔3 s)后迅速加入940 μL的再生培養(yǎng)基。

(3)再生與培養(yǎng)

在28 ℃，180 r/min培養(yǎng)1.5 h進(jìn)行再生，然后以9 000 r/min離心1 min，取100 μL轉(zhuǎn)移至含80 μg/mL 的潮霉素固體麥汁培養(yǎng)基中。

需要進(jìn)行的優(yōu)化參數(shù)如表1所示。

1.2.3 再生率及轉(zhuǎn)化效率的計(jì)算

英國廣播公司拍攝的《自然的運(yùn)作》《沙漠》《熱帶雨林》等與生態(tài)學(xué)主要內(nèi)容密切相關(guān)的視頻資料，螞蟻和竹節(jié)蟲被孢子侵襲后的病態(tài)表現(xiàn)和它們身上長出一棵小蘑菇狀的菌絲的動(dòng)態(tài)過程，一定能使學(xué)生們深刻領(lǐng)會(huì)什么是“寄生”，還能牢記不忘。學(xué)生們會(huì)在看到極樂鳥求偶炫耀變換色彩斑斕的羽毛時(shí)驚呼，會(huì)在看到沙漠蜘蛛逃亡化身車輪滾下沙丘時(shí)鼓掌，會(huì)在看到沙漠蜥蜴在盛夏正午為避免燙傷而抬高雙腿時(shí)大笑。在被大自然的奇妙征服的同時(shí)，激發(fā)出他們珍愛地球生命、熱愛大自然的情感。

計(jì)算原生質(zhì)體再生率步驟如下：在0.6 mol/L NaCl的酶解液(溶壁酶3 g/100mL+溶菌酶1.5 g/100mL+蝸牛酶1.5 g/100mL)中于28 ℃，75 r/min 下避光酶解1～5 h后將酶解后的液體采用4層擦鏡紙進(jìn)行過濾后再用0.6 mol/L NaCl溶液洗滌2遍后使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)將溶液稀釋至1×107個(gè)/mL，取100 μL后涂布在含200 g/L蔗糖的高滲麥汁固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2 d 左右后記下菌落數(shù)，計(jì)為Y1，另外取100 μL的原生質(zhì)體涂步在不含200 g/L蔗糖的低滲麥汁固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2 d左右后記下菌落數(shù)，計(jì)為Y2。

計(jì)算電擊后的再生率的步驟如下：取200 μL的原生質(zhì)體在不同的電壓大小與電脈沖時(shí)間下進(jìn)行電轉(zhuǎn)(電擊3次：一次間隔2 s，一次間隔3 s)，涂布在含200 g/L蔗糖的高滲麥汁固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2 d左右后記下菌落數(shù)，計(jì)為Y1，另外在同樣條件下處理后涂步在不含200 g/L蔗糖的低滲麥汁固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2 d左右后記下菌落數(shù)，計(jì)為Y2。

原生質(zhì)體再生率按照公式(1)和公式(2)進(jìn)行計(jì)算：

(1)

(2)

1.2.4btwc-1c過表達(dá)載體的構(gòu)建

采用RNApure Plant Kit試劑盒提取野生型三孢布拉霉RNA，然后使用Hifair?Ⅲ 1 st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，使用引物W-F與W-R得到btwc-1c片段，以質(zhì)粒pUC57-AMA1-pgpdA-cas9-TrpC-hph為模板采用P-F與P-R反向PCR擴(kuò)增得到pUC57-AMA1-pgpdA-TrpC片段。使用ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit試劑盒將pUC57-AMA1-pgpdA-TrpC與btwc-1c連接構(gòu)建表達(dá)載體pUC57-AMA1-pgpdA-btwc-1c-TrpC-hph。

構(gòu)建的流程如圖2所示，引物見表2。

圖2 過表達(dá)載體pUC57-AMA1-pgpdA-btwc-1c-TrpC-hph的 構(gòu)建Fig.2 Construction of overexpression vector pUC57-AMA1-pgpdA-btwc-1c-TrpC-hph

表2 本研究所用到的引物對Table 2 Primer pairs used in this study

1.2.5 轉(zhuǎn)化子鑒定及轉(zhuǎn)錄水平分析

(1)目的基因Ct值歸一化：

ΔCt實(shí)驗(yàn)組=Ct實(shí)驗(yàn)組目的基因-Ct實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因

ΔCt對照組=Ct對照組目的基因-Ct對照組內(nèi)參基因

(2)實(shí)驗(yàn)組ΔCt值歸一化：

ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對照組

(3)基因表達(dá)差異倍數(shù)=(1+n)-ΔΔCt；n為引物的擴(kuò)增效率。

1.2.6 生物量和β-胡蘿卜素含量的測定

在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)三孢布拉霉，然后在紅光照射下采用一次性涂布器刮取菌苔迅速稱量菌體濕重。測定β-胡蘿卜素含量需制定其標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取1 mg β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，用乙酸乙酯配制成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加20 g/L 2,6-二叔丁基對甲酚(butylated hydroxy toluene，BHT)防止β-胡蘿卜素氧化。分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液1、2、3、4、5、6 mL，用乙酸乙酯定容于10 mL棕色容量瓶中。分別取200 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用酶標(biāo)儀測定450 nm下的吸光值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD450值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算公式為y=0.129x-0.027 4，y為OD450值，x為β-胡蘿卜素含量(ng/μL)。紅光環(huán)境下取培養(yǎng)的菌絲體測量其濕重，迅速加入10 mL棕色離心管中，用蒸餾水洗滌3次后，將干菌體置于研缽中，加入液氮將菌絲體研磨成粉末狀，用含有6 mL 2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BHT的乙酸乙酯，4 ℃萃取1 h[13]，4 ℃條件下10 000 r/min離心5 min，分離上清液與沉淀，繼續(xù)用6 mL的乙酸乙酯進(jìn)行萃取。將2次上清液進(jìn)行混合，β-胡蘿卜素含量分析采用酶標(biāo)儀在450 nm下測定吸光值，待測樣品的β-胡蘿卜素含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體抗性分析及酶解孵育時(shí)間對原生質(zhì)體再生的影響

選擇潮霉素為抗性篩選標(biāo)記，需首先對三孢布拉霉NRRL2896(-)野生型菌株進(jìn)行潮霉素抗性分析。先將在平板中培養(yǎng)3～4 d的三孢布拉霉菌苔接種至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，將菌絲體進(jìn)行酶解(3 h)，將原生質(zhì)體數(shù)稀釋為1.0×107個(gè)/mL，取100 μL分別涂布在潮霉素終質(zhì)量濃度為40～120 μg/mL的麥汁固體平板上，培養(yǎng)4～5 d后觀察菌絲體生長情況。由表3結(jié)果可知潮霉素質(zhì)量濃度在80 μg/mL時(shí)三孢布拉霉原生質(zhì)體無法長為菌絲體，因此后續(xù)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)將潮霉素質(zhì)量濃度控制在 80 μg/mL。

表3 三孢布拉霉潮霉素抗性敏感度測試Table 3 Sensitivity test of Blakeslea trispora to hygromycin

真菌具有復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，在抵御外界刺激過程中發(fā)揮著重要作用[14]。絲狀真菌細(xì)胞壁主要由葡聚糖、幾丁質(zhì)、殼聚糖、甘露聚糖、糖蛋白等組成[15-17]，結(jié)構(gòu)復(fù)雜、外界物質(zhì)不易穿透，因而無法像原核生物那樣不經(jīng)處理或經(jīng)過簡單處理后即可進(jìn)行電轉(zhuǎn)化[18]，因此需要制備高質(zhì)量的原生質(zhì)體。有研究報(bào)道[7]溶壁酶(3 g/100mL)、溶菌酶(1.5 g/100mL)和蝸牛酶(1.5 g/100mL)溶解在0.6 mol/L蔗糖中黑暗孵育1.5 h可以制備出原生質(zhì)體用于電轉(zhuǎn)，而李曄[19]指出與0.6 mol/L蔗糖相比采用0.6 mol/L NaCl作為穩(wěn)滲液在28 ℃，75 r/min 避光酶解下更適合制備原生質(zhì)體，故本研究直接采用0.6 mol/L NaCl作為穩(wěn)滲液。酶解時(shí)間是影響原生質(zhì)體制備的另一個(gè)關(guān)鍵因素，時(shí)間較短原生質(zhì)體釋放的不夠，時(shí)間長原生質(zhì)體則會(huì)易破裂死亡。從圖3可知酶解3 h原生質(zhì)體的再生率最高達(dá)到約51.6%，在酶解0～3 h時(shí)再生率逐漸升高，3 h后隨著酶解時(shí)間的延長再生率下降。

圖3 酶解時(shí)間對再生率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on regeneration rate

2.2 不同電場強(qiáng)度及溫度對電轉(zhuǎn)化效率的影響

電場強(qiáng)度是影響再生率與電轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素。電場強(qiáng)度沒有達(dá)到合適的電轉(zhuǎn)閾值時(shí)電轉(zhuǎn)效率低，而過高的電場強(qiáng)度會(huì)對細(xì)胞膜造成不可逆的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[20]。因此，本研究設(shè)置了不同的電壓大小與電脈沖時(shí)間，考察其對電轉(zhuǎn)化效率與再生率的影響。如圖4-a所示，電脈沖時(shí)間為1 ms時(shí)的再生率高于3 ms時(shí)的，而與2 ms時(shí)的再生率相差不大。從圖4-b可知電壓大小與電脈沖時(shí)間對轉(zhuǎn)化效率的影響也較大。當(dāng)脈沖時(shí)間為2 ms時(shí)的轉(zhuǎn)化效率比其他兩種脈沖時(shí)間的轉(zhuǎn)化效率要高?？赡艿脑蚴堑偷拿}沖時(shí)間(1 ms)不足以將核酸穩(wěn)定地導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，脈沖時(shí)間較長(3 ms)時(shí)對細(xì)胞的損傷增加導(dǎo)致再生率低。另外，轉(zhuǎn)化效率受電壓影響很大，且在不同脈沖時(shí)間下變化趨勢一致。由此當(dāng)電壓為0.4 kV，脈沖時(shí)間為2 ms時(shí)，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最大值(15.7 CFU/μg)。

2.3 核酸濃度、電擊緩沖液的種類與再生時(shí)間對電擊轉(zhuǎn)化效率的影響

外源核酸濃度[21]、電擊緩沖液的種類與再生時(shí)間也會(huì)影響電擊轉(zhuǎn)化效率，但對再生率的影響并不顯著(數(shù)據(jù)未列出)。采用pUC57-AMA1-pgpdA-btwc-1c-TrpC-hph線性質(zhì)粒(SacI進(jìn)行單酶切)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。由圖5-a可知核酸濃度明顯影響了轉(zhuǎn)化效率，核酸濃度越高轉(zhuǎn)化效率越低；當(dāng)核酸質(zhì)量濃度在2.5 μg/mL時(shí)的轉(zhuǎn)化效率最高(約16 CFU/μg)，因此選擇2.5 μg/mL作為轉(zhuǎn)化時(shí)的核酸質(zhì)量濃度。電轉(zhuǎn)化時(shí)，電轉(zhuǎn)緩沖液為其提供了重要的環(huán)境。目前常用的介質(zhì)有蔗糖、甘油蔗糖溶液[22]、磷酸鹽緩沖液[22]或山梨醇溶液[23]等，這些介質(zhì)均能用于電轉(zhuǎn)化。由圖5-b可知采用10%甘油+0.6 mol/L的蔗糖溶液或者磷酸鹽緩沖液作為電脈沖緩沖液轉(zhuǎn)化效率較低，而1 mol/L 的山梨醇轉(zhuǎn)化效率和蔗糖溶液效果均較好，當(dāng)選擇山梨醇作為電脈沖緩沖液，其轉(zhuǎn)化效率達(dá)到30 CFU/μg。另外，電轉(zhuǎn)后原生質(zhì)體再生時(shí)間也會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率，電轉(zhuǎn)后細(xì)胞受到損傷，需要合適的環(huán)境與時(shí)間進(jìn)行修復(fù)。再生時(shí)間太長會(huì)影響野生型與轉(zhuǎn)化子生長的比例，再生時(shí)間過短細(xì)胞壁再生效果不好影響轉(zhuǎn)化效率。由圖5-c可知，再生時(shí)間為3 h時(shí)轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最大值。

a-電壓與電脈沖對再生率的影響； b-電壓與電脈沖對電轉(zhuǎn)化效率的影響圖4 三孢布拉霉電擊轉(zhuǎn)化參數(shù)的優(yōu)化Fig.4 Optimization of electric shock conversion parameters of Blakeslea trispora

a-核酸濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響；b-電脈沖緩沖液種類對轉(zhuǎn)化效率的影響；c-再生時(shí)間對轉(zhuǎn)化效率的影響圖5 核酸濃度、電脈沖緩沖液種類與再生時(shí)間對電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.5 The influence of the nucleic acid concentration, the type of electric pulse buffer and the regeneration time on the electric conversion efficiency

2.4 電擊轉(zhuǎn)化效率的正交試驗(yàn)分析

在之前單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇電壓、電脈沖時(shí)間、核酸濃度及再生時(shí)間等因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)考察它們對電擊原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響。每個(gè)因素設(shè)置4個(gè)水平，每個(gè)水平進(jìn)行3個(gè)處理，設(shè)置一個(gè)空白對照。具體參數(shù)如下：電壓(0.2、0.3、0.4、0.5 kV)、電脈沖時(shí)間(1、2、3、4 ms)、核酸質(zhì)量濃度(1、1.5、2、2.5 μg/mL)及再生時(shí)間(2、2.5、3、3.5 h)。

通過軟件正交設(shè)計(jì)助手VII 3.1設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)正交表，各個(gè)因素的離合平方差及極差結(jié)果分析如表4所示，根據(jù)每個(gè)因素不同水平的離合平方差大小，A3B2C4D3為最優(yōu)組合，轉(zhuǎn)化效率約35.1 CFU/μg。從表5方差分析可知，再生時(shí)間偏差平方和小于誤差平方和，因此再生時(shí)間歸入誤差，不考慮顯著性，而電壓大小在不同水平上存在顯著差異(P<0.05)。因此選擇最優(yōu)組合電壓0.4 kV，電脈沖2 ms，核酸質(zhì)量濃度2.5 μg/mL，再生時(shí)間3 h作為轉(zhuǎn)化最優(yōu)條件。

2.5 基于優(yōu)化的電轉(zhuǎn)化策略在三孢布拉霉中的應(yīng)用

將線性化質(zhì)粒pUC57-AMA1-pgpdA-btwc-1c-TrpC在上述最優(yōu)電轉(zhuǎn)條件下轉(zhuǎn)化至野生型三孢布拉霉中，在25 ℃條件下培養(yǎng)4～5 d，轉(zhuǎn)化效率為30 CFU/μg。在80 μg/mL的麥汁固體培養(yǎng)基中傳代3次后提取基因組以確定為陽性轉(zhuǎn)化子，隨后以pgpdA-btwc-1c框?yàn)楹Y選序列，采用引物C-F與C-R進(jìn)行PCR共篩選到8個(gè)穩(wěn)定的陽性轉(zhuǎn)化子(圖6-a)。將btwc-1c過表達(dá)菌株與野生型菌株培養(yǎng)在光照培養(yǎng)箱中，以tef1[24](轉(zhuǎn)錄因子編碼基因)作為內(nèi)源參照基因。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果表明轉(zhuǎn)化菌中btwc-1c的基因相對表達(dá)水平約為野生型菌株的2.5倍(圖6-b)，顯示了電轉(zhuǎn)化的重組載體在三孢布拉霉中表達(dá)了btwc-1c；表型分析結(jié)果表明轉(zhuǎn)化菌中β-胡蘿卜素含量相對于野生菌提高了約2.1倍，證明了轉(zhuǎn)化菌中表達(dá)的btwc-1c能夠誘導(dǎo)β-胡蘿卜素的合成。

表4 正交分析表Table 4 Orthogonal analysis table

表5 方差分析表Table 5 Table of variance analysis

M-DNA maker；1-陰性對照，以野生型為模板的PCR結(jié)果； 2-陽性對照，pUC57-AMA1-pgpdA-btwc-1c-TrpC-hph 為模板的PCR擴(kuò)增結(jié)果；3～8-陽性轉(zhuǎn)化子的PCR擴(kuò)增結(jié)果; WT-野生型三孢布拉霉；btwc-1c+-btwc-1c基因過表達(dá)的三孢布拉霉 a-pgpdA-btwc-1c框的電泳圖；b-btwc-1c基因過表達(dá)菌株與 野生型菌株相對表達(dá)水平及β-胡蘿卜素含量的比較圖6 btwc-1c基因過表達(dá)菌株的檢測Fig.6 Detection of btwc-1c gene overexpression strain

3 結(jié)論

目前對于三孢布拉霉進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化方法有農(nóng)桿菌侵染原生質(zhì)體[5]、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化[6]及電轉(zhuǎn)原生質(zhì)體[7]等，因轉(zhuǎn)化效率低造成它們的敲除效率僅在1%～10%。CRISPR/Cas9是最近幾年比較熱門的對微生物進(jìn)行分子改造的方法，成功實(shí)現(xiàn)了對粗糙脈孢菌[25]、黃青霉[26]及米曲霉[27]等絲狀真菌的分子改造。為了提高編輯效率，一般對這些絲狀真菌采用雙質(zhì)粒進(jìn)行同時(shí)導(dǎo)入。然而，由于農(nóng)桿菌侵染操作繁瑣、不能同時(shí)進(jìn)行多質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，且對三孢布拉霉原生質(zhì)體侵染效率較低導(dǎo)致開發(fā)出高效率的編輯策略受到了限制。而電轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體能夠克服上述多種問題，從而提供了一個(gè)潛在的解決方案。為了構(gòu)建高效的轉(zhuǎn)化方法從而提升三孢布拉霉的分子改造效率，本研究對三孢布拉霉電擊轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體進(jìn)行了優(yōu)化，包括制備原生質(zhì)體的酶解時(shí)間、電壓大小與電脈沖時(shí)間、緩沖液種類、核酸濃度及再生時(shí)間等。通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)分析最終確定了對培養(yǎng)48 h的三孢布拉霉在0.6 mol/L NaCl酶解液中避光酶解3 h，在1 mol/L的山梨醇電脈沖緩沖液中，核酸添加量為2.5 μg/mL，在0.4 kV、2 ms 的電轉(zhuǎn)條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)后再生培養(yǎng)3 h，最后涂布在含80 μg/mL潮霉素的麥汁固體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到了35.1 CFU/μg。最后，以電轉(zhuǎn)化btwc-1c基因?yàn)槔?，轉(zhuǎn)化菌中btwc-1c基因表達(dá)水平和β-胡蘿卜素合成水平分別提高了2.5倍和2.1倍，證明了本研究建立的轉(zhuǎn)化方法能夠有效地進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，為研究三孢布拉霉中類胡蘿卜素合成調(diào)控基因的功能奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。