張學慧，劉肖,2,3，周才瓊,3*

1(西南大學 食品科學學院，暨重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400715) 2(川北幼兒師范高等專科學校，四川 廣元，628017)3(川渝共建特色食品重慶市重點實驗室，重慶，400715)

大蒜是百合科蔥屬藥食兩用植物，有殺菌、抗癌等多種功效。但大蒜味道辛辣，食用后產(chǎn)生的含硫化合物可產(chǎn)生不快氣味[1]。加上新鮮大蒜水分高，不耐貯藏[2]。因此，有關大蒜的深加工研究一直備受關注。常見的大蒜加工產(chǎn)品有糖蒜、臘八蒜、蒜泥、蒜片和蒜粉等[3-4]。隨著人民生活水平的提高，人們越來越注重自身的健康水平，因此具有食療作用的大蒜及加工產(chǎn)品越來越受人們喜愛。如何在加工中降低生蒜刺激性，拓展大蒜的食用人群，是大蒜生加工中備受關注的研究方向。

黑蒜最初是由日本科研人員研發(fā)的可直接食用的發(fā)酵大蒜制品，因蒜瓣呈黑色而稱黑蒜；黑蒜辛辣味道下降，具有甜酸和黏彈軟糯的口感，深受好評[5-6]。黑蒜由新鮮大蒜經(jīng)長時間發(fā)酵而成，其黑變和風味品質的形成源于內(nèi)含物質的氧化降解及美拉德反應[7-8]。黑蒜首先在日韓流行，近年來開始進入我國市場[9]。然而傳統(tǒng)黑蒜發(fā)酵制作周期長達3個月，不僅能耗較高且受發(fā)酵環(huán)境溫濕度等因素變化影響很大，使黑蒜品質良莠不齊、產(chǎn)出效率低。有少量縮短黑蒜發(fā)酵時間相關的工藝研究的報道，包括變溫發(fā)酵[10]、液態(tài)發(fā)酵[11]和超高壓預處理發(fā)酵[12]等。這些研究顯示黑蒜發(fā)酵時間可縮短至約15 d，但處理工藝略顯復雜，液態(tài)發(fā)酵更是破壞了大蒜形態(tài)而影響進一步利用。而對黑蒜黑變中風味變化的研究則少見報道。如何針對大蒜黑變的機理采用適合的預處理方式以破壞其組織細胞、加速在高溫高濕發(fā)酵中的黑變以及探究形成黑蒜產(chǎn)品感官及風味品質的差異值得進一步探討。

目前，微波和冷凍是應用較廣的2種預處理方式，被廣泛應用于物質的輔助提取以及輔助干燥等方面，例如多糖、色素、茶葉籽油的輔助提取[13-15]以及果蔬的輔助干燥[16-17]等。微波通過激發(fā)食料水分子間摩擦生熱可有效提升內(nèi)部溫度而破壞組織[18]，凍結處理通過凍融過程中冰晶形成導致組織細胞破壞進而改變細胞膜的滲透性[19]，為此，本研究選擇微波熱處理和凍結冷處理2種預處理破壞方式探討其對發(fā)酵黑蒜感官和風味品質的影響，為進一步縮短黑蒜發(fā)酵時間探究預處理對黑蒜產(chǎn)品品質的影響、探索預處理方式帶來的品質影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大蒜：紫紅天蒜，來自重慶市巫山貴仲農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司；硫酸鉀、硫酸銅、無水碳酸鈉、葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸、溴甲酚綠、亞鐵氰化鉀、茚三酮、沒食子酸、焦性沒食子酸，成都市科龍化工試劑廠；丙酮酸、2，4-二硝基苯肼、三氯乙酸、福林酚試劑，重慶駿偉廣生科技有限公司；NaOH、乙酸鈉、乙二醇、異丙醇，重慶川東化工試劑廠。以上均為分析純。

1.2 儀器與設備

西門子KK28F58生物保鮮冰箱，德國西門子公司；EG823LA6-NR微波爐，佛山市美的電器制造有限公司；AQ-180E多用途粉碎機，慈溪市耐歐電器有限公司；雷磁PHS-3C型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；UltraScan PRO測色儀，美國HunterLab公司；SH010恒溫恒濕試驗箱，上海福絮實驗室儀器設備廠；TA.Plus 物性測定儀，英國Stable Micro System公司；TG16G離心機，常州崢嶸儀器有限公司；UV-2450紫外-可見分光光度計、GCMS-2010氣相質譜聯(lián)用儀，日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大蒜預處理及黑蒜發(fā)酵條件

經(jīng)預實驗確定大蒜預處理及發(fā)酵條件如下：

凍結預處理：挑選完整蒜頭置-20 ℃下48 h，取出解凍后于40 ℃、80%相對濕度(relative humidity,RH)下放置48 h，得凍結預處理大蒜頭(freeze gallic，F(xiàn)G)。

微波預處理：挑選完整蒜頭500 g，微波處理10 s(微波功率640 W)后于40 ℃、80% RH下放置48 h，得微波預處理大蒜頭(microwave pretreated garlic，MG)。

黑蒜發(fā)酵條件：75 ℃、80% RH下發(fā)酵12 d，分別得到凍結預處理發(fā)酵黑蒜(freeze-black gallic，F(xiàn)-BG)和微波預處理發(fā)酵黑蒜(microwave-black gallic，M-BG)。

1.3.2 分析方法

1.3.2.1 色澤[20]

選擇大小相近的蒜瓣經(jīng)充分研磨后分析。以標準白板校準，測量時分別記錄L*、a*和b*值為所測樣品亮度、紅度和黃度值，重復測定6次。總色差值以ΔE表示，計算如公式(1)所示：

(1)

式中：L軸，0代表黑，100代表白；a軸，正值為紅，0為中性，負值為綠；b軸，正值為黃，0為中性，負值為藍；L*，a*，b*表示處理前蒜瓣色值；ΔL*、Δa*和Δb*表示處理后蒜瓣色值。

1.3.2.2 質構

取大小一致的蒜瓣樣品分析。測試條件：探頭P/5；預壓速度1 mm/s；下壓速度1 mm/s；壓力6 g；2次之間停留速度5 s。

1.3.2.3 大蒜素

參考朱君芳等[21]的方法，稍作修改。樣品經(jīng)磨碎混勻后于100 ℃水浴30 min，取2.0 g加入25 mL三氯乙酸溶液(80 g/L)，4 000 r/min離心15 min得上清液(滅酶組)。將經(jīng)磨碎混勻后的樣品于30 ℃水浴下反應10 min，稱取2.0 g加入25 mL 三氯乙酸溶液(80 g/L)，離心15 min(4 000 r/min)得上清液(測定組)。于520 nm處測吸光度，再根據(jù)標準曲線(y=0.011 5x+ 0.006 8，R2=0.999 6)計算樣品中丙酮酸含量，分別得到滅酶組與測定組丙酮酸含量及差值m，大蒜素含量計算如公式(2)所示：

(2)

式中：162為大蒜素的相對分子質量；88為丙酮酸的相對分子質量；2為蒜氨酸分解成大蒜素和丙酮酸的系數(shù)。

1.3.2.4 其他成分

含水量測定參考GB 5009.3—2016/直接干燥法；總酸測定參考GB/T 12456—2008(檸檬酸計)；可溶性糖測定參考NY/T 2742—2015/ 3,5-二硝基水楊酸比色法；總酚測定參考參考文獻[22]中的Folin-Ciocalteu法(沒食子酸制備標準曲線)稍作修改。

1.3.2.5 揮發(fā)性成分

參考潘璨等[23]的方法并稍作修改。

(1)萃取條件：準確稱取2.0 g樣品置于20 mL頂空進樣瓶，50 ℃水浴平衡30 min后，推出固相微萃取萃取頭，50 ℃下水浴萃取30 min。進樣分析。

(2)GC條件：Ⅰ.鮮蒜及預處理蒜色譜條件為DB-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)石英毛細管色譜柱，進樣口溫度250 ℃；載氣(He)流速1 mL/min，不分流；進樣量2 mL。升溫程序為初始50 ℃維持1 min后以3 ℃/min 升溫速率升溫至75 ℃，維持1 min后以1 ℃/min 速率升至110 ℃，維持3 min后再以2 ℃/min 速率升至150 ℃并維持2 min，最后以10 ℃/min 速率使溫度升至280 ℃，維持3 min。Ⅱ.黑蒜色譜條件：柱型、進樣口溫度、載氣流速、進樣量同上，起始柱溫50 ℃維持2 min后，以1 ℃/min升溫速率升溫至75 ℃并維持1 min，然后以10 ℃/min升至90 ℃，維持1 min，再以3 ℃/min升至210 ℃，最后以10 ℃/min升至280 ℃，維持1 min。

(3)MS條件：電子轟擊電離源，電子轟擊能量，70 eV，離子源溫度250 ℃，接口溫度280 ℃，質量掃描范圍50～500 amu。

(4)數(shù)據(jù)處理：通過NIST08和NIST08S質譜數(shù)據(jù)庫檢索各組分，結合保留指數(shù)和人工質譜解析及參考文獻等定性分析。按峰面積歸一法計算各組分相對含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

結果以mean±SD表示，采用Origin 2019b作圖，SPSS 20.0進行單因素方差分析和Pearson相關性分析。P<0.01表示極顯著，P<0.05表示顯著。

2 結果與分析

2.1 兩種預處理制備黑蒜色澤比較分析

如圖1所示，新鮮大蒜呈乳白色，凍結預處理后大蒜色澤呈棕黃色，而微波預處理的蒜瓣和鮮蒜近似，12 d發(fā)酵完成后，均完成黑變。分析色值顯示2種預處理大蒜的ΔE均高于鮮蒜，其中FG色值遠高于MG(P<0.05)，表明凍結預處理導致大蒜色澤顯著變化，這與凍結形成大的冰晶，破壞了大蒜細胞結構，增加了底物的釋放和接觸并促進了美拉德反應的進行有關[24]。進一步控溫控濕發(fā)酵制成黑蒜后ΔE快速升高(P<0.05)，為73.60～75.40，2種預處理之間色變無差異(圖2)。

圖1 兩種預處理及制備黑蒜色澤變化Fig.1 Color changes of black garlic prepared by two pretreatments

圖2 兩種預處理及制備黑蒜ΔE變化Fig.2 ΔE changes of black garlic prepared by two pretreatments注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 兩種預處理制備黑蒜含水量及質構特征比較分析

如表1所示，鮮蒜含水量為66.03%，2種預處理大蒜含水量略有下降，變幅在64.8%～65.5%，其中FG含水量相對較低，可能原因是冰晶解凍過程中導致細胞液外滲造成。2種預處理大蒜經(jīng)控溫控濕發(fā)酵成黑蒜后含水量顯著降低(P<0.05)，為32.1%～33.4%。不同預處理方式對黑蒜含水量變化影響不大(P>0.05)。

適當?shù)乃趾坑欣谛纬珊谒獾牧己每诟?。進一步分析2種預處理大蒜及制備黑蒜的質構變化(表1)，2種預處理大蒜的硬度、黏彈性和咀嚼感均低于鮮蒜，表明凍結和微波預處理均可導致大蒜軟化，其中硬度和黏彈性FG顯著低于MG(P<0.05)，這可能與凍結中形成的冰晶對大蒜組織的破壞有關。2種預處理大蒜經(jīng)進一步控溫控濕發(fā)酵成黑蒜后，硬度、黏彈性和咀嚼感顯著下降(P<0.05)，但不同預處理之間無差異(P>0.05)。表明不同預處理不影響黑蒜產(chǎn)品質構特性。

表1 兩種預處理及制備黑蒜含水量及質構特征變化Table 1 Changes of water content and texture characteristics of black garlic prepared by two kinds of pretreatment and preparation

2.3 兩種預處理制備黑蒜滋味品質比較分析

如圖3和圖4所示，預處理可提升大蒜可溶性糖含量(P<0.05)，F(xiàn)G略高于MG；但預處理對大蒜總酸含量影響不大。經(jīng)控溫控濕發(fā)酵制成黑蒜后，F(xiàn)-BG 和M-BG的可溶性糖和總酸含量均顯著高于發(fā)酵前(P<0.05)，可溶性糖含量分別是發(fā)酵前的4.19倍和4.37倍；總酸含量分別是發(fā)酵前的5.02倍和4.83倍，但F-BG和M-BG無差異。表明發(fā)酵可提升黑蒜產(chǎn)品酸甜滋味品質，但與預處理方式無關?？扇苄蕴呛匡@著提升的原因可能是大蒜經(jīng)凍結、微波預處理后，蒜組織細胞瓦解促進了大蒜多糖的分解和可溶性糖的積累?？偹岷匡@著上升可能與發(fā)酵過程中大分子降解等有關。

圖3 兩種預處理及制備黑蒜可溶性糖含量分析Fig.3 Analysis of soluble sugar content in black garlic prepared by two pretreatments

圖4 兩種預處理及制備黑蒜總酸含量分析Fig.4 Analysis of total acid content in black garlic prepared by two pretreatments

2.4 兩種預處理制備黑蒜特征功能成分比較分析

如圖5和圖6所示，預處理使大蒜素含量顯著低于鮮蒜，F(xiàn)G顯著低于MG(P<0.05)，說明凍結處理可快速破壞大蒜組織細胞；2種預處理大蒜多酚含量也顯著低于鮮蒜，其中MG顯著低于FG，表明微波處理對大蒜多酚破壞力更強。進一步發(fā)酵制成黑蒜后，F(xiàn)-BG和M-BG中大蒜素和多酚含量均顯著低于發(fā)酵前(P<0.05)，表明高溫高濕發(fā)酵可導致具有苦澀味感的大蒜特征性功能成分多酚和大蒜素降解，這種降解一方面降低了黑蒜產(chǎn)品苦澀的味感，而降解產(chǎn)物及可能的功能性質值得進一步研究。

圖5 兩種預處理及制備黑蒜大蒜素含量分析Fig.5 Content analysis of allicin in black garlic prepared by two pretreatments

圖6 兩種預處理及制備黑蒜總多酚含量變化Fig.6 Content analysis of total polyphenols in black garlic prepared by two pretreatments

2.5 兩種預處理制備黑蒜揮發(fā)性風味成分比較分析

鮮蒜、微波及凍結預處理大蒜和制備黑蒜檢出含硫化合物及風味特征見表2，G、FG、MG、F-BG和M-BG分別檢出19、17、18、23和19種物質，鮮蒜及預處理大蒜以具有辛辣和蒜香氣味的硫醚類為主，其中，G和 FG硫醚類相對含量分別達75.78%和81.78%，以具辛辣刺激蒜味的二烯丙基二硫醚占比最高，而二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚是大蒜素的主要成分[25]。發(fā)酵成黑蒜后，F(xiàn)-BG和M-BG中二烯丙基二硫醚占比下降，具有蒜香味的二烯丙基硫醚從原料的1.16%分別增至45.12%和46.82%，使黑蒜辛辣刺激性下降，同時具有蒜香味和炭烤風味的噻烷類及果香甜味和炭烤香味的呋喃類物質增加，可能因為升溫導致硫醚類化合物中的不穩(wěn)定鍵斷裂，產(chǎn)生了噻吩、呋喃類化合物[25]，賦予黑蒜特別的芳香氣味。

2.5.1 揮發(fā)性含硫化合物的主成分分析

對樣品中的各類揮發(fā)性物質相對含量進行主成分分析，得到各主成分的特征值、方差貢獻率、累計方差貢獻率，特征根λ1=4.981，特征根λ2=2.021，前2個主成分累計方差貢獻率達87.523%，涵蓋了大部分信息。

揮發(fā)性物質載荷分析如圖7所示，酯類和酰胺類含硫化合物與PC1高度正相關(載荷系數(shù)>0.9)，而相對含量較高的硫醚類風味物質與PC1高度負相關(載荷系數(shù)<-0.9)；PC2中載荷最高的正相關揮發(fā)性物質為噻吩類。上述結果說明，酰胺類、含硫化合物、酯類、硫醚類和噻吩類是從鮮蒜到黑蒜中含量發(fā)生顯著變化的揮發(fā)性物質。進一步觀察發(fā)現(xiàn)G、FG、MG、F-BG、M-BG位于3個象限(圖8)，表明它們之間有較大差異。G、FG、F-BG和M-BG均位于PC1負半軸，在PC1中，F(xiàn)-BG和M-BG之間無明顯差異，與G和FG之間的差異主要體現(xiàn)在硫醚類揮發(fā)性物質的不同，與MG的差異體現(xiàn)在硫醚類、酯類和酰胺類揮發(fā)性物質間的不同；在PC2中，F(xiàn)-BG、M-BG和MG均位于正半軸，三者間差異主要體現(xiàn)在噻吩類揮發(fā)性物質的不同，與G和FG之間的差異主要體現(xiàn)在噻吩類和硫醚類揮發(fā)性物質的不同。

表2 微波及凍結預處理及制備黑蒜揮發(fā)性成分種類及含量比較Table 2 Comparison of the types and contents of volatile components of microwave and freezing pretreatment and preparation of black garlic

具體看，M-BG和F-BG中，硫醚類占主導，相對含量最高的是具蒜香味的二烯丙基硫醚，分別是46.82%和45.12%，較鮮蒜顯著增加；次高的是二烯丙基二硫醚，相對含量23.21%和24.82%，較鮮蒜明顯下降；其余的硫醚類揮發(fā)性物質較鮮蒜均顯著降低。鮮蒜中3-乙烯基-4-烯-1,2-環(huán)己硫醚、二戊基二硫醚、3-乙烯基-5-烯-1,2-環(huán)己硫醚、烯丙基甲基二硫醚均未在M-BG和F-BG中檢出，這可能與硫醚類化合物的不穩(wěn)定性有關，這種變化引起各組分間相對含量變化，使黑蒜產(chǎn)品刺激性氣味顯著降低。同時，F(xiàn)-BG中具有蒜香味和炭烤香味的噻烷類物質含量較鮮蒜顯著增加,從6.92%升至11.28%。F-BG和M-BG中均產(chǎn)生了鮮蒜中沒有的具有果香甜味和炭烤香味的呋喃類物質。加上其他揮發(fā)性香氣物質，共同構成了黑蒜的特殊香氣。

圖7 樣品中揮發(fā)性物質的載荷分析圖Fig.7 Load analysis diagram of volatile substances in samples

圖8 樣品的得分圖Fig.8 Score chart of samples

2.5.2 揮發(fā)性風味物質歸類及氣味貢獻值分析

經(jīng)對揮發(fā)性氣味進行歸類(圖9)，F(xiàn)-BG和M-BG相較于G、FG和MG新產(chǎn)生出了甜味、酒香味和油脂香味，特別是呈果香甜味的物質急劇增多。味道濃郁的蒜香和洋蔥味相對降低，具有辛辣和刺激性氣味的物質急劇減少。

圖9 揮發(fā)性物質的氣味類型Fig.9 Odor types of volatile substances

查閱風味成分氣味閾值并計算其氣味貢獻值(表3)發(fā)現(xiàn)鮮蒜氣味主要由具有辛辣刺激蒜味的二烯丙基三硫醚和二烯丙基二硫醚構成，氣味貢獻值占比44.79%；凍結預處理氣味仍主要由二烯丙基三硫醚和二烯丙基二硫醚構成(氣味貢獻值占比46.04%)；微波預處理氣味值增加較大的是具有蒜香味和炭烤香味的 1,3-二噻烷和1,3,5-三噻烷，二烯丙基三硫醚和二烯丙基二硫醚氣味貢獻值占比降至20.41%，而1,3-二噻烷和1,3,5-三噻烷氣味貢獻占比7.53%(鮮蒜和FG分別僅為1.16%和0.45%)，表明微波預處理可影響產(chǎn)品風味。發(fā)酵成黑蒜后，F(xiàn)-BG和M-BG氣味值主要成分依然是二烯丙基三硫醚和二烯丙基二硫醚，但氣味貢獻值占比分別為39.31%和37.58%，具有蒜香味和炭烤香味的二烯丙基硫醚和噻烷類的氣味貢獻值占比分別為22.51%和17.66%，F(xiàn)-BG中1,3,5-三噻烷氣味貢獻值6.70%；僅在黑蒜中發(fā)現(xiàn)的具有果香甜味和炭烤味的丁酸苯乙酯和呋喃類氣味貢獻值占比分別為0.26%和0.44%。揮發(fā)性風味物質氣味貢獻分析顯示，不同預處理可影響黑蒜產(chǎn)品風味，微波預處理可提升黑蒜產(chǎn)品炭烤香味和焦糖及果香甜味。

表3 不同處理方式下的大蒜及蒜泥的氣味活性值及其風味描述Table 3 Odor activity value and flavor description of garlic and garlic paste under different treatments

3 結論

采用凍結冷處理和微波熱處理2種預處理方式處理大蒜頭并控溫控濕發(fā)酵使大蒜完成黑變，并比較了2種預處理方式及對制備黑蒜風味品質的影響。在感官品質方面，2種預處理蒜頭經(jīng)發(fā)酵12 d即完成黑變，ΔE為73.60～75.40，含水量顯著下降，黑蒜的硬度、黏彈性和咀嚼感下降(P<0.05)，在滋味品質及特征功能成分方面，2種預處理大蒜發(fā)酵制備成黑蒜后，可溶性糖和總酸含量顯著升高，具有辛辣味感的大蒜素和苦澀味感的多酚含量顯著下降(P<0.05)，2種預處理之間無顯著差異。這種變化降低了黑蒜產(chǎn)品辛辣苦澀的味感，賦予了黑蒜濃郁的酸甜滋味。大蒜素及多酚的下降原因及可能產(chǎn)生的其他成分有待進一步研究。揮發(fā)性含硫化合物分析顯示，鮮蒜和預處理大蒜以具有辛辣氣味的二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚為主，經(jīng)發(fā)酵成黑蒜后，具有蒜香味的二烯丙基硫醚升高，同時產(chǎn)生了酯類、噻吩和呋喃類物質，賦予了黑蒜炭烤香味和果香甜味。進一步主成分分析和氣味貢獻值分析，黑蒜的特征性風味是蒜香味，還有炭烤香味和微弱的果香甜味。凍結預處理獨具有蒜香味的1,3,5-三噻烷，氣味貢獻值為6.70%；微波預處理制備黑蒜有更高的有炭烤香味和果香甜味的2-甲基-1,3-二噻烷、丁酸苯乙酯和呋喃類。表明不同預處理會影響黑蒜產(chǎn)品風味，微波預處理制備黑蒜風味更佳。