王宇霞，馬云翔，茍麗娜，李敏，張盛貴

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)

馬鈴薯淀粉(native starch，NS)是主要的淀粉資源，原淀粉易老化、穩(wěn)定性差、溶解性差等缺點限制了其商業(yè)應(yīng)用，可通過氧化、酯化、醚化等化學(xué)方法改性[1]，拓展其性質(zhì)，以滿足特定的應(yīng)用需求。羧甲基淀粉(carboxymethyl starch，CMS)可溶于冷水，有良好的凍融穩(wěn)定性和透明度，隨著取代度(degree of substitution，DS)增加，其溶解性和凍融穩(wěn)定性均顯著提高，在工業(yè)上引起了極大的關(guān)注，被廣泛應(yīng)用于食品、制藥、紡織和造紙等行業(yè)[2]。槲皮素是一種黃酮類化合物，其具有抗炎、抗病毒和抗氧化等多種生理和藥理活性，在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[3]。槲皮素的低水溶性限制了其在人體內(nèi)的吸收，導(dǎo)致生物利用度降低[4]。有研究表明，淀粉可以作為槲皮素的有效傳遞載體，使槲皮素分布均勻并能提高其水溶性和生物利用度[5]，其中淀粉的溶解性和裝載量是關(guān)鍵性指標(biāo)，成為功能性載體改性淀粉的研究熱點。

原淀粉天然較差的孔隙結(jié)構(gòu)(總孔隙面積和孔隙率較低)限制了其在吸附方面的應(yīng)用。多孔淀粉(porous starch，PS)作為一種擁有大量孔洞的新型改性淀粉，增加了淀粉顆粒的比表面積，提高了其吸附性能[6]。JU等[7]采用玉米多孔淀粉對香精油進(jìn)行微膠囊化(porous starch microcapsules-essential oils，PSM-EOs)，使其具有優(yōu)異的緩釋抗菌效果。WANG等[8]制備多孔玉米淀粉對葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidins，GSPs)進(jìn)行吸附，結(jié)果表明這種淀粉可以作為一種理想的吸附劑來提高GSPs的利用率并保持其抗氧化活性。HU等[9]制備交聯(lián)多孔淀粉(cross-linked porous starch，CPS)吸附制革廢水中的六價鉻，實驗顯示CPS對重金屬離子鉻和鉛表現(xiàn)出優(yōu)越的吸附性能。因此，與原淀粉相比，PS作為反應(yīng)主體，不僅使反應(yīng)客體與淀粉的接觸面積增加，還能使比表面積進(jìn)一步擴大，獲得更高的DS和更大的負(fù)載量。

羧甲基化制備變性淀粉的報道較多，但淀粉多孔結(jié)構(gòu)對羧甲基反應(yīng)、樣品性質(zhì)的影響，以及應(yīng)用效果的研究鮮見報道。本研究以馬鈴薯多孔淀粉為材料，通過羧甲基化改性，以獲得更高取代度、溶解性和裝載能力的材料，為載體淀粉材料的應(yīng)用提供新選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯原淀粉(BR)上海源葉試劑公司;氯乙酸鈉(AR)上海麥克林生化科技有限公司;槲皮素(97%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))上海麥克林生化科技有限公司；D2O(純度≥99.9%)劍橋同位素實驗室；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HCJ-4D恒溫磁力攪拌水浴鍋，常州市瑞華儀器制造有限公司；JSM-6701F冷場發(fā)射型掃描電子顯微鏡，日本電子光學(xué)公司；NEXUS-670傅立葉紅外光譜儀，美國Thermo公司；AVance NEO 600MHz寬腔固體超導(dǎo)核磁共振波譜儀，布魯克公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 馬鈴薯多孔淀粉的制備

參照BUDARIN等[10]的方法稍做修改：將15 g馬鈴薯原淀粉加入100 mL蒸餾水中，先于40 ℃水浴鍋中攪拌(100 r/min)20 min，再升溫至90 ℃繼續(xù)攪拌1 h，然后4 ℃貯存72 h以獲得淀粉凝膠。將切成方塊(約1 cm×1 cm×1 cm)的凝膠浸入無水乙醇，重復(fù)5次，每次約1 h。將沉淀物于50 ℃干燥4 h，研磨過100目篩后備用。

1.3.2 羧甲基淀粉和羧甲基多孔淀粉(carboxymethyl porous starch，CMPS)的制備

參照ZHANG等[11]的方法并做適當(dāng)修改：將2.0 g NS或PS分別分散在20 mL 90%異丙醇中，攪拌20 min以形成懸浮液。溫度保持在30 ℃，加入0.98 g NaOH攪拌1 h，升溫至40 ℃后加入一定量的氯乙酸鈉(sodium chloroacetate，SMCA)，反應(yīng)3 h后離心得淀粉漿，然后懸浮在80%乙醇中，再用10%乙酸溶液將pH調(diào)至7.0，離心混合物用80%乙醇洗滌至濾液硝酸銀氯化物測試為陰性。置于恒溫干燥箱50 ℃干燥6 h，過100目篩制得CMS或CMPS備用。

1.3.3 取代度的測定

參照陳慶[12]的方法適當(dāng)修改：稱取一定量樣品于核磁管中，加入D2O，超聲30 s充分溶解并去除溶解氧對實驗的影響，使用核磁共振波譜儀TXISz探針在25 ℃下掃描測定。

核磁共振氫譜(1H nuclear magnetic resonance，1H NMR)圖譜(圖3)中，5.69處峰為脫水葡萄糖單元(anhydro glucose unit， AGU)中H-1質(zhì)子信號，3.85處為CMS接枝鏈—CH2COOH上的亞甲基質(zhì)子信號峰(H-7)。由3.85處質(zhì)子峰面積與5.69處質(zhì)子峰面積關(guān)系計算樣品DS，如公式(1)所示：

(1)

式中：Asignal為樣品在3.85處的峰面積，Nsignal為樣品在3.85處的質(zhì)子數(shù)；AAGU為樣品在5.69處的峰面積，NAGU為樣品在5.69處的質(zhì)子數(shù)。

1.3.4 掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)分析

用導(dǎo)電膠將少量樣品粉末粘在樣品座上，將樣品座置于離子濺射儀中鍍金60 s后，用掃描電鏡在不同放大倍數(shù)下觀察樣品粉末的形態(tài)特征。

1.3.5 傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR)分析

樣品的紅外光譜測定采用溴化鉀壓片法。將適量溴化鉀與1 mg干燥樣品粉末混合均勻，碾磨至無顆粒感后壓片處理，掃描波長為4 000～500 cm-1。

1.3.6 液態(tài)核磁分析(1H NMR)

用德國Bruker公司的型號為Ascend 600MHz/AVance NEO的核磁共振光譜儀進(jìn)行表征，以D2O為溶劑。

制樣方法：稱取5～10 mg的待測樣品置于核磁管中，然后加入D2O，溶解后測試。

1.3.7 X射線衍射分析(phase analysis of xray diffraction，XRD)

采用X射線衍射儀在5°～30°的掃描范圍內(nèi)測定樣品的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。

1.3.8 N2-吸/脫附分析

利用Micromeritics ASAP 2020 M系統(tǒng)測得樣品的N2-吸脫附等溫線。利用非定域密度泛函理論得到孔徑的尺寸分布曲線。依據(jù)Brunauer-Emmett-Teller(BET)多層吸附理論計算比表面積。

1.3.9 熱重分析(thermogravimetric analysis，TGA)和微商熱重分析(derivative thermogravimetry，DTG)

采用熱重分析儀研究樣品的熱特性。氮氣，升溫速率10 ℃/min，溫度為50～600 ℃。

1.3.10 吸附性能分析

1.3.10.1 復(fù)合物羧甲基淀粉吸附槲皮素(carboxymethyl starch@quercetin，CMS@Q)和羧甲基多孔淀粉吸附槲皮素(carboxymethyl porous starch@quercetin，CMPS@Q)的制備

以CMS吸附槲皮素評價其吸附性能，參照AHMAD等[13]的方法并做適當(dāng)修改制備復(fù)合物(CMS@Q)：槲皮素以10 mg/mL的質(zhì)量濃度溶解在無水乙醇中，以V(溶解液)∶V(羧甲基淀粉)=1∶10滴加到羧甲基淀粉中，超聲處理5 min使其體系分布均勻，在40 ℃下磁力攪拌1 h，樣品真空凍干后在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

CMPS@Q的制備參照CMS@Q的制備。

1.3.10.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考劉維信等[14]的方法并做適當(dāng)修改，準(zhǔn)確稱取槲皮素25.0 mg于250 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并稀釋至刻度，得到100 mg/L的儲備液。用儲備液分別配制1～5 mg/L槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液, 以無水乙醇為參比液分別測定其在360 nm處的吸光度，繪制質(zhì)量濃度(C，mg/L)- 吸光度(A)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.10.3 負(fù)載率的測定

根據(jù)AHMAD等[13]的方法適當(dāng)修改：分別稱取0.22 g CMS@Q和CMPS@Q加入10 mL蒸餾水中制成懸浮液，離心(3 000 r/min，5 min) 棄上清液，沉淀物重新懸浮在10 mL水中并超聲30 min以從復(fù)合物中提取負(fù)載的槲皮素。懸浮液離心(5 000 r/min，10 min)后收集上清液。用紫外分光光度計測定上清液在360 nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定槲皮素含量。

1.3.10.4 水溶性分析

將樣品配成20 g/L的溶液，在沸水浴中持續(xù)攪拌30 min后迅速冷卻至室溫。離心(3 000 r/min，20 min)后取上清液于105 ℃干燥4 h，得到水溶物質(zhì)的質(zhì)量。溶解度計算如公式(2)所示：

(2)

1.3.11 統(tǒng)計分析

每組實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用Origin 8及SPSS 25進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 羧甲基淀粉和羧甲基多孔淀粉取代度

在淀粉羧甲基化過程中NaOH為反應(yīng)體系提供堿性環(huán)境，并活化淀粉使其變成具有反應(yīng)活性的鈉鹽，促使醚化劑擴散滲透到淀粉顆粒結(jié)構(gòu)中，加快反應(yīng)速度[15]。PS結(jié)構(gòu)中孔徑和孔深度的增加提供了更大的比表面積[16]，與醚化劑(SMCA)有更多的反應(yīng)位點，能賦予醚化產(chǎn)物更大的取代度。本實驗在淀粉質(zhì)量濃度為100 g/L，醚化溫度為40 ℃，醚化時間為3 h條件下分析不同SMCA水平處理的改性淀粉DS(表1)。當(dāng)SMCA添加量為0.006 mol時，CMS的DS為0.19，相同制備條件下CMPS的DS為0.25。隨著SMCA的增加，CMPS的DS也隨之增加，SMCA添加量增加3倍時DS增加5.8倍，表明多孔處理能增加反應(yīng)位點，促使反應(yīng)更易發(fā)生，在SMCA改性葛根淀粉中也觀察到相似的結(jié)果[17]。

2.2 SEM分析

NS、PS、CMPS及CMS的SEM顯示在圖1中。NS表面平滑規(guī)整，顆粒呈圓形或卵圓形，且沒有可見的孔。多孔淀粉破壞了原淀粉的原有結(jié)構(gòu)，表面出現(xiàn)豐富且均勻的孔，可提供更大的比表面積，釋放更多的羥基基團(tuán)與SMCA發(fā)生反應(yīng)[18]。在醚化反應(yīng)后，CMS表面粗糙顆粒破碎，出現(xiàn)向內(nèi)塌陷的洞，CMPS顆粒表面凹凸不平，這表明在羧甲基化過程中，由于強堿作用，導(dǎo)致淀粉顆粒溶脹變形[15]，多孔結(jié)構(gòu)坍塌。SEM結(jié)果表明，醚化反應(yīng)破壞了多孔淀粉顆粒的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

表1 羧甲基淀粉和羧甲基多孔淀粉的DSTable 1 Degree of substitution of CMS and CMPS

a-馬鈴薯原淀粉；b-多孔淀粉；c-羧甲基淀粉；d-羧甲基多孔淀粉圖1 馬鈴薯原淀粉、多孔淀粉、羧甲基淀粉及羧甲基多孔淀粉的SEM(×5 000)圖Fig.1 SEM(×5 000) images of NS、PS、CMS and CMPS

2.3 FT-IR分析

馬鈴薯原淀粉、多孔淀粉、羧甲基淀粉和羧甲基多孔淀粉的FT-IR光譜如圖2所示。由圖2可以看出NS與PS出峰位置一致，是因為多孔化改性會影響氫鍵的位置和數(shù)量，但不會引入新的官能團(tuán)[19]。與PS相比，CMPS觀察到在3 428 cm-1處出現(xiàn)淀粉羥基的伸縮振動峰，在1 605、1 422、1 324 cm-1處出現(xiàn)羧酸鹽的拉伸振動峰，說明淀粉分子上引入了羧甲基基團(tuán)。這與LIU等[20]先前的研究一致，且3個峰的強度也隨DS的增加而增加。由圖2可以看出CMS與CMPS出峰位置一致，說明NS與SMCA間也成功形成了醚鍵。

圖2 馬鈴薯原淀粉、多孔淀粉、羧甲基淀粉和 羧甲基多孔淀粉的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of NS、PS、CMS and CMPS

2.4 液態(tài)核磁分析

對多孔淀粉、氯乙酸鈉、羧甲基淀粉和羧甲基多孔淀粉進(jìn)行1H NMR分析，4.7處出現(xiàn)的峰是溶劑峰(D2O)。如圖3中的a所示，根據(jù)文獻(xiàn)給出了多孔淀粉分子中氫原子的對應(yīng)信號[21]。圖3中的b中3.9處出現(xiàn)的峰是SMCA中亞甲基的質(zhì)子峰(H-8)。由圖3中可以看出CMS(圖3中的c)與CMPS的出峰位置一致，圖3中的d、e、f中3.85處出現(xiàn)的峰是CMPS中的質(zhì)子峰(H-7)，且峰強度隨DS的增加而增加。結(jié)果表明，通過醚化反應(yīng)成功形成了SMCA與PS之間的骨架連接。

圖3 多孔淀粉、氯乙酸鈉、羧甲基淀粉和羧甲基 多孔淀粉的1H NMR譜圖Fig.3 1H NMR spectra of PS、SMCA、CMS and CMPS

2.5 XRD分析

NS、PS、CMS和CMPS的X射線衍射圖如圖4所示。NS顯示出典型的B型衍射峰，分別在5.7°、15.2°、16.8°、22.8°處有其特征衍射峰。PS在制備過程中經(jīng)過高溫(90 ℃)糊化，使淀粉粒分子間的氫鍵斷開，導(dǎo)致晶體結(jié)構(gòu)消失，呈無定形物質(zhì)的分散性寬峰[19]。羧甲基化過程使淀粉羥基內(nèi)的分子間氫鍵斷裂，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)的變化，CMS沒有結(jié)晶形態(tài)，表明其具有無定形特征[22]。PS和CMPS之間的峰形幾乎沒有差異，CMS的峰形為彌散峰，未發(fā)生重結(jié)晶現(xiàn)象，這表明羧甲基化反應(yīng)主要發(fā)生在淀粉的無定形區(qū)域，該結(jié)果與HE等[23]的研究一致。

圖4 馬鈴薯原淀粉、多孔淀粉、羧甲基淀粉和 羧甲基多孔淀粉的X射線衍射圖譜Fig.4 XRD profile of NS、PS、CMS and CMPS

2.6 N2-吸/脫附分析

國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會根據(jù)孔徑大小將孔隙分為三大類：微孔(<2 nm)、介孔(2～50 nm)、大孔(>50 nm)[24]。NS、PS、CMS和CMPS的BET表面積及孔徑分布圖如圖5所示。利用BET模型計算出NS的比表面積僅為0.02 m2/g，而PS的比表面積高達(dá)42.88 m2/g，PS的平均孔徑為16.94 nm，屬于介孔材料。醚化反應(yīng)制備的CMS的比表面積為0.87 m2/g，平均孔徑為7.36 nm，CMPS的比表面積為12.06 m2/g，相較于PS降低了71.88%，但相較于CMS提高了88.81%，平均孔徑為8.82 nm，較PS縮小了47.93%，較CMS提高了16.55%。CMPS比表面積較PS大幅降低，可能是由于在羧甲基化反應(yīng)過程中，淀粉溶脹變形，部分孔洞坍塌造成[15]，但較CMS有較高比表面積。CMPS平均孔徑較PS更小，有文獻(xiàn)表明適當(dāng)減小孔徑可以增強毛細(xì)作用力有助于更高的負(fù)載[25]。

2.7 熱重分析

淀粉熱特性TGA和DTG曲線如圖6所示。如圖6-a所示，所有樣品的TGA曲線中觀察到3個階段的重量損失。第一階段發(fā)生在120 ℃以下，由水蒸發(fā)引起的重量損失約7%；第二階段發(fā)生在300 ℃以下，由于羥基縮合形成的水發(fā)生分解引起主要的重量損失；當(dāng)溫度達(dá)到500 ℃時，會導(dǎo)致碳化和灰分形成并釋放CO2。在羧甲基化過程中會生成其他無機成分，所以羧甲基化樣品的剩余質(zhì)量高于PS[26]。此外，由圖6-b可知，PS，CMS的最大熱分解溫度分別為338、295 ℃，3個樣品的CMPS最大熱分解溫度分別為300、304、306 ℃，隨DS增加，最大熱分解溫度升高。實驗表明，CMPS的熱穩(wěn)定性隨著DS的增加而增加，但羧甲基化降低了熱降解的初始溫度以及淀粉的熱穩(wěn)定性。

a-馬鈴薯原淀粉BET表面積圖；b-多孔淀粉BET表面積圖；c-羧甲基淀粉BET表面積圖；d-羧甲基多孔淀粉BET表面積圖； e-多孔淀粉孔徑分布圖；f-羧甲基淀粉孔徑分布圖；g-羧甲基多孔淀粉孔徑分布圖圖5 馬鈴薯原淀粉、多孔淀粉、羧甲基淀粉及羧甲基多孔淀粉的BET表面積及孔徑分布圖Fig.5 BET surface area plots and pore diameter distribution of NS、PS、CMS and CMPS

a-TGA曲線；b-DTG曲線圖6 多孔淀粉、羧甲基淀粉和羧甲基多孔淀粉的TGA和DTG曲線Fig.6 TGA and DTG curves of PS、CMS and CMPS

2.8 吸附性結(jié)果分析

2.8.1 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線

將配制的1～5 mg/L的槲皮素溶液在360 nm處分別測定其吸光度，結(jié)果如圖7所示。槲皮素溶液的線性方程為y= 0.046 3x+0.316 1，R2= 0.996 5>0.99，由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，槲皮素在1～5 mg/L具有良好的線性關(guān)系。

圖7 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curve of quercetin

2.8.2 負(fù)載率的測定

不同樣品的負(fù)載率如圖8所示，負(fù)載率表達(dá)了壁材將生物活性小分子保持在其中空結(jié)構(gòu)內(nèi)的保留能力。根據(jù)槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程算出CMS@Q的負(fù)載率為(0.57±0.02)%，CMPS@Q的負(fù)載率為(13.71±0.18)%，較CMS@Q提高了95.84%。

圖8 羧甲基淀粉吸附槲皮素和羧甲基多孔淀粉 吸附槲皮素的負(fù)載率Fig.8 Load factor of CMS@Q and CMPS@Q注：*表示差異顯著(P<0.05)

2.8.3 水溶性分析

不同樣品的水溶性如圖9所示，NS經(jīng)過高溫糊化，水溶性略微提升至2.67%，PS由于比表面積提高，親水性基團(tuán)暴露較多，水溶性得到改善，達(dá)到12.67%。CMS的水溶性為46.33%，CMPS的水溶性為67.67%，較CMS提高了46.06%。CMS@Q和CMPS@Q的水溶性分別為23.33%和34.00%，較純槲皮素水溶性均得到了較大的提升，但CMPS@Q的水溶性較CMS@Q提高了45.74%。有研究表明通過提高溶解度可有效提升大多數(shù)低溶解度功能性成分的體內(nèi)生物利用度[27]。本研究結(jié)果顯示，CMPS作為可消化降解的載體，有望在食品和醫(yī)藥相關(guān)領(lǐng)域應(yīng)用。

圖9 馬鈴薯原淀粉、多孔淀粉、羧甲基淀粉、羧甲基 多孔淀粉、羧甲基淀粉吸附槲皮素和羧甲基多孔淀粉 吸附槲皮素的水溶性Fig.9 Water solubility of NS、PS、CMS、CMPS、 CMS@Q and CMPS@Q注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

實驗制備的PS屬于介孔材料，與原淀粉相比，其比表面積增加，暴露了更多反應(yīng)位點，有效提高了與客體分子的接觸，提升了反應(yīng)效率，且隨著反應(yīng)客體濃度的增加，DS也隨之增加，表明多孔處理有利于淀粉改性反應(yīng)的發(fā)生。PS顆粒結(jié)構(gòu)強度較弱，羧甲基化反應(yīng)中受熱溶脹，部分孔洞坍塌，比表面積和孔徑均有所減小，但較原淀粉制備的CMS，比表面積仍然較大。反應(yīng)中主客體分子間形成了醚鍵但并未形成新的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，CMPS與PS一樣呈非晶無序狀態(tài)，冷水可溶性顯著提升，熱穩(wěn)定性有所降低。實驗制備的CMPS具有較小的孔徑、較好的比表面積和冷水溶解性，可作為生物活性物質(zhì)的吸附劑和功能性載體，有望在食品、醫(yī)藥等相關(guān)領(lǐng)域作為可降解性生物載體材料應(yīng)用。