劉文嬌, 蒙利潔, 龔 婷

(1.貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室；2.貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)試驗(yàn)室；3.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

類固醇激素作為哺乳動(dòng)物體內(nèi)最主要的性腺激素，包括雌、雄激素等，對(duì)動(dòng)物性器官的發(fā)育、成熟具有重要的調(diào)控作用，與動(dòng)物的繁殖性能息息相關(guān)[1].3β-羥基甾脫氫酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD)是合成類固醇激素所必需的酶，可以將腎上腺前體類固醇轉(zhuǎn)化為孕酮、睪酮等[2].人類有兩個(gè)3β-HSD家族基因，分別為3β-HSD1基因和3β-HSD2基因，編碼3β-HSD1和3β-HSD2兩種同工酶，而豬的3β-HSD基因只有一種[3].研究表明：3β-HSD在大鼠的腎上腺、卵巢和睪丸均有表達(dá)[4-5].在小鼠飲食中添加高劑量糖精鈉，發(fā)現(xiàn)睪丸中包括3β-HSD在內(nèi)的睪酮合成相關(guān)酶表達(dá)量與對(duì)照組及中、低劑量處理組相比極顯著降低，且高劑量處理組小鼠的精子活力、精子密度有所下降，畸形精子數(shù)量增多[6]；在大鼠退化的附睪中注射睪酮，發(fā)現(xiàn)附睪小管直徑增大、附睪上皮高度增加、上皮細(xì)胞中的主細(xì)胞數(shù)量增加[7].因此，推測3β-HSD作為睪酮合成過程的關(guān)鍵酶不僅在睪丸中發(fā)揮作用，也可能影響附睪的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理作用，從而影響雄性生殖生理活動(dòng).

本課題組前期對(duì)附睪發(fā)育進(jìn)行了研究，將從江香豬的附睪發(fā)育分為4個(gè)時(shí)期，即初情期前(15 d)、初情期(30 d)、初情期后(60 d)、性成熟期(180 d)[8-9].哺乳動(dòng)物精子的發(fā)生過程在睪丸中完成，隨后在附睪運(yùn)行的過程中受到附睪上皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞合成和分泌各種因子的相互作用，經(jīng)過附睪腔特殊的動(dòng)態(tài)微環(huán)境后促使精子成熟[10].睪酮作為睪丸和附睪中最重要的一種雄激素，其合成受到多種酶的調(diào)節(jié)，如類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)、細(xì)胞色素P450側(cè)鏈裂解酶(CYP11A1)、3β-HSD、17β-羥基類固醇脫氫酶(17β-HSD)等的調(diào)節(jié)[11].本課題組前期研究表明，雄激素受體在不同日齡從江香豬的附睪中均有表達(dá)，這提示與雄激素相關(guān)的酶可影響附睪對(duì)精子成熟、運(yùn)輸、儲(chǔ)存等的調(diào)控功能[12].另有研究表明，3β-HSD在胎盤的巨大滋養(yǎng)層細(xì)胞中存在表達(dá)，表明3β-HSD參與孕酮的合成，且孕酮是促進(jìn)雌性第二性征發(fā)育成熟及維持妊娠所必需的[13].膽汁酸在脂肪代謝中起著不可替代的作用，肝臟中3β-HSD的缺乏會(huì)影響膽汁酸代謝，引起血清中維生素水平的下降，最終導(dǎo)致膽道淤積、肝臟腫大[14].3β-HSD在睪丸中的表達(dá)[15]已有文獻(xiàn)證實(shí)，但對(duì)該酶是否存在于附睪中，并直接影響附睪生理功能的研究較為缺乏.

從江香豬是我國一種重要的微型地方豬種，具有體型矮小、性成熟早、基因純合、肉質(zhì)鮮嫩等特點(diǎn)，目前已被列為國家二級(jí)珍稀保護(hù)畜種.然而，該豬種與大白豬等豬種相比繁殖力較低，嚴(yán)重影響了其擴(kuò)繁推廣.對(duì)從江香豬繁殖性能開展相關(guān)機(jī)制的研究，對(duì)提高該豬種公豬的種用價(jià)值有重大意義.因此，本試驗(yàn)選取不同日齡從江香豬公豬作為研究對(duì)象，在蛋白水平上探索3β-HSD在附睪中的表達(dá)模式，旨在為探究3β-HSD對(duì)從江香豬精子生成調(diào)控的潛在分子機(jī)制及提高從江香豬的生產(chǎn)性能提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)嚴(yán)格遵循貴州大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)倫理(批準(zhǔn)號(hào):1801227).所用動(dòng)物為出生15(初情期前，n=3)、30(初情期，n=3)、60(初情期后，n=3)、180 d(性成熟期，n=3)的健康雄性從江香豬共12頭，購于貴陽綠生源畜牧科技發(fā)展有限公司.

1.2 樣品采集

通過手術(shù)法獲取附睪、睪丸組織，其中一側(cè)附睪、睪丸組織在4%多聚甲醛固定液中固定后做連續(xù)切片兩張，每日齡得到12張切片用于免疫組織化學(xué)檢測；剩余一側(cè)附睪、睪丸組織在采集后立即剪碎置于液氮中保存，用于后續(xù)Western blot分析.

1.3 附睪組織石蠟切片制作

1.4 免疫組織化學(xué)檢測

1.5 SDS-PAGE與Western blot分析

SDS-PAGE與Western blot分析參照蒙利潔等[12]的方法進(jìn)行.在剪碎的附睪中加入含1%苯甲基黃酰氟(PMSF)的RIPA裂解液(北京索萊寶生物科技有限公司)提取總蛋白.蛋白濃度測定及蛋白定量分析參照BCA試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)說明書進(jìn)行，隨后定量、變性蛋白質(zhì).SDS-PAGE電泳后切膠，將蛋白轉(zhuǎn)移至用甲醇浸泡2 min的聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，使用恒定電流100 mA轉(zhuǎn)膜2 h.將膜浸入5%脫脂奶粉中于37 ℃搖床封閉3 h，加入一抗[3β-HSD(購自賽默飛世爾科技有限公司，貨號(hào)：sc374244，稀釋比例：1∶1 000)、β-actin(購自江蘇親科生物研究中心有限公司，貨號(hào)：AF7018，稀釋比例：1∶5 000)于4 ℃搖床反應(yīng)過夜.洗膜3次，每次10 min，隨后加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)于37 ℃搖床孵育2 h.洗膜3次，每次10 min，黑暗條件下使用ECL超敏發(fā)光進(jìn)行顯色，使用ChemiDocXRS系統(tǒng)成像、拍照，條帶灰度用Image J軟件分析.

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示.3β-HSD灰度值采用Image J軟件測定，免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果用正置顯微鏡進(jìn)行觀察、拍照.使用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，使用Dunnett法進(jìn)行多重比較.其中，P<0.01表示差異極顯著，用**表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 3β-HSD在不同日齡從江香豬附睪中的表達(dá)定位

不同日齡從江香豬附睪3β-HSD免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果(圖1)顯示，從江香豬附睪在初情期前(15 d)、初情期(30 d)、初情期后(60 d)、性成熟期(180 d)均有3β-HSD的表達(dá).3β-HSD在各日齡段從江香豬附睪平滑肌中均有表達(dá)，其中，15 d的3β-HSD特異性表達(dá)于附睪液及脫落的生精細(xì)胞中，30 d的3β-HSD少量表達(dá)于基細(xì)胞中，60 d的基細(xì)胞和微絨毛被3β-HSD深染，180 d可在精子中觀察到3β-HSD的表達(dá).

A1～A3、B1～B3、C1～C3、D1～D4分別為初情期前、初情期、初情期后、性成熟期的附睪；E1～E3:性成熟期的睪丸(陽性對(duì)照)；F1～F3:性成熟期的附睪(陰性對(duì)照，用PBS代替3β-HSD一抗)(LU：管腔；SM：平滑?。籗：精子；B：基細(xì)胞；St：微絨毛；LC：間質(zhì)細(xì)胞；A1、A2中的三角形表示附睪液；A3中的箭頭表示脫落的生殖細(xì)胞).圖1 從江香豬附睪3β-HSD免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果Fig.1 Immunohistochemistry detection of 3β-HSD in epididymis of Congjiang Xiang pig

2.2 從江香豬附睪3β-HSD的表達(dá)

以β-actin為內(nèi)參蛋白，從江香豬附睪3β-HSD表達(dá)的Western blot檢測結(jié)果(圖2)顯示，3β-HSD表達(dá)于從江香豬初情期前、初情期、初情期后、性成熟期4個(gè)發(fā)育時(shí)期的附睪中，且附睪3β-HSD蛋白的分子質(zhì)量約為43 ku.3β-HSD表達(dá)灰度值在30 d顯著增加，并達(dá)到最大值，表達(dá)豐度表現(xiàn)為：初情期>性成熟期、初情期后、初情期前，此結(jié)果與免疫組織化學(xué)染色結(jié)果一致.

A：3β-HSD抗體的特異性檢驗(yàn)；B：3β-HSD在15、30、60和180 d 附睪組織中的表達(dá)量[**表示差異極顯著(P<0.01)]；C:Western blot檢測結(jié)果.圖2 從江香豬附睪3β-HSD表達(dá)的Western blot檢測結(jié)果Fig.2 The expression of 3β-HSD protein in epididymis detected by Western blotting

3 討論與結(jié)論

從江香豬的附睪形態(tài)與其他哺乳動(dòng)物相似，由假復(fù)層柱狀上皮和周圍的平滑肌組成[16].研究證實(shí)，雄激素和一些管腔因子(如類β-半乳糖苷酶、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、人類附睪蛋白6/G蛋白耦聯(lián)受體64)在附睪的發(fā)育過程中起著必要的作用.如：β-半乳糖苷酶與附睪中的精子成熟機(jī)制有關(guān)[17]；LCN5、LCN6、LCN8是脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的重要成員，其發(fā)揮作用時(shí)可與精子成熟過程中精子膜脂類的轉(zhuǎn)運(yùn)相聯(lián)系[18]；人類附睪蛋白6/G蛋白耦聯(lián)受體64具有調(diào)節(jié)附睪水平的作用[18-19].但目前對(duì)上述因子介導(dǎo)的精子運(yùn)輸、成熟及附睪形態(tài)變化的分子機(jī)制仍知之甚少.本試驗(yàn)結(jié)果顯示，從江香豬附睪中3β-HSD的表達(dá)具有年齡依賴性，且在初情期的表達(dá)量最高.初情期前、初情期后、性成熟期3β-HSD的表達(dá)量相似，均極顯著低于初情期，這可能與附睪自身獨(dú)特的微環(huán)境有關(guān).精子成熟的過程依賴于附睪高度專業(yè)化的管腔內(nèi)微環(huán)境，免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，從江香豬初情期的附睪上皮細(xì)胞類型已分化完成，細(xì)胞形態(tài)多為立方柱狀.初情期后附睪上皮細(xì)胞向基底層移動(dòng)，此時(shí)細(xì)胞多為窄高柱狀[20].暗示從江香豬初情期附睪3β-HSD的高表達(dá)可能參與了附睪精子運(yùn)輸、成熟及附睪發(fā)育的調(diào)控.因此，附睪中的3β-HSD可能會(huì)影響精子的運(yùn)輸、成熟及雄性性器官的發(fā)育，從而形成有助于精子成熟和儲(chǔ)存的環(huán)境.

附睪與睪丸的連接通過睪丸輸出小管介導(dǎo)，成熟哺乳動(dòng)物中每秒有1 000～1 500個(gè)精子進(jìn)入附睪，在長達(dá)1、2、6 m(分別為小鼠、大鼠、人)的附睪小管中運(yùn)行，最終到達(dá)附睪尾部儲(chǔ)存[21].Mewe et al[22]研究發(fā)現(xiàn)，在去除附睪平滑肌后，附睪的收縮完全停止，表明精子在附睪中的運(yùn)行離不開附睪平滑肌、管腔液體、微絨毛的相互作用.本試驗(yàn)結(jié)果顯示，3β-HSD主要表達(dá)在從江香豬附睪的平滑肌中，并且在各發(fā)育時(shí)期均有表達(dá).3β-HSD在初情期前表達(dá)于附睪上皮的主細(xì)胞中.主細(xì)胞占附睪上皮細(xì)胞的80%，負(fù)責(zé)分泌大部分附睪管腔內(nèi)的蛋白因子.因此推測附睪主細(xì)胞可能通過分泌3β-HSD對(duì)附睪微環(huán)境或精子成熟產(chǎn)生影響.研究表明，雄激素對(duì)附睪的結(jié)構(gòu)和功能具有重要的調(diào)控作用[23-24].雌、雄激素受體在附睪平滑肌中均有表達(dá)，表明雌、雄激素對(duì)精子的運(yùn)輸和成熟具有調(diào)控作用.本課題組前期證實(shí)了3β-HSD在從江香豬附睪平滑肌中存在表達(dá)，表明附睪平滑肌可能是雄激素合成關(guān)鍵酶的靶器官[25].初情期的附睪上皮細(xì)胞已經(jīng)發(fā)育完全，此時(shí)的3β-HSD在附睪上皮周圍的平滑肌和少數(shù)基細(xì)胞中呈陽性表達(dá).初情期時(shí)，從江香豬初次產(chǎn)生具備受精能力的精子，此時(shí)的3β-HSD在附睪中高表達(dá)，可能與精子的成熟、運(yùn)輸機(jī)制有關(guān)；初情期后的3β-HSD定位于附睪平滑肌、微絨毛和基細(xì)胞中.初情期后開始產(chǎn)生大量精子，微絨毛可以吸收管腔物質(zhì)及分泌更多的蛋白質(zhì)，這種結(jié)構(gòu)有利于精子儲(chǔ)存，此時(shí)附睪平滑肌和微絨毛中3β-HSD的陽性表達(dá)對(duì)于精子的運(yùn)輸、成熟和儲(chǔ)存是必要的[26-27].基細(xì)胞具有改變形狀以調(diào)整管腔容積和壓力的能力，其在保護(hù)管腔結(jié)構(gòu)完整性的方面起到了重要作用，從而對(duì)精子的儲(chǔ)存和運(yùn)輸產(chǎn)生影響[28].此外，性成熟期的3β-HSD主要在附睪平滑肌中呈陽性表達(dá)，在精子中也有表達(dá).附睪管中的因子和精子會(huì)影響平滑肌的收縮.Mewe et al[22]在去除牛附睪管中的精子后，平滑肌收縮加快，這或許可以解釋本試驗(yàn)初情期后從江香豬附睪中3β-HSD表達(dá)量的下降.總體上，附睪各種特征都與其特定的功能有關(guān)[29-30].3β-HSD在附睪平滑肌中的表達(dá)可能對(duì)精子在附睪內(nèi)的運(yùn)輸進(jìn)行調(diào)節(jié)，在微絨毛中的表達(dá)對(duì)精子運(yùn)輸、成熟也起調(diào)節(jié)作用，在基細(xì)胞中的表達(dá)可能通過改變附睪容積從而影響精子儲(chǔ)存.

3β-HSD參與精子的發(fā)生及成熟、獲能、儲(chǔ)存和受精等一系列過程[31-32].本試驗(yàn)結(jié)果顯示，附睪中3β-HSD的表達(dá)在初情期達(dá)到峰值.附睪中的3β-HSD可能與從江香豬初情期初次釋放精子、附睪迅速發(fā)育、附睪功能基本完善等方面有關(guān).進(jìn)入附睪后，精子的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)一步完善，需要多種因素相互作用，初情期時(shí)附睪上皮細(xì)胞中3β-HSD的表達(dá)量最高，提示附睪中的3β-HSD對(duì)精子運(yùn)輸、成熟及儲(chǔ)存發(fā)揮重要作用.