李佳育, 劉詩(shī)洋, 李國(guó)建, 鄒金平, 魏 萱,3

(1.福建農(nóng)林大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院；2.福建省農(nóng)業(yè)信息感知技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

食用菌菌渣是當(dāng)前全球環(huán)境污染的重要來(lái)源之一，各國(guó)對(duì)菌渣無(wú)害化處理和產(chǎn)業(yè)化循環(huán)利用方面的研究都十分重視[1].近年來(lái)，中國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化水平日益提升，成為世界食用菌產(chǎn)出大國(guó)[2].規(guī)模較大的食用菌工廠每日可產(chǎn)生上百噸食用菌菌渣[3]，而其中大部分以直接焚燒方法處理，不但導(dǎo)致資源的極大耗費(fèi)，而且還會(huì)污染農(nóng)業(yè)環(huán)境，加劇溫室效應(yīng).因此，需要對(duì)食用菌的菌渣進(jìn)行資源化利用處理.將食用菌菌渣轉(zhuǎn)變?yōu)榭稍偕茉?，為工廠生產(chǎn)提供新能量，是延長(zhǎng)食用菌產(chǎn)業(yè)鏈、增加食用菌生產(chǎn)產(chǎn)值、實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)資源多級(jí)化循環(huán)利用的有效途徑[4]，對(duì)農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)和農(nóng)村生態(tài)文明建設(shè)都有著重要意義.

厭氧發(fā)酵是指在完全缺乏溶解氧的條件下，利用兼性厭氧菌和專性厭氧菌，把有機(jī)物轉(zhuǎn)變?yōu)榧淄楹投趸嫉瓤墒褂觅Y源，是促進(jìn)食用菌菌渣源頭減量化、資源利用化和安全無(wú)害化的一種高效的處理技術(shù)[5].林滿紅等[6]對(duì)6種農(nóng)業(yè)剩余物高溫厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣進(jìn)行研究，結(jié)果表明以杏鮑菇菌渣作為底料的產(chǎn)氣效果最佳，茶樹(shù)菇菌渣產(chǎn)氣效果最差，不適合高溫發(fā)酵制沼氣；楊茜等[7]分析食用菌的菌渣與麥秸共發(fā)酵作用產(chǎn)氣潛能，結(jié)果表明菌渣也可以作為底料進(jìn)行厭氧發(fā)酵生產(chǎn)沼氣，且不同的發(fā)酵作用溫度對(duì)日產(chǎn)氣量峰值有不同程度的影響；秦文弟等[8]測(cè)定了榆黃蘑菌渣的產(chǎn)沼氣潛力，結(jié)果表明菌渣為厭氧發(fā)酵產(chǎn)生沼氣的原材料，且溫度為影響菌渣產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣率的關(guān)鍵因素.

厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣潛能與發(fā)酵底料中有機(jī)物的種類與含量有關(guān)，不同含量營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)代謝有重要影響[9].本研究通過(guò)分析銀耳和雙孢蘑菇兩種食用菌菌渣的主要營(yíng)養(yǎng)成分含量，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)不同發(fā)酵溫度、不同接種物含量下厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣過(guò)程中的日產(chǎn)氣量、pH值以及甲烷含量等重要參數(shù)的變化規(guī)律進(jìn)行分析，進(jìn)一步探索這兩種食用菌菌渣厭氧發(fā)酵的最佳條件，為厭氧發(fā)酵反應(yīng)器的仿真模擬設(shè)計(jì)提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料：福建祥云銀耳生產(chǎn)有限公司提供的雜木屑和麥麩的銀耳菌渣；福建農(nóng)科院食用菌研究中心提供的含有麥秸和雞糞的雙孢蘑菇菌渣.將原料中大木屑、秸稈等顆粒物去除后裝在密封袋中，儲(chǔ)存于-20 ℃冰柜中.試驗(yàn)開(kāi)始前，將冰凍的原料置于4 ℃冰箱中緩凍.

接種物沼液的有效菌種類型為產(chǎn)甲烷桿菌(Methanogenus)，其中有效活菌數(shù)≥2.0×108個(gè)·mL-1.沼液保存于避光黑瓶中，儲(chǔ)存在陰涼、干燥、通風(fēng)的環(huán)境中備用.

1.2 試驗(yàn)裝置

采用發(fā)酵容量為2 L的厭氧發(fā)酵瓶，有效料液容積為1.5 L.利用硅膠管與鋁箔集氣袋連接，形成厭氧發(fā)酵試驗(yàn)裝置.試驗(yàn)儀器設(shè)備包括恒溫定時(shí)水浴鍋(BHS-4，寧波群安實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品，恒溫分辨率0.1 ℃)、電子天平(JJ124BF，常熟雙杰測(cè)試儀器廠產(chǎn)品)和氣相色譜儀(7890B，美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品)等.試驗(yàn)裝置結(jié)構(gòu)如圖1所示.

1.恒溫定時(shí)水浴加熱裝置;2.厭氧發(fā)酵瓶;3.開(kāi)關(guān)a;4.開(kāi)關(guān)b;5.鋁箔集氣袋.圖1 試驗(yàn)裝置結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure diagram of test device

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料處理 將碾碎后的食用菌菌渣稱重后以每份300 g依次裝入3個(gè)發(fā)酵瓶?jī)?nèi)，再接種沼液250、500、750 mL，最后加水補(bǔ)足，保證發(fā)酵作用體系總?cè)莘e為1 L.然后置于30、40、50 ℃的恒溫水浴鍋中進(jìn)行厭氧發(fā)酵反應(yīng)，總發(fā)酵時(shí)間為14 d.

1.3.2 主要營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定 淀粉含量的測(cè)定：首先利用80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇將試樣中的可溶性葡萄糖和淀粉分離，然后采用酸水解法將淀粉分解為葡萄糖，再采用蒽酮比色法測(cè)得葡萄糖含量，計(jì)算淀粉含量[10].

粗脂肪含量的測(cè)定：采用乙醚抽提殘余法[11].

粗蛋白含量的測(cè)定：采用凱氏定氮法，粗蛋白含量=總氮含量×6.25[12].

木質(zhì)素含量的測(cè)定：采用可見(jiàn)分光光度法，在木質(zhì)素中的酚羥基發(fā)生乙酰化后于280 nm處有特征吸收峰，而280 nm 的光密度與木質(zhì)素含量成正相關(guān)[13].

纖維素含量的測(cè)定：采用可見(jiàn)分光光度法.纖維素是由β-葡萄糖殘基所組成的多糖，在酸性條件下受熱后分解成β-葡萄糖.β-葡萄糖在強(qiáng)酸作用下脫水生成β-糠醛類化合物.β-糠醛類化合物與蒽酮脫水縮合，最后形成糠醛衍生物，其顏色的深淺可間接反映纖維素含量[14].

1.3.3 厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣的測(cè)定 每日用針筒在固定時(shí)間內(nèi)取出1 mL發(fā)酵液，測(cè)定發(fā)酵體系中的pH值，最后取平均值.重復(fù)3次.同時(shí)，收集鋁箔集氣袋中的氣體進(jìn)行測(cè)定，采用描述統(tǒng)計(jì)方法中的均值法得到菌渣的日產(chǎn)氣量.再將日產(chǎn)氣量計(jì)算轉(zhuǎn)化為單位原料的日產(chǎn)氣量，比較兩種菌渣發(fā)酵效果，重復(fù)測(cè)定3次，求得平均值后作圖.

1.3.4 甲烷含量的測(cè)定 采用正交試驗(yàn)方法[15]對(duì)氣相色譜儀收集到的氣體測(cè)定甲烷含量.不同發(fā)酵溫度的產(chǎn)氣特性不相同[16]，故將試驗(yàn)組發(fā)酵溫度設(shè)為30～50 ℃.不同接種物含量對(duì)反應(yīng)啟動(dòng)速率影響顯著，且其產(chǎn)氣特性與物料含量互相制約[17]，所以將試驗(yàn)組接種物含量設(shè)為25%～75%.正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平和編碼見(jiàn)表1，食用菌菌渣種類僅有二水平.正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案如表2所示.

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平和編碼Table 1 Factor level and coding of orthogonal experiment design

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Table 2 Orthogonal design scheme

2 結(jié)果與分析

2.1 主要營(yíng)養(yǎng)成分含量

對(duì)銀耳菌渣和雙孢蘑菇菌渣的主要營(yíng)養(yǎng)成分含量進(jìn)行測(cè)定，從表3可知，二者的粗脂肪、淀粉、木質(zhì)素含量無(wú)顯著差異，纖維素含量有顯著差異，而粗蛋白含量有極顯著差異.雙孢蘑菇菌渣的粗蛋白含量和淀粉含量都高于銀耳菌渣，但粗脂肪、木質(zhì)素和纖維素的含量低于銀耳菌渣.表明兩種食用菌菌渣的主要營(yíng)養(yǎng)成分含量都較高，可將它們作為厭氧發(fā)酵原料.

表3 銀耳菌渣和雙孢蘑菇菌渣的主要營(yíng)養(yǎng)成分含量1)Table 3 Main nutrient contents of T. fuciformis residue and A. bisporus residue %

2.2 銀耳菌渣和雙孢蘑菇菌渣的沼氣發(fā)酵效果

2.2.1 日產(chǎn)氣量 由圖2可知，在不同厭氧發(fā)酵條件下，兩種菌渣試驗(yàn)組的產(chǎn)氣反應(yīng)均能正常發(fā)生，但兩者的日產(chǎn)氣量差別較大.發(fā)酵溫度相同時(shí)，接種物含量會(huì)影響菌渣的日產(chǎn)氣量；接種物含量相同時(shí)，發(fā)酵溫度對(duì)日產(chǎn)氣量的峰值有一定影響.而雙孢蘑菇菌渣無(wú)論在何種發(fā)酵條件下，其日產(chǎn)氣量總高于銀耳菌渣，這與不同種類菌渣主要營(yíng)養(yǎng)成分含量有關(guān).

圖2a為發(fā)酵溫度設(shè)置成30 ℃時(shí)的日產(chǎn)氣量變化折線.從圖2a可以發(fā)現(xiàn)，25%、50%、75%接種物含量的銀耳菌渣日產(chǎn)氣量分別在第5天、第3天、第3天出現(xiàn)峰值，峰值分別為4.0、5.0、5.6 mL·g-1.25%、50%、75%接種物含量的雙孢蘑菇菌渣日產(chǎn)氣量分別在第6天、第5天、第3天出現(xiàn)峰值，峰值分別為23.0、25.0、27.0 mL·g-1.同時(shí)，圖中75%接種物含量的兩種菌渣試驗(yàn)組反應(yīng)啟動(dòng)速度都較快，在高峰期后仍保持較高日產(chǎn)氣量；而25 %接種物含量的試驗(yàn)組相對(duì)滯后.因此同種類菌渣在發(fā)酵溫度相同時(shí)，隨著接種物含量的提高，反應(yīng)啟動(dòng)速度加快且日產(chǎn)氣量提高.從圖2可知，接種物含量為75 %的銀耳菌渣，在發(fā)酵溫度為30、40和50 ℃時(shí)，其日產(chǎn)氣量峰值分別在第3天、第3天、第2天出現(xiàn)，峰值分別為5.6、7.5、8.8 mL·g-1.相同發(fā)酵條件的雙孢蘑菇菌渣試驗(yàn)組，其日產(chǎn)氣量峰值分別出現(xiàn)在第3天、第3天、第2天，峰值分別為27.0、32.0、52.0 mL·g-1.由此可知，發(fā)酵溫度升高不僅能提高產(chǎn)氣反應(yīng)速率，還能夠在一定程度上增加日產(chǎn)氣量.

a.發(fā)酵溫度為30 ℃；b.發(fā)酵溫度為40 ℃；c.發(fā)酵溫度為50 ℃；Y1.25%接種物的銀耳菌渣；Y2.50%接種物的銀耳菌渣；Y3.75%接種物的銀耳菌渣；S1：25%接種物的雙孢蘑菇菌渣；S2.50%接種物的雙孢蘑菇菌渣；S3.75%接種物的雙孢蘑菇菌渣.圖2 兩種食用菌菌渣在不同發(fā)酵條件下的日產(chǎn)氣量變化Fig.2 Variation of daily gas production of 2 kinds of edible fungi residues under different fermentation conditions

2.2.2 pH值的變化 銀耳菌渣和雙孢蘑菇菌渣在50 ℃發(fā)酵溫度下不同接種物含量發(fā)酵液的pH值隨時(shí)間的變化趨勢(shì)如圖3所示.由圖3可知，兩種菌渣發(fā)酵液的pH值在0～5 d有明顯差別，在6～14 d的變化趨勢(shì)基本相同.但與雙孢蘑菇菌渣試驗(yàn)組相比銀耳菌渣試驗(yàn)組的起始pH值都較小(7.1～7.3).25%、50%和75%接種物含量發(fā)酵液的pH值分別在第4天、第3天、第2天達(dá)到最小值(分別為6.5、6.6和6.7)，隨后都逐漸緩慢回升；分別在第8天、第7天和第6天后基本維持穩(wěn)定.雙孢蘑菇菌渣的發(fā)酵液起始pH值為7.4～7.6，且反應(yīng)過(guò)程中下降速度快；25%、50%和75%接種物含量的pH值分別在第3天、第2天、第2天達(dá)到最小值(分別為6.7、6.9和7.1)；并分別在第6天、第5天、第4天開(kāi)始維持穩(wěn)定.表明兩種菌渣發(fā)酵液的pH值都隨著接種物含量的升高而小幅增加.當(dāng)接種物含量過(guò)低時(shí)，體系內(nèi)甲烷菌數(shù)量不足，從而影響體系內(nèi)的反應(yīng)速度.而兩種菌渣反應(yīng)體系內(nèi)pH值為6.5～7.7，產(chǎn)甲烷菌在體系中都可正常生長(zhǎng).

Y1.25%接種物的銀耳菌渣；Y2.50%接種物的銀耳菌渣；Y3.75%接種物的銀耳菌渣；S1.25%接種物的雙孢蘑菇菌渣；S2.50%接種物的雙孢蘑菇菌渣；S3.75%接種物的雙孢蘑菇菌渣.圖3 兩種菌渣在50 ℃發(fā)酵溫度下發(fā)酵液pH值變化情況Fig.3 Variation of pH value of fermentation broths of 2 kinds of fungi residues fermented under 50 ℃

2.2.3 甲烷含量 甲烷含量數(shù)值的極差分析如表4所示.對(duì)于A-1、A0、A1來(lái)說(shuō)，3個(gè)試驗(yàn)組的試驗(yàn)條件都是完全相同的，可直接對(duì)比.而kA-1、kA0的數(shù)值都不相等，說(shuō)明因素A(食用菌菌渣種類)的水平改變對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有影響.同理可得因素B(發(fā)酵溫度)、因素C(接種物含量)的水平改變也對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有一定影響.因kA0>kA-1，所以因素A的優(yōu)水平為A0(雙孢蘑菇菌渣)；同理可得，因素B的優(yōu)水平為B1(50 ℃)，因素C的優(yōu)水平為C0(50%).因RA>RC>RB，故食用菌菌渣種類對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響最大，其次是接種物含量，最后是發(fā)酵溫度.結(jié)果表明該試驗(yàn)最優(yōu)組合為A0B1C0，即雙孢蘑菇菌渣在發(fā)酵溫度為50 ℃且接種物含量為50%時(shí)，其甲烷含量最高，產(chǎn)氣質(zhì)量最優(yōu).

表4 正交試驗(yàn)極差分析 Table 4 Range analysis of orthogonal test

3 討論

食用菌菌渣作為一種高木質(zhì)纖維素的發(fā)酵原料，其木質(zhì)纖維素較難溶解，故產(chǎn)氣性能要依據(jù)淀粉、脂肪以及蛋白質(zhì)的含量而定[18].本研究通過(guò)對(duì)比兩種食用菌菌渣的主要營(yíng)養(yǎng)成分含量，結(jié)果表明二者的木質(zhì)素及纖維素含量均高于粗脂肪、粗蛋白和淀粉含量.這是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的主要營(yíng)養(yǎng)成分在食用菌生長(zhǎng)過(guò)程中被吸收利用，菌渣中的木質(zhì)素及纖維素含量會(huì)明顯升高.林滿紅等的研究[6]結(jié)果中銀耳菌渣的粗蛋白和粗脂肪含量均高于本研究，這是因?yàn)楸狙芯恐信囵B(yǎng)基原料為雜木屑和麥麩，而銀耳作為木腐類食用菌，其菌絲幾乎沒(méi)有分解纖維素的能力，在子實(shí)體生長(zhǎng)過(guò)程中必須依賴另一種真菌的協(xié)助，且不同生長(zhǎng)過(guò)程和出菇狀況對(duì)菌渣主要營(yíng)養(yǎng)成分含量也有影響.

表5 正交試驗(yàn)方差分析1) Table 5 Variance analysis of orthogonal test

在厭氧發(fā)酵過(guò)程中，原料的主要營(yíng)養(yǎng)成分含量和產(chǎn)氣潛能之間具有必然的關(guān)聯(lián)[19].原料中脂類的產(chǎn)氣量最多，其甲烷含量也高；蛋白質(zhì)的產(chǎn)氣量雖少，但其甲烷含量高；碳水化合物的產(chǎn)氣量少且甲烷含量較低[20-21].通過(guò)將兩種菌渣試驗(yàn)組在不同發(fā)酵溫度和接種物含量條件下進(jìn)行產(chǎn)氣測(cè)定試驗(yàn)，結(jié)果表明雙孢蘑菇菌渣的日產(chǎn)氣量、甲烷含量均高于銀耳菌渣.這與二者的主要營(yíng)養(yǎng)成分含量不同有關(guān)，雙孢蘑菇菌渣的木質(zhì)素、纖維素含量低，在反應(yīng)過(guò)程中更有利于微生物的分解.因此以食用菌菌渣作為厭氧發(fā)酵原料時(shí)，其淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪含量越高，木質(zhì)纖維素含量越低，產(chǎn)氣潛能及質(zhì)量也越好.

pH值是影響農(nóng)業(yè)剩余物厭氧發(fā)酵產(chǎn)生沼氣的關(guān)鍵因素之一[22]，產(chǎn)甲烷菌最適合的pH值為6.5～7.8[23].pH值可以反映產(chǎn)甲烷菌是否在反應(yīng)系統(tǒng)中正常生長(zhǎng)繁殖.本研究對(duì)菌渣發(fā)酵液pH值進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明銀耳菌渣的初始pH值較雙孢蘑菇菌渣小，不利于產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)和代謝，導(dǎo)致反應(yīng)體系內(nèi)產(chǎn)生酸化現(xiàn)象；25%接種物的銀耳菌渣因?yàn)楫a(chǎn)甲烷菌的菌量不足，產(chǎn)酸與產(chǎn)甲烷的速率降低，體系內(nèi)揮發(fā)酸大量積累，使pH值迅速降低，厭氧發(fā)酵反應(yīng)終止，其產(chǎn)氣量小且質(zhì)量差.

厭氧發(fā)酵體系中發(fā)酵溫度和接種物含量與反應(yīng)速度、菌體生長(zhǎng)速度以及物質(zhì)合成速度等有密切聯(lián)系，在一定溫度范圍內(nèi)，溫度越高，產(chǎn)氣速度也越快；10%～30%的接種物含量最適宜發(fā)酵[24-25].本研究結(jié)果表明食用菌菌渣種類對(duì)甲烷含量的影響最大，其次是接種物含量，對(duì)發(fā)酵溫度的影響最??；兩種菌渣的日產(chǎn)氣量都隨著發(fā)酵溫度的升高而增大，且產(chǎn)氣速度明顯提高；兩種菌渣在25%接種物含量時(shí)，都因?yàn)榻臃N物含量不足，反應(yīng)啟動(dòng)過(guò)慢，且產(chǎn)氣速度低下；而75%接種物含量時(shí)，過(guò)高的接種物含量使得反應(yīng)體系中主要營(yíng)養(yǎng)成分含量低，雖然產(chǎn)氣量大但質(zhì)量低，與50%接種物含量試驗(yàn)組相比其甲烷含量并未明顯升高.

4 小結(jié)

對(duì)比兩種食用菌菌渣厭氧發(fā)酵的產(chǎn)氣效果，結(jié)果表明：雙孢蘑菇菌渣的產(chǎn)氣效果顯著好于銀耳菌渣；厭氧發(fā)酵原料的淀粉、粗脂肪、粗蛋白含量越高，木質(zhì)素和纖維素含量越低，產(chǎn)氣效果越好.而且，發(fā)酵體系中隨著發(fā)酵溫度的升高，菌渣的日產(chǎn)氣量有明顯增加；隨著接種物含量的增加，其日產(chǎn)氣量也有小幅度增加.但根據(jù)兩種菌渣產(chǎn)氣甲烷含量的測(cè)定試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)日產(chǎn)氣量多并不意味著其甲烷含量高，這與其體系內(nèi)的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量有關(guān).當(dāng)雙孢蘑菇菌渣在發(fā)酵溫度為50 ℃、接種物含量為50%時(shí)，其產(chǎn)氣效果最好，總產(chǎn)氣量較多且質(zhì)量高；而銀耳菌渣的產(chǎn)氣效果不佳，不適合作為厭氧發(fā)酵底料來(lái)制備沼氣.