湯俏璐 段莉琴 嚴民力*

缺血性腦卒中具有高致殘率、高病死率，其有效治療仍然是目前臨床上的難點[1］。缺血性腦卒中發(fā)生血液再灌注可導致腦缺血再灌注損傷[2］，其形成的過程涉及到氧化應激反應、炎癥反應等[3］。在病理或正常環(huán)境下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中小膠質(zhì)細胞可以被激活并釋放抗炎因子、神經(jīng)調(diào)節(jié)因子，清除有害物質(zhì)，并指引干細胞向炎癥灶遷移，促進神經(jīng)元的再生和存活[4-6］。同時也可以釋放出多種炎癥因子，引起炎癥反應，損害腦組織[7］。有研究表明益氣活血通脈顆?？捎行Ц纳颇X缺血再灌注模型大鼠顳葉神經(jīng)元損傷[8］。本文探討益氣活血通脈顆粒通過調(diào)控小膠質(zhì)細胞介導腦缺血再灌注損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞 SPF級雄性SD大鼠，24只，6～8周齡，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司所提供，許可證號：SCXK（滬）2017-0015，動物合格證號：20170005024850，大鼠的飼養(yǎng)來源主要為杭州鷹旸生物科技有限公司。BV2小膠質(zhì)細胞[iCell-m011，賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司）］。

1.2 藥物與試劑 DMEN培養(yǎng)基（批號：SH30243.01，Hyclone）；96孔 培 養(yǎng) 板（批 號：167008，Thermo）；0.22μm濾膜（批號：R7EA15981，MILLEX-GP）；小鼠活性氧簇（ROS）ELISA檢測試劑盒（批號：JL20383，上海江萊生物科技有限公司）；小鼠白細胞介素1β ELISA試劑盒（批號：MM-0040M1，江蘇酶免實業(yè)有限公司）；小鼠白細胞介素18 ELISA試劑盒（批號：MM-0169M1，江蘇酶免實業(yè)有限公司）。

1.3 實驗器材 酶標儀（型號：CMaxPlus，MD）；低溫高速離心機（型號：Micro17R，Thermo）；細胞培養(yǎng)箱（型號：BB150，Termo）。

1.4 實驗方法 （1）細胞培養(yǎng)：培養(yǎng)實驗用BV2小膠質(zhì)細胞，使用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基進行相關(guān)的培養(yǎng)工作，所使用培養(yǎng)箱的溫度設置為37℃，二氧化碳含量為5%，每隔2～3 d進行傳代。（2）益氣活血通脈顆粒和含藥血清配方：甘草5 g，紅景天6 g，大棗6枚，生姜6 g，水蛭6 g，當歸10 g，赤芍10 g，桂枝10 g，益母草10 g，黃芪30 g，做成中藥顆粒劑，5 g/袋，每袋相當于12 g生藥。按體重將SD大鼠隨機分為空白對照組和中藥組，分別以0.9%氯化鈉溶液和中藥（8 g/kg）灌胃。每天8∶00及16∶00各灌胃1次，連續(xù)7d，最后一次灌胃后1 h，于腹主動脈中取出血液，進行離心分離血清，過濾后，-20℃冷凍待用。（3）BV2小膠質(zhì)細胞氧糖剝奪/復氧模型的建立：此次實驗所用細胞的生長周期為對數(shù)生長期，將原培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基棄去，用無添加糖的DMEM培養(yǎng)基代替，置于氧糖剝奪罐中孵育6 h，其間不斷補進5% CO2及95% N2混合氣體，將流量維持在2 L/min；隨后將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移出來，原培養(yǎng)液按實驗守則丟棄，另外添進新的DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱溫度設置為37℃，CO2含量為5%，繼續(xù)培養(yǎng)以達到復氧復糖的目的。（4）分組及干預：細胞分成4組，空白組、OGDR模型組、空白血清組、含藥血清組。除空白組外，其余三組均置于氧糖剝奪罐進行氧糖剝奪/復氧實驗。（5）BV2小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)后，800 r/min離心10 min，收集上清液，使用0.22μm微孔濾膜隔離濾液，過濾后所得的溶液置于冰箱-40℃進行儲存，檢測細胞上清中ROS、IL-18、IL-1β水平；①前期準備：將在冰箱里保存的試劑盒拿出，室內(nèi)復溫20 min。配液：將20×洗滌液通過蒸餾水稀釋成原倍數(shù)的洗滌液；②加標準品和待測樣本：在框架上置放好所需酶標板，孔數(shù)分為3組，標準品組、待測樣本組及空白對照組，首先在標準品組添加50 μL標準品；待測樣本組添加10 μL待測樣本，繼續(xù)在待測樣本組添加40 μL樣本稀釋液；空白對照組無添加；③分別添加100μL的辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體進入標準品組和待測樣本組。④溫育：將反應孔封住，封膜用刮刀刮緊，以防漏液，置于水溫為37℃的水浴鍋中，或溫度為37℃的恒溫箱中溫育60 min；⑤洗板：棄液后用吸水紙拍干板子，然后在孔里注滿洗滌液，置于室內(nèi)1 min，棄液后用吸水紙拍干，按步驟重復5次；⑥顯色：將50 μL顯色劑A溶液添加到每個孔中，然后添加50 μL顯色劑B溶液，可以應用平板混勻器使其得到充分混勻，時間30 s（也可以手動進行震蕩混勻，力度不能太大，時間30 s），避光置放于37 ℃的環(huán)境中顯色15 min；⑦終止：酶標板的每個孔均添加50 μL終止液，使反應不再繼續(xù)；⑧測定：用空白孔進行反應調(diào)零，反應停止后15 min內(nèi)，通過450 nm波長分析每個孔的吸光值（OD值），實驗重復6次；⑨ELISA檢測：取各組細胞上清液，應用ELISA試劑盒檢測各組細胞中ROS、IL-1β、IL-18水平。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布計量資料以（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用SNK檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小膠質(zhì)細胞中ROS水平比較 與空白組比較，OGDR模型組與空白血清組小膠質(zhì)細胞中ROS水平升高（P＜0.01），與空白血清組比較，含藥血清組小膠質(zhì)細胞中ROS水平降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小膠質(zhì)細胞中ROS水平比較[ng/L，（±s）］

表1 各組小膠質(zhì)細胞中ROS水平比較[ng/L，（±s）］

注：與空白組比較，*P＜0.01；與空白血清組比較，#P＜0.05

組別 ROS空白組 374.11±33.73 OGDR模型組 458.8±27.50*空白血清組 471.26±33.18*含藥血清組 413.42±26.32#

2.2 各組小膠質(zhì)細胞中IL-1β和IL-18水平比較 與空白組比較，OGDR模型組與空白血清組小膠質(zhì)細胞中IL-1β和IL-18水平升高（P＜0.01），與空白血清組比較，含藥血清組小膠質(zhì)細胞中IL-1β和IL-18水平降低（P＜0.01）。見表2。

表2 小膠質(zhì)細胞中IL-1β和IL-18含量水平變化情況[pg/mL，（±s）］

表2 小膠質(zhì)細胞中IL-1β和IL-18含量水平變化情況[pg/mL，（±s）］

注：與空白組比較，*P＜0.01；與空白血清組比較，#P＜0.01

組別 IL-1β IL-18空白組 42.45±4.39 18.88±2.34 OGDR模型組 105.98±12.22* 65.86±6.19*空白血清組 101.8±17.43* 66.73±9.16*含藥血清組 67.01±4.79* 38.66±4.69#

3 討論

缺血性腦卒中再灌注損傷病因與分子機制，包含氧化應激、炎癥、能量代謝損傷、谷氨酸鹽/神經(jīng)毒性物質(zhì)的釋放、鈣超載、凋亡及自噬過程[3］。中醫(yī)學將缺血性腦卒中歸類為中風，風滯、痰、火氣、癖、毒是形成缺血性腦卒中的病因。治療方法有活血益氣、祛除癖血、暢通血脈、提神醒腦、止咳化痰、通便、補腎補益氣等，臨床上應用中成藥、針灸與健康治療等方法，能明顯改善腦卒中患者的后遺癥與腦神經(jīng)的恢復[9-10］?！夺t(yī)林改錯》記錄的補陽還五湯劑是現(xiàn)代益氣活血通脈顆粒的由來，其功效是通氣、活血化癖、通脈絡、提神醒腦，在臨床應用中獲得較好的治療效果。

研究表明，缺血性腦卒中發(fā)病過程中，一旦出現(xiàn)炎癥反應，可引起腦神經(jīng)衰亡、血腦屏障受損并且加重腦水腫等情況[11］，因此，為了防止炎癥造成二次腦組織傷害，治療炎性損傷已成為缺血性腦卒中預后的研究方向。小膠質(zhì)細胞在炎癥治療過程中有重要作用，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)吞噬細胞的小膠質(zhì)細胞，其大致分為兩種狀態(tài)M1型與M2型，兩種極化狀態(tài)有促炎與抗炎兩種作用[4］。M1型狀態(tài)為細胞免疫應答，會產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)和細胞毒性物質(zhì)（ROS、TNF-α、IL-1、iNOS等），進而造成細胞組織損傷；M2型細胞加速細胞繁殖，產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子和抗炎癥因子（BDNF、IL-10、IL-4、TGF-β等），能夠修復受損組織細胞[12］。缺血缺氧可使小膠質(zhì)細胞高表達基質(zhì)金屬蛋白酶-9，繼而活化、水解基膜蛋白，破壞血腦屏障、加劇中性粒細胞浸潤、誘導小膠質(zhì)極化引發(fā)神經(jīng)炎性反應和神經(jīng)元損傷，使梗死面積不斷擴大[13］。

本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，OGDR模型組與空白血清組小膠質(zhì)細胞中ROS水平升高（P＜0.01），與空白血清組比較，含藥血清組小膠質(zhì)細胞中ROS水平降低（P＜0.05）。表明益氣活血通脈顆?？梢詼p弱缺氧復氧導致的小膠質(zhì)細胞氧化應激反應，保護腦組織。Nod樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）炎癥小體大多數(shù)在小膠質(zhì)細胞里，如感受到內(nèi)源的危險刺激信號，NLRP3炎癥小體會有所反應，從而產(chǎn)生促炎細胞分子，如IL-1β和IL-18，從而加重腦缺血后的炎癥反應[14-15］。本研究結(jié)果顯示，益氣活血通脈顆粒可以降低小膠質(zhì)細胞IL-1β、IL-18水平。表明，益氣活血通脈顆?？梢詼p弱缺氧復氧導致的小膠質(zhì)細胞炎癥反應和炎性損傷。

綜上所述，益氣活血通脈顆?？赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞NLRP3炎癥小體，從而降低ROS及IL-1β、IL-18的分泌，進一步減弱缺氧復氧導致的小膠質(zhì)細胞氧化應激反應及抵抗缺氧復氧導致的小膠質(zhì)細胞炎性反應，改善缺血性腦卒中患者的預后。