莫亞峰 周坤 王徐剛 熊振飛 湯樣華*

骨質(zhì)疏松性骨折（osteoporotic fractures，OF）是骨質(zhì)疏松最嚴重的并發(fā)癥，流行病學結(jié)果顯示，我國OF患者已達223萬例，預計2050年將達到599萬例[1-2］。人口老齡化導致骨質(zhì)疏松癥的患病率不斷上升，并發(fā)骨質(zhì)疏松性骨折的幾率也相應增高。而現(xiàn)代醫(yī)學研究已證實骨形成蛋白-7（bone morphogenetic protein-7，BMP-7）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）在骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow stem cells，BMSCs）成骨分化過程中起關(guān)鍵作用[3-4］。中藥牛膝是中醫(yī)骨傷科常用藥物，具有補肝腎、強筋骨作用。本研究擬通過建立去卵巢骨質(zhì)疏松性骨折小鼠模型、進行分組藥物干預對照實驗，以明確牛膝有效成分β-蛻皮甾酮是否可通過提高β-catenin/BMP表達水平，動員BMSCs的活性，促進其定向分化，發(fā)揮治療骨質(zhì)疏松骨折的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 3個月齡TOPGAL小鼠50只，雌性，SPF級，質(zhì)量（28.5±2.6）g，由上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心訂購。實驗動物飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心。所有小鼠在整個實驗過程中均自由飲水和進食。

1.2 實驗藥物與試劑 β-蛻皮甾酮（上海諸德生物科技有限公司）；仙靈骨葆膠囊[國藥準字Z20025337，規(guī)格：0.5 g/粒，國藥集團同濟堂（貴州）制藥有限公司］，膠囊內(nèi)容物與蒸餾水混合制成相應濃度混懸液；氯胺酮（西安力邦制藥有限公司）；10%中性福爾馬林（廣州維格斯生物科技有限公司）；14%乙二胺四乙酸（EDTA）、蘇木素染液，均購于北京百奧思科生物醫(yī)學技術(shù)有限公司；鹽酸乙醇分化液、伊紅染液、甘油明膠封片劑、甲苯胺藍染色試劑，均購于武漢谷歌生物科技有限公司；兔多克隆Anti-β-catenin、羊抗兔IgGBiotin，均購于英國abcam公司；DAB顯色試劑盒，購于北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司；超敏雌二醇試劑盒，購于西門子醫(yī)學診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS），購于美國Hyclone公司；牛血清白蛋白（BSA），購于碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗儀器 超凈工作臺（AIRTECH公司）；電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；小型臺式冷凍型離心機（德國Eppendorf公司）；SN-697γ計數(shù)器（上海核所日環(huán)光電儀器有限公司）；Micro-CT（瑞士Scanco Medical公司）；全自動免疫組化染色系統(tǒng)[丹科醫(yī)療器械技術(shù)服務（上海）有限公司］；VS120-SL全片組織掃描儀（美國Olympus公司）。

1.4 實驗方法 （1）去卵巢骨質(zhì)疏松性小鼠模型的建立[5］：選取3個月齡雌性TOPGAL小鼠，經(jīng)氯胺酮（0.1g/kg）腹腔注射麻醉后，取俯臥位，選取肋弓下第3～4腰椎處作為手術(shù)入路，備皮后碘伏消毒，經(jīng)腰背側(cè)正中無菌操作下鈍性分開腰部筋膜、肌肉，切開腹膜，分離、暴露卵巢，結(jié)扎輸卵管和周圍血管后摘除卵巢。隨后以相同的方法摘除對側(cè)卵巢。在確保雙側(cè)卵巢摘除后，逐層縫合腹膜至皮膚，慶大霉素注射手術(shù)切口。選取40只小鼠均按上述方法行雙側(cè)卵巢摘除。另外，隨機選取10只小鼠進行假手術(shù)，不摘除卵巢，僅去除卵巢周圍部分脂肪組織，作為假手術(shù)組；3個月后從行雙側(cè)卵巢摘除的40只小鼠中隨機選取10只作為去卵巢組，與假手術(shù)組小鼠同時處死后進行指標檢測（包括子宮重量測定、血清雌二醇水平測定和脛骨近端micro-CT掃描），以證實去卵巢骨質(zhì)疏松性小鼠模型的造模成功。（2）骨質(zhì)疏松性骨折小鼠模型建立[5］：選取30只去卵巢骨質(zhì)疏松性小鼠，經(jīng)氯胺酮（0.1 g/kg）腹腔注射麻醉后，取仰臥位，選取左側(cè)脛骨備皮消毒，無菌操作下切開小鼠脛骨前緣皮膚1.5 cm，鈍性分離脛骨內(nèi)外側(cè)組織，髓內(nèi)針由脛骨平臺處插入脛骨上1/3處時，使用手術(shù)剪避開脛骨內(nèi)側(cè)深部肌肉在1/3處完全橫斷脛骨后，髓內(nèi)針頭繼續(xù)插入骨折斷端下部骨腔約3/4長度時剪斷，完成手術(shù)后逐層縫合。（3）分組與藥物干預：將30只骨質(zhì)疏松性骨折小鼠隨機均分為空白對照組、β-蛻皮甾酮組和仙靈骨葆組，每組各10只。小鼠骨折術(shù)后第2天分別給予0.9%氯化鈉溶液及相應藥物0.5 mL灌胃治療，1次/d，連續(xù)灌胃治療4周后取材進行相關(guān)指標檢測。（4）以放射免疫分析法測定血清雌二醇水平[6］：灌胃4周后，3組小鼠眼球取血處死，血液裝入1.5 mL無菌EP管中，室溫放置20～30 min，后于4℃下以3,000 r/min，離心15 min，分離出血清液移入新的EP管中，-80℃保存。將低溫保存的血清液樣本送至上海中醫(yī)藥大學核醫(yī)學放射免疫實驗室，由實驗室工作人員使用超敏雌二醇試劑盒，SN-697γ計數(shù)器完成檢測。（5）以影像學掃描（X線、Micro-CT）檢測小鼠脛骨愈合情況[7］：灌胃4周后，3組小鼠眼球取血處死，立即取出左側(cè)脛骨，剔除多余軟組織；選取脛骨下段近關(guān)節(jié)處，剪斷暴露骨髓腔（利于脛骨內(nèi)骨髓固定），浸入10%中性福爾馬林中固定48 h后予更換75%乙醇長期固定保存，分別進行X線及Micro-CT掃描，統(tǒng)一定位左側(cè)脛骨上段1/3處，分辨率為18μm逐層掃描成像及三維重建。（6）β-蛻皮甾酮對β-catenin、BMP-7表達水平的影響：3組小鼠左側(cè)脛骨Micro-CT掃描結(jié)束后，14%EDTA（PH7.4）進行脫鈣處理3～4周，第1周更換脫鈣液1次/d，第2～3周更換1次/2 d。X線確認脫鈣完全后，再進行脫水、石蠟包埋處理，矢狀位連續(xù)切片（4～5μm）。并對標本進行HE、免疫組化染色，使用Olympus VS120-SL采片、分析。①以蘇木精-伊紅（Hematoxylin-Eosin，HE）染色進行病理學觀察分析[5，7］：石蠟切片60℃烤箱5 min，常規(guī)二甲苯脫蠟，經(jīng)乙醇至水洗，吸干水后蘇木素染液2 min，蒸餾水沖洗1 min，吸干水后鹽酸乙醇分化5 s，氨水返藍15 s，蒸餾水沖洗，吸干水后以伊紅染液2 min，蒸餾水清洗。脫水后，梯度乙醇分化，二甲苯透明，中性樹膠封固，使用Olympus VS120-SL于20倍目鏡下觀察。②以免疫組化染色觀察β-catenin、BMP-7的蛋白表達水平[5，7］：石蠟切片60℃烤箱5 min，常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水沖洗1 min，滴加甲醇：過氧化氫（1∶9），室溫下孵育15 min，蒸餾水沖洗，滴加抗原修復液：蒸餾水（1∶50），高溫高壓至（105℃，0.025Kpa），自然冷卻至室溫，PBS洗片2 min×3次，5%BSA封閉20 min。37℃下滴加一抗（β-catenin：1%BSA 1∶500、BMP7：1%BSA 1∶200），4℃過夜后PBS洗片2 min×3次，滴加羊抗兔IgG-Biotin；37℃孵育15 min，PBS洗片2 min×3次，滴加SABC；室溫15 min后，PBS洗片2 min×3次，滴加DAB顯色液（蒸餾水1 mL+D1 50μL+D2 100μL+D3 50μL）；室溫孵育3～10 min，梯度乙醇分化，二甲苯透明，中性樹膠封片，在Olympus VS120-SL 20倍目鏡下觀察。1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示。多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血清雌二醇含量測定結(jié)果 β-蛻皮甾酮組及仙靈骨葆組血清中雌二醇含量均明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 藥物對去卵巢小鼠血清雌二醇含量的影響[pg/mL，（±s）］

表1 藥物對去卵巢小鼠血清雌二醇含量的影響[pg/mL，（±s）］

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與空白對照組比較，#P＜0.05

組別 雌二醇空白對照組 3.27±3.40 β-蛻皮甾酮組 8.14±4.19*仙靈骨葆組 12.23±4.92*#空白對照組

2.2 X線檢測結(jié)果 空白對照組骨折端少量稀疏骨痂通過和少量外骨痂形成，骨折線可見；而β-蛻皮甾酮組和仙靈骨葆組骨折端外骨痂致密，部分髓腔再通，骨折線模糊。見圖1。

圖1 X-ray檢測結(jié)果的比較

2.3 micro-CT掃描結(jié)果 空白對照組骨皮質(zhì)厚度明顯變薄，骨小梁稀疏、數(shù)量顯著減少；β-蛻皮甾酮組與仙靈骨葆組骨皮質(zhì)厚度明顯優(yōu)于空白對照組，骨小梁結(jié)構(gòu)相對緊密、均勻。見圖2。

圖2 micro-CT掃描結(jié)果

2.4 HE染色結(jié)果 與空白對照組比較，β-蛻皮甾酮組和仙靈骨葆組小鼠骨小梁數(shù)量、密度均得到明顯改善，骨痂形狀更為規(guī)則，與骨皮質(zhì)貼合程度更高，其中以β-蛻皮甾酮組效果最佳。見圖3。

圖3 骨組織HE染色（×20）

2.5 免疫組化染色結(jié)果 β-蛻皮甾酮組和仙靈骨葆組BMP-7、β-catenin表達陽性水平高于空白對照組，染色較深，但以β-蛻皮甾酮的密集度更高，染色更深。見圖4。

圖4 骨組織免疫組化染色（×20）

3 討論

骨質(zhì)疏松性骨折由于骨質(zhì)量差和骨強度低易發(fā)生骨折延遲愈合或不愈合、骨折術(shù)后內(nèi)固定松動等[8］。因此如何在治療原發(fā)病的同時促進骨折愈合，縮短治療周期，降低再次骨折發(fā)生率，是當前骨質(zhì)疏松性骨折治療的難點。目前臨床上使用的藥物以特立帕肽、雙膦酸鹽類等化學藥物為主，臨床使用中存在局限性和并發(fā)癥[9-10］。

本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，β-蛻皮甾酮組、仙靈骨葆組能明顯提高骨質(zhì)疏松性骨折小鼠血清雌二醇水平（P＜0.05），但β-蛻皮甾酮組效果稍遜于仙靈骨葆組，表明β-蛻皮甾酮可以通過提高雌二醇含量實現(xiàn)抗骨質(zhì)疏松作用。X線檢測結(jié)果顯示，空白對照組骨折端少量稀疏骨痂通過和少量外骨痂形成，骨折線可見；而β-蛻皮甾酮組和仙靈骨葆組骨折端外骨痂致密，部分髓腔再通，骨折線模糊。Micro-CT掃描結(jié)果顯示，空白對照組骨皮質(zhì)厚度明顯變薄，骨小梁稀疏、數(shù)量顯著減少；β-蛻皮甾酮組與仙靈骨葆組骨皮質(zhì)厚度明顯優(yōu)于空白對照組，骨小梁結(jié)構(gòu)相對緊密、均勻。表明，β-蛻皮甾酮能促進去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松性骨折的愈合，增加骨痂、骨量。

此外，在抗骨質(zhì)疏松以及骨折愈合過程中，BMSCs成骨分化起重要作用。BMSCs成骨分化潛力是影響骨再生和重建的重要因素，當BMSCs更偏向于向脂肪細胞分化時骨形成明顯減少則容易導致骨質(zhì)疏松，甚至發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折[11-12］。目前研究中，Wnt/β-catenin信號通路、BMP信號通路均被證明在調(diào)節(jié)BMSCs成骨分化中的發(fā)揮重要作用[13］。文獻報道，在Wnt/β-catenin信號通路中，由Wnt蛋白參與形成的三聚體復合物可以阻止β-catenin蛋白磷酸化降解，β-catenin蛋白在細胞中的濃度升高，最終激活下游靶基因[14］。高表達的β-catenin蛋白可以促進BMSCs向成骨細胞分化[3］。而BMP信號通路則通常由BMP作為啟動因子，促進下游Smad磷酸化，最終誘導BMSCs成骨分化[15］。且有研究證實，BMP-7是該信號通路的主要啟動因子之一，可作為評價BMSCs分化能力的重要指標[4，16］。此外文獻報道顯示，Wnt/β-catenin信號通路與BMP信號通路在BMSCs成骨分化的不同階段起協(xié)調(diào)作用[17］。為驗證β-蛻皮甾酮是否可通過調(diào)控β-catenin/BMP通路發(fā)揮促進BMSCs成骨分化的作用，本研究通過比較各組小鼠脛骨HE染色及免疫組化染色后的β-catenin、BMP-7表達水平，發(fā)現(xiàn)β-蛻皮甾酮可有效增強去卵巢小鼠骨痂中BMP-7和β-catenin的表達，從而提高骨髓間充質(zhì)干細胞分化能力，增加成骨細胞含量。

綜上所述，β-蛻皮甾酮可通過增強BMP-7、β-catenin表達促進BMSCs定向分化，發(fā)揮治療骨質(zhì)疏松性骨折的作用。但本實驗尚未揭露BMP-7和β-catenin是否具有上下游關(guān)系，需進行進一步研究。