張華琴 萬(wàn)鳳 唐玥雯 楊汝春* 王洲婷

慢性腎?。╟hronic kidney disease，CKD）發(fā)病率逐年增高，全球已有超過(guò)7億慢性腎病患者，死亡人數(shù)達(dá)120萬(wàn)。我國(guó)以1.323億患者成為全球CKD患者最多的國(guó)家。因此，CKD可能也是引起病理性早衰的重要原因。模擬人類腎臟疾病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型對(duì)闡明機(jī)制及防治的研究具有重要意義，但目前腎臟損傷伴隨衰老的模型尚無(wú)報(bào)道。阿霉素和腺嘌呤分別通過(guò)誘導(dǎo)腎小球或腎小管損傷誘導(dǎo)腎臟損傷[1］，但兩者聯(lián)合對(duì)腎功能、腎病理及腎組織衰老的誘導(dǎo)作用研究較少。本研究觀察阿霉素與腺嘌呤聯(lián)合誘導(dǎo)大鼠腎損傷和腎衰老的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 無(wú)特定病原菌雄性SD大鼠24只，體重115.7±4.7 g，購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.2 主要試劑 D-半乳糖（源葉，S11050），阿霉素（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：040505），腺嘌呤（索萊寶，A8330），丙二醛（Malonic dialdehyde，MDA）試劑盒（碧云天，S0131S），兔抗p16INK4α多克隆抗體（碧云天，AF647），鼠抗GAPDH（ProteinTech，60,004-1-Ig），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗鼠、抗兔及抗羊IgG（H+L）、ABC（鏈霉素-卵白素）免疫組化檢測(cè)試劑盒（均購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司）；β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal）試劑盒（碧云天，C0602）。

1.3 方法 （1）大鼠造模與實(shí)驗(yàn)分組：將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照（NC）組6只和不同造模組各8只，D-半乳糖組（D組）腹腔注射D-半乳糖100 mg/（kg·d）；阿霉素+腺嘌呤組（A+X組）尾靜脈注射阿霉素5 mg/kg，3周后灌胃腺嘌呤100 mg/（kg·d）4周。模型組與正常對(duì)照組大鼠均常規(guī)飼養(yǎng)。（2）檢測(cè)指標(biāo)與方法：實(shí)驗(yàn)結(jié)束前在代謝籠中代謝，收集24 h尿，測(cè)量尿量，測(cè)定尿蛋白，計(jì)算24 h尿蛋白（urinary protein，UP）。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱取體重，腹主動(dòng)脈取血，檢測(cè)血肌酐。取腎臟，稱取單腎重，計(jì)算腎重與體重指數(shù)。去腎包膜，取部分腎組織用于檢測(cè)MDA水平，用蛋白含量進(jìn)行校正；部分腎組織4%多聚甲醛固定，行蘇木精-伊紅染色（HE）和Masson染色，觀察腎臟組織病理?yè)p傷和纖維化，采用ImagePro plus6.0圖像分析；免疫組化檢測(cè)腎組織p16INK4α蛋白原位表達(dá)；腎組織冷凍切片檢測(cè)SA-β-GAL活性；戊二醛固定腎組織，進(jìn)行透射電鏡檢查，觀察腎組織超微觀病理改變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用（±s）表示，多組間比較采用one-way ANOVA，組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重、腎重以及腎重/體重比較 大鼠從造模到試驗(yàn)結(jié)束共8周，D組實(shí)驗(yàn)期間死亡1只，A+X組死亡2只。與NC組比較，D組和A+X組大鼠體重和腎重/體重指數(shù)均顯著增高，A+X組腎重/體重指數(shù)高于D組；A+X組腎重高于NC組和D組。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體重、腎重以及單腎/體重指數(shù)比較（±s）

表1 各組大鼠體重、腎重以及單腎/體重指數(shù)比較（±s）

注：與NC組比較，*P＜0.05；與D組比較，#P＜0.05

組別 n 體重（g） 腎重（g） 腎重/體重×100 NC組 6 343.5±37.6 1.11±0.08 3.25±0.27 D組 7 261.4±60.4* 1.03±0.18 4.02±0.57*A+X組 6 283.3±25.0* 1.42±0.20*# 5.03±0.77*#F值 5.69 10.01 14.40 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.2 各組大鼠尿蛋白、血肌酐水平比較 A+X組血肌酐水平高于NC組和D組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠尿蛋白、血肌酐水平比較（±s）

表2 各組大鼠尿蛋白、血肌酐水平比較（±s）

注：與NC組和D組比較，*P＜0.05

組別 n 24 h尿蛋白（g/μmoL） 血肌酐（μmol/L）NC組 6 6.39±1.41 31.90±1.95 D組 7 5.43±1.10 31.93±3.72 A+X組 6 23.29±17.35 41.35±8.03*F值 6.10 7.27 P值 ＞0.05 ＜0.05

2.3 大鼠腎組織病理改變 NC組大鼠腎組織切片光鏡下可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)正常、排列整齊，腎小球結(jié)構(gòu)清晰，毛細(xì)血管襻開(kāi)放良好；D組與NC組相似；A+X組大鼠腎組織可見(jiàn)明顯的腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，有不同程度的間質(zhì)纖維化，腎小管管腔擴(kuò)張，部分管腔內(nèi)有蛋白管型，腎小球系膜基質(zhì)增生并呈彌漫性分布。A+X組總纖維化和腎小球硬化高于NC組和D組。見(jiàn)表3和圖1～2。

表3 腎小管間質(zhì)和腎小球總纖維化半定量分析比較（±s）

表3 腎小管間質(zhì)和腎小球總纖維化半定量分析比較（±s）

注：與NC組和D組比較，*P＜0.05

組別 n 腎間質(zhì)與腎小球總纖維化（OD） 腎小球硬化（OD）NC組 4 0.010±0.005 0.041±0.005 D組 4 0.016±0.006 0.043±0.008 A+X組 4 0.046±0.003* 0.074±0.009*F值 60.94 23.13 P值 ＜0.05 ＜0.05

圖1 大鼠腎組織石蠟切片HE染色

圖2 大鼠腎組織石蠟切片Masson染色

2.4 透射電鏡觀察大鼠腎小球超微觀結(jié)構(gòu) 透射電鏡下NC組腎小球基底膜厚薄均勻，界限清楚，足細(xì)胞足突排列整齊，內(nèi)皮細(xì)胞窗孔清晰；D組與NC組相似；A+X組腎小球基底膜部分增厚，界限不清，足細(xì)胞足突輕中度融合，內(nèi)皮細(xì)胞窗孔部分消失。見(jiàn)圖3。

圖3 透射電鏡觀察各實(shí)驗(yàn)組腎小球足細(xì)胞（×5,000）

2.5 大鼠腎組織SA-β-Gal及MDA比較 D組和A+X組腎組織MDA水平比NC組增高；D組和A+X組腎組織SA-β-Gal活性均高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4和圖4。

圖4 β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)

表4 各組大鼠腎組織SA-β-Gal及MDA比較

2.6 免疫組化技術(shù)檢測(cè)大鼠腎組織p16INK4α蛋白原位表達(dá)水平比較 NC組大鼠腎組織p16INK4α在腎小管刷狀緣呈陽(yáng)性表達(dá)，腎小管及腎小球p16INK4α陽(yáng)性染色較弱；D組與A+X組大鼠腎組織中除腎小管刷狀緣外，腎小管及腎小球p16INK4α陽(yáng)性染色均明顯增強(qiáng)，A+X組腎小球陽(yáng)性染色增強(qiáng)。D組與A+X組大鼠腎間質(zhì)及腎小球總p16INK4α積分光密度（IOD）均比NC組增強(qiáng)，A+X組腎小球p16INK4α比D組增強(qiáng)。見(jiàn)表5和圖5。

表5 各實(shí)驗(yàn)組大鼠腎間質(zhì)及腎小球總p16INK4α半定量分析[IOD，（±s）］

表5 各實(shí)驗(yàn)組大鼠腎間質(zhì)及腎小球總p16INK4α半定量分析[IOD，（±s）］

注：與NC組比較，*P＜0.05；與D組比較，#P＜0.05

組別 n 腎間質(zhì)+腎小球總p16INK4α 腎小球p16INK4α NC組 4 137,783±22,771 3,513±665 D組 4 260,429±21,348* 13,964±3,881*A+X組 4 277,780±36,019* 30,421±4,690*#F值 30.76 27.3 P值 ＜0.05 ＜0.05

圖5 免疫組化技術(shù)檢測(cè)各組p16INK4α表達(dá)

3 討論

CKD可能是導(dǎo)致人體早衰的重要病理原因。有研究顯示，CKD患者存在著認(rèn)知減退現(xiàn)象，腎小球?yàn)V過(guò)率嚴(yán)重下降與進(jìn)展性的認(rèn)知惡化密切相關(guān)[2］。CKD還會(huì)導(dǎo)致礦物骨病，并引起血管鈣化[3］。CKD患者性激素水平及性功能均隨腎小球?yàn)V過(guò)率降低而明顯下降，并影響正常生活[4］。CKD患者甲狀腺功能及促甲狀腺激素水平也受到影響，導(dǎo)致鈣磷等代謝紊亂[5］。

阿霉素可引起腎小球?yàn)V過(guò)膜通透性增加，破壞腎小球?yàn)V過(guò)膜的結(jié)構(gòu)和功能[6］。阿霉素腎病模型主要表現(xiàn)為蛋白尿、足細(xì)胞損害、高血脂的腎病綜合征，隨著病情的發(fā)展出現(xiàn)腎小球硬化、腎臟纖維化，嚴(yán)重可導(dǎo)致腎功能衰竭。腺嘌呤誘導(dǎo)慢性腎功能衰竭大鼠模型主要是通過(guò)腺嘌呤引起腎小管梗阻，腎單位大量喪失，導(dǎo)致氮質(zhì)血癥，毒素蓄積及電解質(zhì)和氨基酸代謝紊亂，進(jìn)而引起腎功能衰竭[7］。

本研究結(jié)果顯示，D組和A+X組大鼠腎重/體重指數(shù)均增高，提示兩組腎臟均發(fā)生病理改變；其中阿霉素聯(lián)合腺嘌呤組血肌酐水平增高，大鼠腎病理可見(jiàn)明顯的炎細(xì)胞浸潤(rùn)和間質(zhì)纖維化及足細(xì)胞出現(xiàn)輕中度融合，SA-β-GAL活性及p16INK4α表達(dá)增高，且腎小球p16INK4α表達(dá)水平較NC組和D-半乳糖組增高。D-半乳糖對(duì)大鼠血肌酐水平及腎臟病理?yè)p傷影響不明顯，但可增高腎組織MDA水平、SA-β-GAL活性與p16INK4α蛋白表達(dá)水平。D-半乳糖可增加腎組織MDA和SAβ-GAL活性方面，與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致[8］。在前期研究中亦發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病腎病患者中衰老標(biāo)志分子SAβ-GAL和細(xì)胞周期抑制蛋白p16INK4α在腎小球和腎小管中表達(dá)均增加，提示腎臟疾病中存在細(xì)胞衰老現(xiàn)象[9］。p16INK4α基因是一種新型抗癌基因，在衰老的進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。FAMULSKI等[10］研究發(fā)現(xiàn)硬化腎小球的數(shù)量、間質(zhì)纖維化及腎小管萎縮均與p16INK4α基因表達(dá)相關(guān)。總之，阿霉素聯(lián)合腺嘌呤可誘導(dǎo)CKD致病理性衰老模型。