董宇涵，辜鵬程，張子陽，張麗娟，白 燕

(1.重慶醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，重慶 400016)

腱骨組織的損傷作為一個(gè)全球性的健康問題，每年影響數(shù)百萬人的正常生活與工作[1]。肌腱-骨界面作為軟組織向骨轉(zhuǎn)化的特殊移行區(qū)域，呈現(xiàn)漸變的組織學(xué)構(gòu)成，其具體表現(xiàn)為：從肌腱組織到未礦化纖維軟骨組織，再到礦化纖維軟骨組織，最后到骨組織，各組織在區(qū)域之間無明顯邊界[2-3]。因此，腱骨組織損傷比一般組織損傷更為復(fù)雜，其特殊的結(jié)構(gòu)和功能給組織修復(fù)和再生帶來巨大的挑戰(zhàn)。

組織工程的相關(guān)研究為腱骨損傷修復(fù)帶來了希望，與傳統(tǒng)手術(shù)方式不同的是，它通過制備天然組織替代物，使損傷的肌腱組織可以原位再生，且再生組織能夠模仿原有健康組織的天然結(jié)構(gòu)和功能，并具有長期活性。目前應(yīng)用于腱骨組織工程修復(fù)的支架構(gòu)建技術(shù)有冷凍干燥、3D打印、熱處理溶出等，雖然這些技術(shù)都能提供適宜細(xì)胞生長的結(jié)構(gòu)，但對(duì)于模仿肌腱組織的細(xì)胞生長環(huán)境仍然有所欠缺[1-4]。從解剖學(xué)上講，肌腱由整齊排列的膠原纖維束組成，在組織工程支架中，相比于其它方法所制備的腱骨仿生支架，靜電紡絲纖維結(jié)構(gòu)與肌腱組織在顯微結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能方面的相似性最大[5-6]。有利于肌腱再生的纖維結(jié)構(gòu)按照直徑可分為3類：微米纖維結(jié)構(gòu)、納米纖維結(jié)構(gòu)和微/納米纖維結(jié)構(gòu)。在微米及納米纖維結(jié)構(gòu)中，較大的纖維尺寸可以更好地符合肌腱機(jī)械強(qiáng)度，而納米纖維結(jié)構(gòu)的納米特性可以促進(jìn)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長形態(tài)、排列及表型表達(dá)[7]。因此，利用靜電紡絲技術(shù)得到的微/納米纖維結(jié)構(gòu)相比于其它方法所制備的支架更有利于肌腱組織再生。

靜電紡絲技術(shù)有許多應(yīng)用，如組織工程、藥物/基因輸送、傳感器、高效過濾器等[8]。靜電紡絲技術(shù)因其簡單方便、多功能性和價(jià)格低廉的特點(diǎn)已成為制備纖維結(jié)構(gòu)的最常見方法。靜電紡絲設(shè)備主要通過聚合物溶液的表面張力和由足夠高的電場提供的拉伸力形成紡絲。因而，影響這兩種作用力的工藝參數(shù)會(huì)極大地影響纖維的生成和結(jié)構(gòu)[9-10]。其中，通過調(diào)整靜電紡絲中接收裝置類型及紡絲過程中的工藝參數(shù)，可以獲得排列方向高度一致的纖維支架。這種靜電紡絲取向納米纖維支架區(qū)別于傳統(tǒng)隨機(jī)排列納米纖維支架，顯示出較高的機(jī)械強(qiáng)力。同時(shí)，定向纖維支架與天然肌腱組織細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)相似并保持材料本身的固有特性，從支架的定向結(jié)構(gòu)方面可以用于促進(jìn)細(xì)胞黏附、遷移，而與細(xì)胞或生長因子的結(jié)合可進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞定向生長、分化，最終實(shí)現(xiàn)腱骨組織的再生修復(fù)[11-12]。另外，靜電紡絲中選擇具有與天然組織的機(jī)械性能相匹配的可電紡材料是模仿肌腱組織天然細(xì)胞外基質(zhì)的基礎(chǔ)。左旋聚乳酸(PLLA)是一種具有良好生物相容性的聚合物。最終的降解產(chǎn)物是對(duì)環(huán)境無害的二氧化碳和水[13]。由于PLLA良好的機(jī)械穩(wěn)定性和生物相容性，大量研究已將其用于電紡纖維的生產(chǎn)。

綜上，本研究從靜電紡絲制備工藝參數(shù)方面優(yōu)化腱骨仿生PLLA微/納米纖維支架，并且考察了纖維支架的仿生力學(xué)特性與體外生物相容性，使所制備的纖維能夠更好地模擬天然肌腱組織的結(jié)構(gòu)和性能，以誘導(dǎo)肌腱組織的再生修復(fù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑

左旋聚乳酸(Poly(L-lactic acid)，PLLA)(分子量：9.1萬，岱罡生物)；氯仿(成都市科龍化工試劑廠)；小鼠肌腱細(xì)胞(購買自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫)；α-MEM培養(yǎng)基(MA0216，大連美侖生物技術(shù)有限公司)；胎牛血清(GIBCO)；青霉素/鏈霉素溶液(MA0110，大連美侖生物技術(shù)有限公司)；微絲綠色熒光探針(Actin-Tracker Green，C1033，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液(北京雷根生物技術(shù)有限公司)；鈣黃綠素-AM(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)(Cell Counting Kit-8，CCK-8)試劑盒(K1018，APEXBIO)。

1.2 儀器與設(shè)備

分析電子天平(LS220A SCS，上海天美天平儀器有限公司)；正置光學(xué)顯微鏡(ECLIPSE Ci，NIS-Elements成像軟件，NIKON)；力學(xué)拉伸儀(UniVert，CellScale)；激光共聚焦顯微鏡(LEICA TCS SP8 SR)；臺(tái)式場發(fā)射掃描電鏡(Phenom Pharos G1)；臺(tái)式電紡設(shè)備(FM1101，北京富友馬有限公司)。

本研究中使用的靜電紡絲設(shè)備由高壓直流電源、微量注射泵、噴絲頭、收集裝置以及溫度控制器幾部分組成。其中接收裝置的選擇對(duì)于制備取向纖維膜十分重要。滾筒收集器是最簡單有效獲得纖維膜的裝置之一，只需通過調(diào)整靜電紡絲工藝參數(shù)，即可獲得取向良好、分布均勻的納米纖維膜[14-15]。同時(shí)，使用滾筒裝置接收，纖維的沉積面積較大，可以獲得更高的纖維產(chǎn)出率。因此，本研究選用的靜電紡絲接收裝置為滾筒收集器。

1.3 PLLA紡絲溶液的配制

以PLLA為溶質(zhì)，氯仿為溶劑制備紡絲溶液，常溫下攪拌12 h，充分溶解后得到PLLA-氯仿紡絲溶液。使用一次性注射器吸取5 mL紡絲溶液，安裝型號(hào)為22G的紡絲針頭，將注射器夾于注射泵上，待實(shí)驗(yàn)操作溫度到達(dá)(37±5)℃后開始紡絲。

1.4 制備工藝參數(shù)對(duì)PLLA纖維形貌的影響

對(duì)PLLA靜電紡絲過程中參數(shù)影響進(jìn)行研究，每個(gè)考察因素對(duì)應(yīng)3個(gè)水平進(jìn)行研究，具體參數(shù)設(shè)置如表1。

表1 PLLA靜電紡絲過程參數(shù)考察表

通過掃描式電子顯微鏡(SEM)觀察靜電紡絲法所制備的PLLA纖維的形貌與排列。為了量化研究因素對(duì)纖維直徑的影響，使用Photoshop軟件對(duì)顯微鏡下PLLA纖維照片中隨機(jī)選出的10根纖維進(jìn)行測量，計(jì)算平均直徑，從而為優(yōu)化制備過程和工藝參數(shù)提供依據(jù)。

1.5 PLLA纖維力學(xué)性能表征

將靜電紡絲最優(yōu)制備工藝條件下制備的PLLA定向纖維膜隨機(jī)取出3份樣品，使用游標(biāo)卡尺測量其厚度后統(tǒng)一切割成30 mm長度。參照GB6529/T規(guī)定[16]，將纖維膜試樣在標(biāo)準(zhǔn)大氣要求的環(huán)境條件下進(jìn)行調(diào)溫和調(diào)濕，設(shè)置力學(xué)拉伸儀參數(shù)，夾持長度22 mm，拉伸速度13.2 mm/min。隨機(jī)取出樣品，固定于力學(xué)拉伸儀的夾具中，使樣品縱軸與上下夾具中心連線重合，以確保纖維沿著軸向伸長。通過力學(xué)拉伸儀進(jìn)行拉伸測試，得到纖維膜的載荷位移曲線及應(yīng)力-應(yīng)變曲線，最終計(jì)算獲得PLLA纖維膜的拉伸強(qiáng)度、平均楊氏模量、最大拉伸應(yīng)變。

1.6 纖維支架的細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)

將靜電紡絲隨機(jī)取向纖維膜和定向纖維膜裁剪成邊長為1 cm的正方形薄片。將樣品于超凈臺(tái)下紫外滅菌3 h后置于24孔板底部，加入培養(yǎng)基浸泡過夜。使用完全培養(yǎng)基(100 mL完全培養(yǎng)基配比為：89 mL α-MEM 培養(yǎng)基、10 mL胎牛血清以及1 mL青霉素/鏈霉素溶液)培養(yǎng)小鼠肌腱細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長期后將隨機(jī)取向纖維膜和定向纖維膜分別與生長狀態(tài)良好的第三代小鼠肌腱細(xì)胞共培養(yǎng)，進(jìn)行細(xì)胞相容性相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.6.1 細(xì)胞形貌

將隨機(jī)取向纖維膜(RF)和定向纖維膜(AF)分別與生長狀態(tài)良好的第三代小鼠肌腱細(xì)胞共培養(yǎng)4、7天后使用微絲綠色熒光探針(Actin-Tracker Green)和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色工作液分別對(duì)細(xì)胞骨架和細(xì)胞核進(jìn)行染色，封片后于激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞形貌。

1.6.2 細(xì)胞活力

將隨機(jī)取向纖維膜和定向纖維膜分別與生長狀態(tài)良好的第三代小鼠肌腱細(xì)胞共培養(yǎng)4、7 d后使用鈣黃綠素-AM(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒檢測細(xì)胞活性，封片后于激光共聚焦顯微鏡下對(duì)活細(xì)胞與死細(xì)胞進(jìn)行觀察，并通過Image J軟件估計(jì)活細(xì)胞與死細(xì)胞染色比例。

1.6.3 細(xì)胞增殖

將隨機(jī)取向纖維膜和定向纖維膜分別與生長狀態(tài)良好的第三代小鼠肌腱細(xì)胞共培養(yǎng)1、4、7 d后用CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒檢測TT-D6細(xì)胞增殖能力，使用酶標(biāo)儀測定各樣品于450 nm處吸光度OD值。通過各個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增長率評(píng)價(jià)纖維膜上的細(xì)胞增殖情況。

1.6.4 細(xì)胞遷移

通過Actin-Tracker Green染色細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白，從激光共聚焦圖像重建3D圖像來觀察細(xì)胞在纖維膜上的遷移情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 工藝參數(shù)對(duì)纖維形貌的影響

2.1.1 紡絲溶液聚合物濃度對(duì)纖維形貌的影響

為保證靜電紡絲過程的穩(wěn)定，設(shè)置PLLA-氯仿溶液聚合物質(zhì)量濃度為30、80、130 mg/mL，其他條件不變。研究發(fā)現(xiàn)，紡絲溶液聚合物的濃度是影響纖維直徑大小的主要因素之一。當(dāng)紡絲溶液濃度為30 mg/mL時(shí)，不能拉伸成纖維。這可能是由于溶液黏度較低時(shí)聚合物的分子鏈纏結(jié)不充分，射流穩(wěn)定性差，在電場力的作用下，導(dǎo)致分子鏈之間相互分離。由圖1(a)、(b)可見隨著紡絲液聚合物濃度增大，纖維直徑隨之增大，當(dāng)濃度由80 mg/mL提高到130 mg/mL時(shí)，纖維直徑從(0.94±0.21)μm增加到(3.55±1.00)μm。這一方面是由于聚合物溶液的表面張力隨濃度的增大而增大，在離開注射器針口時(shí)液滴形成纖維的能力便隨之減弱；另一方面，紡絲液濃度增大，所含溶劑量就會(huì)變少，噴口處聚合物易凝結(jié)，溶劑完全揮發(fā)所需時(shí)間變短，纖維受拉伸的時(shí)間也減短，致使纖維直徑隨紡絲液濃度呈正相關(guān)關(guān)系。綜合考慮，在PLLA-氯仿溶液聚合物濃度為80 mg/mL下制備的纖維更適合模擬肌腱組織。

圖1 不同紡絲溶液聚合物濃度下纖維的SEM形貌

2.1.2 環(huán)境濕度對(duì)纖維形貌的影響

設(shè)置的環(huán)境相對(duì)濕度分別為40%、50%、60%。紡絲環(huán)境濕度是影響纖維形貌的主要環(huán)境因素。靜電紡絲過程中的環(huán)境濕度主要影響紡絲溶液中溶劑的揮發(fā)速率，從而影響例如形態(tài)、機(jī)械性能、相組成等系列特性。環(huán)境濕度降低時(shí)，空氣中的水蒸氣含量減少，紡絲溶液中溶劑的揮發(fā)速率加快，如圖2(a)，此時(shí)較低的相對(duì)濕度有利于形成表面更干燥的纖維。然而，如果相對(duì)濕度太低，溶劑揮發(fā)快，阻礙了射流的延伸，容易造成纖維的不連續(xù)沉積[17]。另一方面，當(dāng)相對(duì)濕度達(dá)到足夠高的水平時(shí)，紡絲溶液中溶劑的揮發(fā)速率降低，從而影響射流的凝固速率，如圖2(c)所示，紡絲過程中溶劑不能在到達(dá)接收板前揮發(fā)完全。同時(shí)，相對(duì)濕度較高時(shí)，空氣中的水蒸氣可能滲透到射流中[17]，水蒸氣冷凝成液珠并附著于纖維表面，導(dǎo)致多孔纖維的形成。由圖2可知，在環(huán)境相對(duì)濕度為40%的條件下，可以保證紡絲過程中纖維的連續(xù)沉積并保持良好的形貌特征。

圖2 不同濕度下纖維的SEM形貌

2.1.3 接收轉(zhuǎn)速對(duì)纖維形貌的影響

已有文獻(xiàn)指出，接收器的接收轉(zhuǎn)速對(duì)纖維的取向程度以及直徑有影響[18-19]。接收器旋轉(zhuǎn)時(shí)產(chǎn)生的機(jī)械力有拉伸纖維的作用，在達(dá)到一定的轉(zhuǎn)速時(shí)即可使纖維以對(duì)齊的方式沉積。如圖3(a)所示，接收器的轉(zhuǎn)速為500 r/min時(shí)，纖維無明顯取向，多數(shù)纖維呈螺旋狀分布，不能滿足模擬肌腱組織天然細(xì)胞外基質(zhì)定向排列要求。盡管高旋轉(zhuǎn)對(duì)取向纖維產(chǎn)生機(jī)械拉伸效應(yīng)，在轉(zhuǎn)速提升到1 000 r/min時(shí)，纖維定向性得到提高，但直徑(1.79±0.46)μm略高于在500 r/min條件下所產(chǎn)生的纖維直徑(1.45±0.35)μm。這種現(xiàn)象可能是由于纖維沉積時(shí)接收器的高速運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致了更快的溶劑蒸發(fā)速率，從而降低了溶液電導(dǎo)率，使纖維直徑在一定程度下隨著收集器速度的增加而小幅增加。當(dāng)轉(zhuǎn)速提升到1 500 r/min時(shí)，機(jī)械拉伸作用顯著增加，并顯著高于溶劑蒸發(fā)對(duì)纖維直徑的影響，使得纖維直徑明顯下降(0.94±0.21)μm，同時(shí)具有良好的取向性。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，接收器1 500 r/min的高速運(yùn)動(dòng)下接收到的纖維具明顯取向性，可以滿足模擬肌腱組織天然細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的定向排列特征目的。

圖3 不同接收轉(zhuǎn)速下纖維的SEM形貌

2.1.4 收集距離對(duì)纖維形貌的影響

保持紡絲過程中其他因素不變，設(shè)置注射泵針頭尖端到接收器距離分別為10、20、30 cm。比較圖4(a)、(b)給出的接收距離分別為10和20 cm時(shí)的纖維形貌，可見，接收距離為10 cm的纖維直徑明顯較大，這是由于較短的接收距離造成了纖維沉積時(shí)間的減少，溶劑揮發(fā)不完全導(dǎo)致大直徑片狀纖維的產(chǎn)生。紡絲溶液從針頭噴出后，在一定的空間間隔內(nèi)沿直線運(yùn)動(dòng)，經(jīng)歷彎曲不穩(wěn)定和鞭打運(yùn)動(dòng)，然后將纖維沉積在接收器上[20]。因此，在一定程度上接收距離越大，纖維拉長越多，則纖維越細(xì)。然而，由圖4(c)可知，當(dāng)接收距離為30 cm時(shí)，纖維直徑為(1.71±0.43)μm，大于接收距離為20 cm時(shí)的纖維直徑(0.94±0.21)μm。這是因?yàn)槔w維沉積過程的電場強(qiáng)度隨著工作距離的增加而減小，當(dāng)超過了一定距離后紡絲溶液所受到的靜電力降低，使纖維變粗?？梢?，注射泵針頭尖端到接收器距離短時(shí)，產(chǎn)生片狀纖維；接收距離過大時(shí)，不僅增加纖維直徑，而且導(dǎo)致纖維附著點(diǎn)重復(fù)性降低，減小纖維之間的取向性。

圖4 不同接收距離下纖維的SEM形貌

2.1.5 推注速度對(duì)纖維形貌的影響

設(shè)置靜電紡絲注射泵梯度推注速度分別為0.8、0.5、0.3 μL/s。研究表明[17]，如果當(dāng)注射泵推注速度過快時(shí)，纖維的產(chǎn)生速度小于溶液推出速度導(dǎo)致完整纖維的形成受阻。如圖5(a)，當(dāng)注射泵推注速度為0.8 μL/s時(shí)，流速過快，導(dǎo)致針口液滴不穩(wěn)定，溶劑量隨之增大，揮發(fā)速率低，不能使纖維在飛行過程中完全干燥，沉積到接收器時(shí)纖維發(fā)生融合，呈片狀分布。注射泵推注速度由0.8 μL/s降低到0.5 μL/s時(shí)，從圖5(b)中仍然能觀察到片狀纖維，但相比于0.8 μL/s已大幅減少。當(dāng)注射泵推注速度降至0.3 μL/s時(shí)(圖5(c))，靜電場內(nèi)的電場力能夠充分作用于液滴，纖維已經(jīng)完整成形。由此可見，注射泵推注速度主要影響纖維的產(chǎn)生速度，進(jìn)而決定了靜電紡絲的生產(chǎn)效率，纖維產(chǎn)出率隨推注速度的增大而得到提高。推注速度也同時(shí)決定著纖維的直徑大小，在一定范圍內(nèi)，纖維的直徑隨著注射泵推注速度的增大而增大。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，靜電紡絲注射泵梯度推注速度為0.3μL/s時(shí)，靜電場內(nèi)的電場力能夠充分作用于液滴，纖維形貌優(yōu)良。

圖5 不同注射泵推注速度下纖維的SEM形貌

2.1.6 附加電壓對(duì)纖維形貌的影響

實(shí)驗(yàn)設(shè)置的紡絲正電壓分別為10、17.5和25 kV，比較在3個(gè)不同的電壓下采集的纖維的SEM圖像。如圖6(a)～(c)所示，在3種不同電壓下，纖維都是光滑的，沒有串珠狀或片狀纖維，并且在各個(gè)電壓下的纖維直徑分別為(1.73±0.38)、(1.49±0.38)、(0.94±0.21)μm。雖然直徑呈梯度減小，但是大小無明顯區(qū)別，并且在不同電壓之下，纖維之間仍然保持定向排列，表明靜電紡絲過程中的附加電壓不是纖維結(jié)構(gòu)的主要影響因素。

圖6 不同附加電壓下纖維的SEM形貌

綜上，本研究中靜電紡絲最佳工藝參數(shù)為：使用聚合物質(zhì)量濃度為80 mg/mL的PLLA-氯仿紡絲溶液在相對(duì)濕度梯度為40%、紡絲電壓為25 kV、接收距離為20 cm、注射泵推注速度為0.3 μL/s以及接收轉(zhuǎn)速裝置為1 500 r/min的條件下制備定向纖維膜，以達(dá)到模擬肌腱組織天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的要求。

2.2 力學(xué)性能分析

肌腱在肌腱-骨界面中是用于傳遞力學(xué)的結(jié)締組織，力學(xué)相關(guān)表征是肌腱修復(fù)材料重要的指標(biāo)之一。為了評(píng)估本研究中靜電紡絲最優(yōu)制備工藝下PLLA定向纖維膜的力學(xué)特性，隨機(jī)取出3份樣品，使用游標(biāo)卡尺測量其厚度分別為0.027、0.057、0.078 mm后統(tǒng)一切割成300 mm長度。圖7給出了纖維膜的載荷-位移曲線。

圖7 定向纖維膜力學(xué)性能載荷-位移曲線

由圖7可知，所制備的PLLA纖維平均拉伸強(qiáng)度約為(14.80±0.32)MPa，楊氏模量為(807.02±45.09)MPa。成年哺乳動(dòng)物的肢體肌腱，其拉伸強(qiáng)度的范圍在10～70 MPa，最常見的大約為13 MPa[21]，因此本研究所制備的PLLA定向纖維膜可基本滿足成年哺乳動(dòng)物的肢體肌腱的力學(xué)特性要求。同時(shí)，也可觀察到在橫截面積0.27 cm2至0.78 cm2的范圍內(nèi)，其最大載荷為(4.33±0.32)N至(11.31±0.48)N，可推斷如要求所制備纖維應(yīng)滿足不同的載荷，通過改變纖維膜紡織厚度即可達(dá)到目的。

2.3 細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)

2.3.1 細(xì)胞形貌

將隨機(jī)取向纖維膜(RF)和定向纖維膜(AF)分別與生長狀態(tài)良好的第三代小鼠肌腱細(xì)胞共培養(yǎng)4、7 d后，通過激光共聚焦顯微鏡(如圖8所示)均可觀察到兩種纖維膜上各自黏附的肌腱細(xì)胞生長方向與纖維取向高度一致，且細(xì)胞骨架顯著沿纖維定向伸長，但由于非定向纖維膜上纖維分布隨機(jī)性較高而導(dǎo)致細(xì)胞散落分布，與普通平板上培養(yǎng)的細(xì)胞分布程度較為相似，然而其細(xì)胞取向排列程度遠(yuǎn)不如定向纖維。因此，還需選擇定向纖維膜來滿足模擬肌腱細(xì)胞天然細(xì)胞外基質(zhì)定向特征要求。

圖8 激光共聚焦顯微鏡下細(xì)胞形貌圖

2.3.2 細(xì)胞活力

使用Calcein-AM/PI活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒檢測細(xì)胞活性，封片后在共聚焦熒光顯微鏡下觀察到大量的活細(xì)胞和罕見的死亡細(xì)胞(如圖9所示)，表明無論是隨機(jī)取向纖維膜還是定向纖維膜上黏附的TT-D6都具有良好的活性。同時(shí)通過Image J軟件計(jì)算4、7 d的存活細(xì)胞占比也顯著高于死亡細(xì)胞。

圖9 纖維支架對(duì)細(xì)胞活力的影響

2.3.3 細(xì)胞增殖

如圖10所示，根據(jù)CCK-8結(jié)果，發(fā)現(xiàn)無論是隨機(jī)取向纖維膜或者定向纖維膜對(duì)小鼠肌腱細(xì)胞的增殖均無明顯不良影響，同時(shí)在定向纖維支架上種植的細(xì)胞增殖速度顯著高于空白對(duì)照組(普通培養(yǎng)環(huán)境下的肌腱細(xì)胞，CG)。

圖10 纖維支架對(duì)細(xì)胞增殖的影響

2.3.4 細(xì)胞遷移

將定向與非定向纖維膜的激光共聚焦顯微鏡圖像進(jìn)行3D重建，從纖維膜3D重建圖截面觀察細(xì)胞的遷移狀態(tài)。由圖11可觀察到，細(xì)胞在定向和非定向膜上都具有一定的細(xì)胞遷移效應(yīng)，但是非定向膜纖維上黏附與遷移的細(xì)胞數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于定向纖維膜。其原因可能是PLLA作為酯類物質(zhì)，其本身親水性差，由于非定向膜纖維之間的孔隙率會(huì)隨著紡絲時(shí)間的延長而減小，這種孔隙率的減小極其不利于細(xì)胞的黏附與生長。對(duì)于定向纖維膜來說，在經(jīng)過長時(shí)間的紡絲操作后纖維之間仍然會(huì)平行排列，這種結(jié)構(gòu)有利于保持高孔隙率，細(xì)胞便于在纖維間生長、遷移、養(yǎng)分流動(dòng)。

圖11 纖維支架對(duì)細(xì)胞遷移的影響

3 結(jié) 論

1)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，接收轉(zhuǎn)速是影響纖維定向排列的最主要因素，紡絲液聚合物濃度是影響纖維直徑的最主要因素，其次是接收距離、環(huán)境濕度、推注速度。當(dāng)PLLA-氯仿紡絲液聚合物質(zhì)量濃度為80 mg/mL、接收轉(zhuǎn)速為1500 r/min、接收距離為20 cm、注射泵推注速度為0.3 μL/s以及紡絲電壓為25 kV時(shí)，制備的PLLA纖維成型性良好，平均直徑為(0.94±0.21)μm，纖維之間平行分布，可達(dá)到模擬肌腱組織的天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的要求。

2)PLLA定向纖維膜平均拉伸強(qiáng)度約為(14.80±0.32)MPa，與成年哺乳動(dòng)物的肢體肌腱常見拉伸強(qiáng)度相近，可基本滿足成年哺乳動(dòng)物的肢體肌腱的力學(xué)特性要求。

3)制備的纖維膜細(xì)胞相容性良好，并且細(xì)胞沿纖維定向生長，定向纖維結(jié)構(gòu)上的細(xì)胞排列規(guī)則，非定向結(jié)構(gòu)上的細(xì)胞呈隨機(jī)分布。定向性排列纖維膜具有改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)的作用，有利于符合模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)要求。

本研究所制備的纖維膜能夠滿足肌腱組織修復(fù)的需要，但該P(yáng)LLA纖維在肌腱組織的再生修復(fù)中的應(yīng)用還需要通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。