韓澤平，蔡 貞

1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510515；2.廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 511400

結(jié)直腸癌是全球最常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率居惡性腫瘤的第3位，也是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1]。手術(shù)及放化療是目前治療結(jié)直腸癌的主要方法，但由于外科手術(shù)的局限性、放療劑量的限制、化療藥物的不良反應(yīng)及耐藥性等影響，導(dǎo)致結(jié)直腸癌治療及預(yù)后仍不理想[2]。近年來(lái)，傳統(tǒng)中草藥及其有效成分的抗癌、調(diào)節(jié)免疫等作用逐漸引起人們的關(guān)注[3-4]。羽扇豆醇是一種來(lái)源于羽扇豆、蒲公英等草本植物中的五環(huán)三萜類化合物，相對(duì)分子質(zhì)量為426.72，分子式為C30H50O，具有抗炎、抗氧化、抗感染和調(diào)節(jié)免疫力等作用，提示其具有不同的藥理活性及多種作用機(jī)制[5-6]。在抗腫瘤研究中，羽扇豆醇對(duì)多種腫瘤具有良好的治療效果[7-8]，并且具有保護(hù)心臟、肝臟、神經(jīng)等作用[9-10]，但羽扇豆醇抗結(jié)直腸癌的作用機(jī)制尚未闡明。本文進(jìn)一步研究羽扇豆醇對(duì)結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，通過(guò)TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析明確羽扇豆醇抑制結(jié)直腸癌增殖和轉(zhuǎn)移的潛在分子機(jī)制，推動(dòng)中醫(yī)藥抗腫瘤研究的發(fā)展，并為結(jié)直腸癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 羽扇豆醇(南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司)；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國(guó)HyClone公司)；Matrigel基質(zhì)膠(美國(guó)Corning公司)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(凱基生物科技發(fā)展有限公司)；缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α、α-烯醇化酶(ENO1)、乳酸脫氫酶A(LDHA)、β-actin抗體(美國(guó)Bioworld Technology公司)；CO2培養(yǎng)箱和生物安全柜(美國(guó)Thermo公司)；Bio-Tek酶標(biāo)儀ELX-800(美國(guó)Biotech公司)；倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；ImageQuant LAS 500生物分子成像儀(美國(guó)GE公司)；750D照相機(jī)(日本Canon公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與藥物配制 人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞、人結(jié)腸癌上皮FHC細(xì)胞、人腹膜間皮HMrSV5細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生物科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%鏈霉素(100 μg/mL)和青霉素(100 U/mL)的 RPMI1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。使用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于試驗(yàn)。羽扇豆醇使用無(wú)水乙醇和二甲亞砜(DMSO)(1∶1)混合液充分溶解，配制成 23 434.71 μmol/L的貯存液，置于-20 ℃分裝保存。采用RPMI1640完全培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)的工作濃度。

1.3方法

1.3.1CCK-8法 以細(xì)胞濃度5×103個(gè)/孔接種至96孔板，設(shè)空白對(duì)照組(不加細(xì)胞)，陰性對(duì)照組(不加藥物，即0 μmol/L羽扇豆醇組)、溶劑組(DMSO+無(wú)水乙醇)、羽扇豆醇組(藥物濃度分別為10、20、40、80、160 μmol/L)，每組各5個(gè)復(fù)孔，分別于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24、48、72 h。吸棄舊培養(yǎng)基，每孔加入新鮮培養(yǎng)基100 μL和CCK-8試劑10 μL，于37 ℃孵育3 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處各孔吸光度值(A值)，并計(jì)算抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50)。抑制率=(A陰性對(duì)照組-A羽扇豆醇組)/(A陰性對(duì)照組-A空白對(duì)照組)×100%。

1.3.2克隆形成試驗(yàn) 將細(xì)胞按8×102個(gè)/孔接種于12孔板中，細(xì)胞貼壁后，按羽扇豆醇終濃度為0、20、40、60 μmol/L分為0、20、40、60 μmol/L羽扇豆醇組(簡(jiǎn)稱0、20、40、60 μmol/L組)4組，每組設(shè)置 3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)7 d后，棄去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗2次，95%乙醇固定10 min，風(fēng)干后用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，蒸餾水沖洗3次，風(fēng)干后拍照，計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)量。

1.3.3劃痕愈合試驗(yàn) 細(xì)胞于12孔版中培養(yǎng)，待融合率達(dá)到90%以上時(shí)，用槍頭垂直劃痕，PBS洗去劃下的細(xì)胞，分別加入終濃度為0、20、40、60 μmol/L羽扇豆醇的無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在0、24、48 h于倒置顯微鏡拍攝細(xì)胞劃痕愈合情況，并使用Image J軟件計(jì)算細(xì)胞間距離均值。遷移率=(1-測(cè)量的寬度/0 h的平均測(cè)量寬度)×100%。

1.3.4Transwell試驗(yàn) 用預(yù)冷的無(wú)血清培養(yǎng)基以1∶3的體積比稀釋Matrigel基質(zhì)膠，取40 μL加入預(yù)冷的Transwell小室中，37 ℃孵育2 h，使Matrigel基質(zhì)膠凝固。吸走小室中多余的液體，并在上室、下室分別加入100、600 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，37 ℃平衡過(guò)夜。計(jì)數(shù)1×105個(gè)細(xì)胞，用100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，加入Transwell小室上室，分別將終濃度為0、20、40、60 μmol/L羽扇豆醇加載到細(xì)胞懸液中。在下室加入600 μL完全培養(yǎng)基。在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h后，取出小室，用棉簽擦去上室的細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察小室中的細(xì)胞并拍照，計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞的總數(shù)。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù) 以2×105個(gè)/孔細(xì)胞濃度接種于6孔板中，終濃度0、20、40、60 μmol/L羽扇豆醇干預(yù)細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞，按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.4TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)及生物信息學(xué)分析

1.4.1細(xì)胞處理 以2×105個(gè)/孔細(xì)胞濃度接種于6孔板中，并分為陰性對(duì)照組(不加藥物)和羽扇豆醇組(加入48 μmol/L羽扇豆醇)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h后收集細(xì)胞，收獲細(xì)胞沉淀并于-80 ℃保存。

1.4.2數(shù)據(jù)檢索和差異蛋白篩選 上述標(biāo)本送廣州輝駿生物科技股份有限公司進(jìn)行TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)，并篩選出差異蛋白，篩選條件設(shè)置為：(1)至少 2 次重復(fù)鑒定到的蛋白；(2)肽段數(shù)≥2；(3)選擇重復(fù)性好的蛋白，即CV<0.5 %；(4)P<0.05；(5)計(jì)算各組數(shù)據(jù)比值的均值(AVG)，以AVG≥1.200為上調(diào)蛋白，AVG≤0.833為下調(diào)蛋白。

1.4.3Gene Ontology(GO)功能富集及KEGG信號(hào)通路注釋分析 通過(guò)R軟件，從GO、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取每個(gè)差異蛋白所對(duì)應(yīng)的功能，設(shè)置篩選條件為P<0.05，并計(jì)算每種功能上的蛋白富集數(shù)，最后將排名前20的GO分析結(jié)果和 KEGG 通路繪制成氣泡圖。

1.4.4蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)分析 應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cn.string-db.org/)將蛋白與庫(kù)中的相應(yīng)物種蛋白進(jìn)行比對(duì)，并提取蛋白序列，進(jìn)行PPI分析。

1.5蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 細(xì)胞接種于6孔板中，以終濃度0、20、40、60 μmol/L羽扇豆醇干預(yù)細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞，加入裂解液冰上裂解30 min，12 000×g，4 ℃離心20 min，取上清液，BCA法蛋白定量。95 ℃變性5 min，每組取40 μg總蛋白樣本于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，用聚偏乙烯(PVDF)膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉對(duì)膜封閉1 h，加入稀釋比為1∶1 000的一抗和稀釋比為1∶5 000的內(nèi)參后，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST清洗PVDF膜2次，每次15 min，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗在室溫下孵育2 h，TBST清洗PVDF膜2次后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，通過(guò)ImageQuant LAS 500生物分子成像儀曝光顯色。

2 結(jié) 果

2.1羽扇豆醇對(duì)結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞生物學(xué)功能的影響

2.1.1羽扇豆醇抑制HCT116細(xì)胞的增殖 分別使用終濃度為0、10、20、40、80、160 μmol/L的羽扇豆醇作用HCT116細(xì)胞24、48、72 h，如圖1A所示，不同濃度的羽扇豆醇對(duì)HCT116細(xì)胞有不同程度的增殖抑制作用，并呈明顯的時(shí)間-劑量依賴性。另外，羽扇豆醇作用HCT116細(xì)胞24、48、72 h后的IC50分別為(60.71±4.11)、(48.4±2.26)和(40.79±2.97)μmol/L，IC50隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1B。圖1C顯示，分別經(jīng)溶劑和不同濃度的羽扇豆醇干預(yù)48 h后，人正常結(jié)腸上皮FHC細(xì)胞及人腹膜間皮HMrSV5細(xì)胞的存活率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：A為羽扇豆醇對(duì)HCT116細(xì)胞的抑制率；B為羽扇豆醇作用HCT116細(xì)胞24、48、72 h后的IC50比較；C為羽扇豆醇對(duì)FHC、HMrSV5細(xì)胞的存活率。與24 h比較，*P<0.05；與48 h比較，#P<0.05。

2.1.2羽扇豆醇抑制HCT116細(xì)胞的克隆形成能力 與0 μmol/L組比較，20 μmol/L組對(duì)HCT116細(xì)胞的克隆形成能力影響不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而40 μmol/L組及60 μmol/L組可明顯抑制細(xì)胞克隆形成能力，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且HCT116細(xì)胞的克隆形成數(shù)量隨著羽扇豆醇濃度升高呈減少趨勢(shì)。見圖2。

注：與0 μmol/L組比較，*P<0.05；與20 μmol/L組比較，△P<0.05；與40 μmol/L組比較，▲P<0.05。

2.1.3羽扇豆醇抑制HCT116細(xì)胞的遷移能力 經(jīng)40 μmol/L羽扇豆醇干預(yù)48 h后，HCT116細(xì)胞的遷移率為(50.83±5.55)%，明顯低于0 μmol/L組的(81.51±2.69)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著羽扇豆醇濃度增加，HCT116細(xì)胞遷移率進(jìn)一步下降，在羽扇豆醇濃度為60 μmol/L時(shí)，HCT116細(xì)胞的遷移率僅為(32.62±5.30)%，明顯低于0 μmol/L組、20 μmol/L組和40 μmol/L組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

注：與0 μmol/L組比較，*P<0.05；與20 μmol/L組比較，△P<0.05；與40 μmol/L組比較，◆P<0.05。

2.1.4羽扇豆醇抑制HCT116細(xì)胞的侵襲能力 Transwell試驗(yàn)結(jié)果顯示，與0 μmol/L組比較，20 μmol/L羽扇豆醇作用HCT116細(xì)胞后，細(xì)胞侵襲能力無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而經(jīng)40 μmol/L及60 μmol/L的羽扇豆醇干預(yù)后，細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注：與0 μmol/L組比較，*P<0.05；與20 μmol/L組比較，△P<0.05；與40 μmol/L組比較，▲P<0.05。

2.1.5羽扇豆醇誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞發(fā)生凋亡 20 μmol/L與40 μmol/L的羽扇豆醇干預(yù)HCT116細(xì)胞48 h后無(wú)明顯細(xì)胞凋亡發(fā)生，而60 μmol/L的羽扇豆醇可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中早期凋亡率為(7.33±0.35)%，晚期凋亡率為(7.33±1.44)%，與0 μmol/L組比較明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但早期、晚期凋亡率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

注：A為早期凋亡率;B為晚期凋亡率；與0 μmol/L組比較，*P<0.05；與20 μmol/L組比較，△P<0.05；與40 μmol/L組比較，▲P<0.05。

2.2羽扇豆醇對(duì)結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)及生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.2.1差異表達(dá)蛋白分析 共490種表達(dá)差異明顯的蛋白質(zhì)在0 μmol/L組與其他濃度羽扇豆醇組比較中被發(fā)現(xiàn)，其中表達(dá)上調(diào)蛋白269種，表達(dá)下調(diào)蛋白221種。進(jìn)一步對(duì)蛋白集合的定量信息進(jìn)行歸一化處理，即歸一化至-1,1；同時(shí)使用Complexheatmap R包(Version 3.4)對(duì)樣品和蛋白表達(dá)量2個(gè)維度進(jìn)行分類，并生成層次聚類熱圖，見圖6A。熱圖中列舉了差異明顯的前50種蛋白表達(dá)情況，蛋白上調(diào)程度越高，顏色越紅；蛋白下調(diào)程度越低，顏色越綠，黑色代表中間表達(dá)的蛋白。圖6B火山圖中每個(gè)點(diǎn)代表一種蛋白，黑色是表達(dá)在陰性對(duì)照組與羽扇豆醇組中無(wú)差異的蛋白，藍(lán)色點(diǎn)代表下調(diào)的蛋白，紅色點(diǎn)則代表上調(diào)的蛋白。

注：A為羽扇豆醇差異蛋白表達(dá)量聚類熱圖；B為羽扇豆醇差異蛋白數(shù)目的火山圖。

2.2.2差異蛋白的GO功能富集分析 利用GO功能富集分析，將上述490種差異蛋白富集在生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能3個(gè)層面上的二級(jí)條目及其蛋白數(shù)目。在生物學(xué)過(guò)程中，差異蛋白主要富集在L-丙氨酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、p53信號(hào)通路、紡錘體中區(qū)組裝、LSU-rRNA的成熟、二磷酸腺苷代謝過(guò)程等生物學(xué)過(guò)程中。在細(xì)胞組分中，差異蛋白主要富集在核仁腔、血小板α顆粒腔、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔等細(xì)胞部位。在分子功能中，差異蛋白主要富集在L-丙氨酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活性、運(yùn)貨受體活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑活性、L-抗壞血酸結(jié)合等活性分子功能上。

2.2.3差異蛋白的KEGG信號(hào)通路注釋分析 差異蛋白進(jìn)行KEGG信號(hào)通路注釋分析后發(fā)現(xiàn)，差異蛋白主要富集在糖酵解/糖異生、HIF-1信號(hào)通路、病毒蛋白與細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體的相互作用、淀粉和蔗糖代謝途徑等信號(hào)通路上。見圖7。

圖7 KEGG信號(hào)通路注釋分析氣泡圖

2.2.4差異蛋白PPI分析 為進(jìn)一步探索差異蛋白之間的相互作用，本研究應(yīng)用 STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)490種差異蛋白進(jìn)行分析，并構(gòu)建PPI，其中關(guān)聯(lián)度前10的蛋白分別為L(zhǎng)DLR、APP、AURKB、ENO1、CALCOCO2、CCNB1、CDC20、CDCA8、LDHA、ECT2，這些蛋白與其他蛋白存在較為緊密的相互作用關(guān)系(圖8)。另外，參與糖酵解途徑的關(guān)鍵酶ENO1和LDHA位于上述差異蛋白的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)上。

圖8 差異蛋白PPI分析結(jié)果

2.3羽扇豆醇對(duì)糖酵解途徑相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 經(jīng)不同濃度的羽扇豆醇干預(yù)HCT116細(xì)胞48 h后，細(xì)胞中HIF-1α、ENO1和LDHA蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)明顯改變，隨著羽扇豆醇干預(yù)濃度增高，HIF-1α、ENO1、LDHA蛋白表達(dá)水平均呈不同程度減少(圖9)。

注:A為各組HCT116細(xì)胞的HIF-1α、ENO1、LDHA蛋白表達(dá)情況；B為各組HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)水平；C為各組ENO1蛋白相對(duì)表達(dá)水平；D為各組LDHA蛋白相對(duì)表達(dá)水平。與0 μmol/L組比較，*P<0.05；與20 μmol/L組比較，△P<0.05；與40 μmol/L組比較，▲P<0.05。

3 討 論

隨著中藥扶正祛邪的機(jī)制及促進(jìn)人體免疫力的研究進(jìn)展，中藥在癌癥預(yù)防、早期治療，甚至是在癌癥中晚期的應(yīng)用方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[11-12]。據(jù)報(bào)道，羽扇豆醇對(duì)前列腺癌、肺癌、膀胱癌等惡性腫瘤具有良好的治療效果，其機(jī)制涉及MAPK/ERK、PI3K/AKT/mTOR等多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的改變[13-14]。值得注意的是，與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物不同，羽扇豆醇已被證實(shí)對(duì)正常細(xì)胞、組織、小鼠無(wú)毒，并且具有有效的治療劑量[9-10]。本研究結(jié)果顯示，羽扇豆醇能明顯抑制HCT116細(xì)胞的增殖，且呈時(shí)間-劑量依賴性，但對(duì)人正常結(jié)腸上皮FHC細(xì)胞及人腹膜間皮HMrSV5細(xì)胞無(wú)抑制作用。進(jìn)一步的細(xì)胞功能試驗(yàn)提示，羽扇豆醇可明顯抑制HCT116細(xì)胞的克隆形成、遷移和侵襲能力，同時(shí)能有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，由此提示羽扇豆醇在治療結(jié)直腸癌方面具有一定的臨床價(jià)值。

本研究進(jìn)一步通過(guò)TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)及生物信息學(xué)分析探討其潛在的分子機(jī)制。經(jīng)TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，共篩選出490種有明顯差異表達(dá)的蛋白，其中表達(dá)上調(diào)蛋白269種，表達(dá)下調(diào)蛋白221種。GO功能富集分析提示，差異蛋白主要參與了細(xì)胞分裂、增殖、凋亡及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝等生物學(xué)過(guò)程，以上過(guò)程與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。通過(guò)KEGG信號(hào)通路注釋分析發(fā)現(xiàn)，羽扇豆醇的抑癌作用可能與糖酵解/糖異生、HIF-1信號(hào)通路、淀粉和蔗糖代謝途徑等信號(hào)通路相關(guān)。有氧糖酵解途徑是腫瘤細(xì)胞特征性的代謝方式，腫瘤細(xì)胞通過(guò)增強(qiáng)糖酵解活性和產(chǎn)生大量乳酸及快速生成三磷酸腺苷(ATP)，促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移[15]。本研究構(gòu)建PPI分析發(fā)現(xiàn)，糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶ENO1和LDHA均位于差異蛋白的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)上。因此，本研究推測(cè)羽扇豆醇的抗結(jié)直腸癌作用可能與抑制細(xì)胞糖酵解通路有關(guān)。

ENO1屬于一種烯醇化酶，在糖酵解過(guò)程中催化2-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇丙酮酸，在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平升高，是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶之一[16]。ENO1可通過(guò)糖酵解途徑向腫瘤細(xì)胞提供代謝所需要的ATP，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有抑制凋亡和促進(jìn)增殖的作用[17-18]，但在正常細(xì)胞中無(wú)此作用，其原因可能是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞處于缺氧微環(huán)境，重新調(diào)節(jié)了糖酵解途徑，最終使糖酵解酶增加，而正常細(xì)胞則無(wú)此現(xiàn)象[19]。另外，ENO1可激活糖酵解途徑，改善腫瘤細(xì)胞對(duì)低氧的能量失衡，誘導(dǎo)腫瘤新生血管形成，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和體外轉(zhuǎn)移[20]。LDHA也是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，處于糖酵解反應(yīng)的終末端，在多種癌癥中呈過(guò)表達(dá)，可作為一種生物標(biāo)志物，與預(yù)后不良相關(guān)[21]。LDHA能將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，降低細(xì)胞對(duì)氧氣的依賴性，為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖提供能量，并且可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[22]。

HIF-1α是一種氧敏感轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)對(duì)缺氧的適應(yīng)性代謝反應(yīng)，在大多數(shù)腫瘤組織、細(xì)胞中可誘導(dǎo)糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)，通過(guò)改變能量代謝、促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管生成和血管重塑等方式提高細(xì)胞在缺氧環(huán)境中的適應(yīng)性，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，與患者預(yù)后不良及腫瘤耐藥密切相關(guān)[23]。據(jù)報(bào)道，ENO1與LDHA均是HIF-1α的下游信號(hào)分子，在糖酵解過(guò)程中，HIF-1α可通過(guò)與ENO1和LDHA啟動(dòng)子中的低氧反應(yīng)原件結(jié)合，調(diào)節(jié)ENO1和LDHA表達(dá)和靶基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)，同時(shí)隨著乳酸生成和葡萄糖利用增加，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[24-25]。因此，HIF-1α與ENO1、LDHA的表達(dá)均呈正相關(guān)，并且均能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本研究中，羽扇豆醇作用于結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞后，HIF-1α、ENO1和LDHA蛋白表達(dá)水平均明顯降低，提示羽扇豆醇可抑制HIF-1α表達(dá)，進(jìn)一步下調(diào)其下游靶標(biāo)ENO1和LDHA蛋白表達(dá)水平，減少乳酸及ATP產(chǎn)生，最終抑制糖酵解途徑，導(dǎo)致HCT116細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移能力受限，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。上述分子功能和潛在相關(guān)通路與生物信息學(xué)分析綜合結(jié)果趨勢(shì)一致。

綜上所述，羽扇豆醇可明顯抑制HCT-116細(xì)胞增殖、克隆、遷移、侵襲的能力，同時(shí)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與下調(diào)糖酵解信號(hào)通路中HIF-1α、LDHA和ENO1蛋白的表達(dá)水平有關(guān)。