張鵬，任茜，孟思宇，魏小星，鮑根生

（青海省青藏高原優(yōu)質(zhì)牧草種質(zhì)資源利用重點實驗室，青海大學畜牧獸醫(yī)科學院，青海西寧 810016）

土壤鹽漬化通過干擾植物光合作用，抑制植物呼吸作用，降低蛋白質(zhì)含量、水分虧缺、膜損傷等途徑來抑制植物生長，甚至造成植物死亡，已成為一個亟須解決的全球性問題［1-2］。截至目前，全球共計有8.31×108hm2土地受到鹽漬化威脅［3］；其中，我國鹽漬土壤總面積約為3.6×107hm2，約占全國可用土地面積的4.88%［4］，且大多分布在甘肅、新疆、青海等西北干旱地區(qū)。青海省鹽漬化土地面積約2.92×106hm2，主要分布于柴達木盆地、共和盆地和東部農(nóng)業(yè)區(qū)［5］，成為制約青藏高原地區(qū)生態(tài)修復和綠色生態(tài)農(nóng)牧業(yè)發(fā)展的瓶頸問題之一。鹽漬化土壤改良措施主要有水利改良措施、工程措施與農(nóng)業(yè)措施相結(jié)合、施用土壤改良劑、生物改良等［6］，采用水利改良措施、工程措施與農(nóng)業(yè)措施相結(jié)合體現(xiàn)出費工費時費力，具有明顯的局限性；施用土壤改良劑雖治理效果明顯，但化學藥劑殘留易引起土壤污染。近年來，利用耐鹽植物對鹽漬化土壤進行生態(tài)恢復成為鹽堿化土壤治理行之有效的方法。同時，許多研究發(fā)現(xiàn)除耐鹽植物自身耐鹽特性外，微生物與耐鹽植物共生能顯著提高宿主對鹽堿脅迫的耐受能力。例如：鹽脅迫條件下菌根真菌可通過改善寄主植物營養(yǎng)水平、提高植物組織中的K+/Na+以及通過積累如脯氨酸、甘氨酸、甜菜堿和可溶性糖等途徑［7］，提高宿主植物的耐鹽性。同時，研究發(fā)現(xiàn)煙草（Nicotiana tabacum）、苜蓿（Medicago sativa）、墨西哥鼠尾草（Salvia leucantha）等植物接種印度梨形孢（Piriformospora indica）能增強其耐鹽能力［8-10］。另外，徐亞軍等［11］研究表明，與對照相比，接種死谷芽孢桿菌（Bacillus vallismortis）的小麥（Triticum aestivum）幼苗耐鹽能力顯著增加。由此可見，共生微生物在提高植物耐鹽能力方面發(fā)揮重要作用。

禾草內(nèi)生真菌（Epichlo?）是指存在于植株地上部分，在植物體內(nèi)完成絕大部分生活周期，但不導致宿主產(chǎn)生外部病害癥狀的一類真菌［12］。經(jīng)過長期適應(yīng)性進化，內(nèi)生真菌與冷季型禾草形成互惠互利的共生體，禾草為內(nèi)生真菌提供生長場所、繁殖載體（種子）及生長所需營養(yǎng)物質(zhì)［13］；作為回報，內(nèi)生真菌通過產(chǎn)生次生代謝物（生物堿）和調(diào)控禾草生理生化及代謝途徑增強禾草抗蟲［14］、抗?。?5］、抗旱［16］、耐寒［17］及耐鹽堿［18］等生物或非生物逆境的耐受能力。近期研究發(fā)現(xiàn)：禾草內(nèi)生真菌通過促進植物營養(yǎng)元素吸收、保持離子平衡［19］，提高植物滲透調(diào)節(jié)能力［20］、增強禾草光合作用和水分利用效率［21］、分泌次生代謝物［22］、誘導相關(guān)耐鹽基因表達［23］等途徑提高禾草對鹽脅迫的耐受能力。鹽脅迫作為植物生長發(fā)育階段所面臨的最普遍的非生物逆境之一，有關(guān)內(nèi)生真菌如何提高禾草苗期及生長期鹽脅迫耐受能力的作用機理已基本明晰［24］。種子萌發(fā)和幼苗定植是植物生命周期中最重要且對外部環(huán)境最敏感的時期［25］，這一階段經(jīng)歷鹽脅迫會對植物幼苗生長和定植產(chǎn)生致命傷害。內(nèi)生真菌在禾草種子萌發(fā)階段能侵染芽原基、葉原基等組織，從而影響非生物脅迫逆境下禾草種子萌發(fā)進程［26］。然而，有關(guān)內(nèi)生真菌影響鹽脅迫逆境下禾草種子萌發(fā)研究較少，僅聚焦于氯化鈉、硫酸鈉等單鹽對帶菌和不帶菌禾草種子萌發(fā)影響，而有關(guān)多種單鹽及復合鹽對帶菌和不帶菌禾草種子萌發(fā)影響的研究鮮有報道。

紫花針茅（Stipa purpurea）是青海湖流域高寒草原最重要的多年生禾草［27］，其莖葉柔軟，適口性好，耐牧性強。據(jù)調(diào)查，青海湖流域土壤鹽漬化現(xiàn)象比較嚴重，次生鹽漬化現(xiàn)象也在不斷加劇［28］。調(diào)查研究結(jié)果表明，青海高原紫花針茅的內(nèi)生真菌侵染率為70%～100%［29］，基于此，本研究以青海湖流域紫花針茅帶菌（E+）和不帶菌（E-）種子為研究對象，主要解決以下問題：1）隨著鹽濃度增加紫花針茅種子萌發(fā)和幼苗生長是否受到抑制？2）單鹽或復合鹽對紫花針茅種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制作用是否存在差異？3）內(nèi)生真菌能否提高鹽脅迫逆境下紫花針茅種子發(fā)芽和幼苗生長？旨在嘗試利用內(nèi)生真菌-紫花針茅共生體開展高寒區(qū)鹽堿草地生態(tài)修復和改良方面的研究，為利用共生微生物實現(xiàn)耐鹽堿種質(zhì)資源創(chuàng)新利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫花針茅種子采集：2019年10月，在青海省海北州海晏縣甘子河鎮(zhèn)天然草地（37°07′09″N，100°38′42″E），采收紫花針茅成熟種子。采收地海拔3370 m，屬典型高寒草原，草地建群種為紫花針茅，伴生種為冰草（Agropyron cristatum）和草地早熟禾（Poa pratensis）。為保證采集樣品能真實反映樣地紫花針茅種群分布特征和個體水平多樣性，采收400株紫花針茅整株（地上部分），每株間隔25 m左右。采集樣品置于4 °C冰箱內(nèi)，以備后用。

內(nèi)生真菌分離鑒定：根據(jù)李春杰等［30］禾草內(nèi)生真菌檢測方法，檢測紫花針茅帶菌率，發(fā)現(xiàn)紫花針茅內(nèi)生真菌帶菌率高達90%以上。同時，挑選20粒帶菌紫花針茅種子進行種皮消毒，然后擺放在馬鈴薯（Solanum tuberosum）葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，室溫黑暗條件下培養(yǎng)28 d，種子表面出現(xiàn)內(nèi)生真菌菌絲后進行純培養(yǎng)。參照鮑根生等［31］紫花針茅內(nèi)生真菌鑒定方法，利用tub、tef和actin特異性引物擴增內(nèi)生真菌序列并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，將采集地紫花針茅感染的內(nèi)生真菌鑒定為Epichlo?inebrians。

E-種子獲?。翰糠諩+種子用有效成分10%的甲基托布津浸泡6 h［32］，對照組采用蒸餾水浸泡E+種子6 h。將E+、E-種子（甲基托布津浸泡處理）播種于裝有滅菌細沙和土壤的250 mL花盆內(nèi)，細沙與土壤比例為2:1。2020年5月，將E+和E-紫花針茅幼苗移栽至青海省海北藏族自治州西海鎮(zhèn)多年生牧草試驗站（36°49′29″N，101°45′26″E）。9月中旬，紫花針茅種子成熟期按單株收獲方法分別采收E+和E-種子，隨機挑選10株紫花針茅E+、E-種子50粒進行內(nèi)生真菌侵染率檢測。具體方法為：1%次氯酸鈉浸泡種子過夜，種皮軟化后用苯胺藍染液染色，20×光學顯微鏡下檢查種皮、糊粉層內(nèi)是否出現(xiàn)藍色光滑菌絲。檢測結(jié)果表明紫花針茅E+、E-種子帶菌率分別為100%、4%。

1.2 試驗方法

1.2.1鹽脅迫處理 選取籽粒飽滿、無病蟲害的紫花針茅E+、E-種子各5000粒，供試種子先用70%乙醇消毒1 min，然后用1%次氯酸鈉消毒5 min，最后用蒸餾水沖洗數(shù)次后晾干。2021年6月，采用不同濃度的NaCl、Na2SO4、Na2CO3、NaHCO3單鹽溶液及NaCl/Na2CO3混合鹽溶液（NaCl和Na2CO3的比例按1:1進行配制）對紫花針茅E+、E-種子進行鹽脅迫處理；由于青海湖流域土壤以重碳酸鹽類鈣型（HCO3-Ca）分布最為廣泛［33］，柴達木盆地鹽堿化土壤主要以HCO3-、Cl-為主［34］，且CO32-在溶液中會水解為HCO3-，因此選用NaCl/Na2CO3混合鹽溶液。依據(jù)王正鳳［35］在鹽脅迫條件下E+、E-野大麥（Hordeum brevisubulatum）種子萌發(fā)特性研究結(jié)果，本研究單鹽和復合鹽設(shè)定低鹽（100 mmol·L-1）和高鹽（400 mmol·L-1）2個水平，添加同體積蒸餾水處理為對照。50粒消毒處理的紫花針茅E+或E-種子擺放于直徑9 cm、鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)。同時，分別向每皿內(nèi)添加不同類型鹽溶液或蒸餾水3 mL，并記錄每皿初始重量。每隔48 h，更換濾紙并補足鹽溶液或蒸餾水至初始重量。依據(jù)試驗設(shè)計：帶菌狀態(tài)（E+、E-）、3個鹽濃度（0，100，400 mmol·L-1）、5種鹽溶液（4種單鹽和1種復鹽）和各處理5個重復，共計150皿。將供試培養(yǎng)皿置于25 °C的培養(yǎng)箱（RTOP，杭州拓普儀器有限公司）內(nèi)進行培養(yǎng)，光照和黑暗交替時間分別為8和16 h，每隔4 h觀察并記錄每皿種子發(fā)芽數(shù)量，胚根突破種皮2 mm視為發(fā)芽種子。連續(xù)觀察直至3 d內(nèi)未出現(xiàn)發(fā)芽種子視為發(fā)芽結(jié)束，統(tǒng)計種子發(fā)芽率。同時，每皿隨機挑選10株幼苗測量幼苗高度和胚根長度。

1.2.2測定指標 發(fā)芽率（germination rate，GR，%）=（n/N）×100（n為發(fā)芽結(jié)束后發(fā)芽種子數(shù)量，N為供試種子數(shù)）［36］；

發(fā)芽指數(shù)（germination index，GI）=∑(Gt/Dt)(Gt為第t天的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù))[37]；

發(fā)芽勢（germination power，GP）=種子發(fā)芽達高峰時的發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)［37］；

相對鹽害率（relative salt damage rate，RSD，%）=（對照發(fā)芽率-處理發(fā)芽率）/對照發(fā)芽率×100［38］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用一般線性模型分析內(nèi)生真菌、鹽濃度和鹽類型對紫花針茅種子萌發(fā)（發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢）和幼苗生長特性（幼苗高度和胚根長度）及相對鹽害率的影響；其中，鹽濃度、鹽類型、帶菌狀態(tài)為固定因子，種子萌發(fā)和幼苗生長特性及相對鹽害率為響應(yīng)變量，綜合分析鹽濃度、鹽類型及帶菌狀態(tài)對響應(yīng)變量的影響，檢測固定因子是否對響應(yīng)變量存在交互作用。若鹽濃度、鹽類型、帶菌狀態(tài)對種子萌發(fā)和幼苗生長特性及相對鹽害率存在顯著影響，采用單因素方差分析鹽濃度對種子萌發(fā)和幼苗生長特性及相對鹽害率的影響；同時，采用獨立樣本T檢驗檢測相同鹽類型、同一濃度下E+、E-紫花針茅種子發(fā)芽、幼苗生長和相對鹽害率之間的差異。為滿足方差齊性要求，發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)數(shù)據(jù)采用對數(shù)轉(zhuǎn)化，幼苗高度和胚根長度采用反正弦轉(zhuǎn)化。所有數(shù)據(jù)均用平均值±標準差表示，采用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌對鹽脅迫紫花針茅種子萌發(fā)特性的影響

帶菌狀態(tài)、鹽類型和鹽濃度對紫花針茅種子萌發(fā)特性存在極顯著影響（P＜0.01，表1）；其中，帶菌狀態(tài)與鹽濃度、帶菌狀態(tài)與鹽類型對發(fā)芽指數(shù)存在顯著交互作用，帶菌狀態(tài)、鹽濃度和鹽類型對種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)存在顯著三者交互作用（P＜0.05，表1）。隨鹽濃度增加，紫花針茅種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)快速降低，400 mmol·L-1鹽濃度下，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)最低（圖1～3）。內(nèi)生真菌侵染顯著影響紫花針茅在不同鹽濃度下種子發(fā)芽率，低鹽或高鹽濃度下，E+種子發(fā)芽率顯著高于E-種子；而無鹽條件下，E+、E-種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)差異不顯著（圖1～3）。不同鹽類型對紫花針茅種子萌發(fā)抑制作用存在顯著差異（表1）；其中，NaCl對種子萌發(fā)抑制作用最弱（圖1a、2a、3a），Na2SO4對種子萌發(fā)抑制作用最強（圖1b、2b、3b）。

表1 內(nèi)生真菌侵染、鹽類型和鹽濃度對紫花針茅種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)影響的三因素方差分析Table 1 Results of three-way ANOVA for endophyte infection status（E），salt type（ST）and salt concentration（SC）on seed germination rate，germination power，germination index of S.purpurea

2.2 內(nèi)生真菌對鹽脅迫紫花針茅幼苗生長特性的影響

與紫花針茅種子萌發(fā)特性結(jié)果相似，鹽類型、內(nèi)生真菌侵染狀態(tài)、鹽濃度對紫花針茅幼苗高度和胚根長度存在極顯著影響（表2，P＜0.01）。其中，帶菌狀態(tài)與鹽濃度、鹽類型與鹽濃度對幼苗高度和胚根長度存在顯著交互作用，同時，帶菌狀態(tài)、鹽濃度和鹽類型對胚根長度存在極顯著三者交互作用（表2，P＜0.01）。隨鹽濃度增加，紫花針茅幼苗高度和胚根長度快速降低，400 mmol·L-1鹽濃度下，幼苗高度最低，胚根最短（圖4和圖5）。內(nèi)生真菌侵染顯著影響紫花針茅幼苗和胚根生長（表2，圖4和圖5），其中，同一類型鹽溶液在相同濃度下E+植株幼苗高度和胚根長度顯著高于E-植株（圖4和圖5，P＜0.05）；同時，對照組內(nèi)E+植株幼苗高度也顯著高于E-植株（圖5，P＜0.05）。不同鹽類型對紫花針茅幼苗高度和胚根長度抑制作用存在顯著差異（表2）；其中，NaCl對幼苗高度和胚根長度抑制作用最弱（圖4a和圖5a），Na2CO3對幼苗高度和胚根長度抑制作用最強（圖4d和5d）。

2.3 內(nèi)生真菌對紫花針茅種子萌發(fā)相對鹽害率的影響

內(nèi)生真菌侵染、鹽類型、鹽濃度能極顯著影響紫花針茅種子萌發(fā)相對鹽害率（表2，P＜0.01）；其中，內(nèi)生真菌侵染、鹽類型、鹽濃度對紫花針茅種子萌發(fā)相對鹽害率存在極顯著交互作用（表2，P＜0.01）。隨鹽濃度增加，紫花針茅種子萌發(fā)相對鹽害率持續(xù)增加，400 mmol·L-1鹽濃度下，種子萌發(fā)相對鹽害率最高；對照組種子萌發(fā)相對鹽害率為0（圖6）。同時，內(nèi)生真菌侵染能顯著緩解紫花針茅種子萌發(fā)相對鹽害率，表現(xiàn)出E-種子萌發(fā)相對鹽害率顯著高于E+種子（圖6）。另外，不同類型鹽溶液對紫花針茅種子萌發(fā)相對鹽害率存在顯著差異（表2），其中，Na2CO3和Na2SO4種子萌發(fā)相對鹽害率較高而NaCl最低（圖6）。

表2 內(nèi)生真菌侵染、鹽類型和鹽濃度對紫花針茅幼苗生長（幼苗高度和胚根長度）特性及相對鹽害率影響的三因素方差分析Table 2 Results of three-way ANOVA for endophyte infection status（E），salt type（ST）and salt concentration（SC）on relative salt damage rate，seedling height and radicle length of S.purpurea

3 討論

種子萌發(fā)和幼苗定植階段是植物種群形成、擴張和持續(xù)更新的關(guān)鍵時期，也是植物對外界生物和非生物逆境響應(yīng)的最敏感時期。Dissanayaka等［39］研究發(fā)現(xiàn)，植物是否能正常生長通常取決于種子萌發(fā)和成苗這兩個關(guān)鍵階段。也有研究表明，種子萌發(fā)階段對外界環(huán)境十分敏感，易受環(huán)境因子的影響［40］。鹽脅迫是種子萌發(fā)階段最常見的脅迫因子，種子在鹽脅迫環(huán)境中表現(xiàn)出發(fā)芽率低、發(fā)芽緩慢、發(fā)芽種子后期死亡現(xiàn)象頻發(fā)等特征，尤其對于鹽敏感型植物［41］。本研究發(fā)現(xiàn)，紫花針茅種子在不同鹽種類脅迫環(huán)境中存在種子發(fā)芽率低、發(fā)芽速度慢、幼苗和胚根生長受抑現(xiàn)象，這主要與植物對鹽離子的吸收有關(guān)：一方面，鹽脅迫條件下，植物生理生化過程會遭到破壞，使植物體內(nèi)積累大量鹽離子，致使其滲透勢增高，造成植物缺水［42］；另一方面，細胞受到外界脅迫壓力時，會導致細胞膜透性增大，進而損傷細胞膜的正常生理、代謝功能，對植物產(chǎn)生毒害作用［43］。也有研究發(fā)現(xiàn)，在低鹽濃度的生長環(huán)境中，鹽中的無機離子作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，不僅可縮短種子萌發(fā)時間，提高發(fā)芽率，一定程度上也會促進胚根生長，提高發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、幼苗高度和胚根長度［44］。

不同類型鹽溶液對植物種子萌發(fā)和幼苗生長影響存在明顯差異。邸桂俐等［45］研究表明，隨著鹽濃度的增加，Na2CO3對于鎖鏈稗（Echinochloa crusgalli）種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)以及發(fā)芽勢的抑制作用大于NaHCO3和NaCl。同樣，雷春英等［46］研究發(fā)現(xiàn)鹽分對鹽爪爪（Kalidium foliatum）種子萌發(fā)和幼苗生長的毒害性最大的為Na2CO3、Na2SO4，NaCl毒性最弱。本研究發(fā)現(xiàn)，不同類型鹽對于紫花針茅種子萌發(fā)的抑制性不同，Na2SO4、Na2CO3對種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率抑制作用最大；此外，Na2CO3和Na2SO4相對鹽害率最大，表明這兩種鹽對紫花針茅種子毒害性最強；與之相反，NaCl對紫花針茅種子萌發(fā)相對鹽害率最低，表明NaCl對種子萌發(fā)的危害性最小，這與前人的研究結(jié)果相似［47］。造成這種現(xiàn)象的主要原因為：1）Na2CO3、Na2SO4均為強堿弱酸鹽，堿性強，pH高，造成植物細胞結(jié)構(gòu)與功能被破壞，離子平衡被打破［48］；2）堿性鹽對植物種子萌發(fā)和幼苗生長的毒害作用明顯高于鹽離子引起的毒害作用，造成種子幼苗和根生長時間縮短，甚至無根［45］；3）NaCl在自然界中普遍存在，很多禾草都對其具備一定耐受性。同時，本研究也發(fā)現(xiàn)，Na2SO4對紫花針茅種子抑制作用最強，而NaCl抑制作用最弱。由此可見，不同類型鹽對植物種子萌發(fā)的抑制作用表現(xiàn)出種間差異性，這可能與植物種子遺傳背景、種子成熟環(huán)境及種子萌發(fā)階段土壤鹽類型等因素有關(guān)［49］。另外，NaCl和Na2CO3混合鹽對種子萌發(fā)抑制作用較小，這與盧艷敏等［50］混合鹽脅迫對白三葉（Trifolium repens）種子萌發(fā)的抑制作用低于相應(yīng)濃度Na2CO3脅迫的研究結(jié)果相似。主要原因是Cl-代替了一半CO32-，造成CO32-鹽害作用小。同時，Cl-、CO32-離子間競爭也能緩解了CO32-毒害作用［50］。

青藏高原西部、東部土壤以SO42-鹽為主，Cl-、HCO3-鹽次之，CO32-鹽含量較低［51］。本研究發(fā)現(xiàn)SO42-鹽對于紫花針茅種子萌發(fā)的抑制作用極強，但紫花針茅作為青海湖流域高寒草地主要優(yōu)勢禾草，其原因可能與分蘗是紫花針茅個體增加的主要繁殖方式的繁殖策略有關(guān)［52］；同時，紫花針茅成株耐鹽能力較強，其體內(nèi)耐鹽相關(guān)基因會在高鹽濃度下超表達［53］。綜上所述，紫花針茅采用間歇式種子萌發(fā)策略，尋找種子適宜萌發(fā)最佳土壤環(huán)境，形成更新群體。此外，成株強耐鹽能力也為種群擴張?zhí)峁┍Ｕ?。上述結(jié)論也從側(cè)面支撐紫花針茅成為環(huán)青海湖鹽堿化危害嚴重地區(qū)建群禾草的潛在原因。

眾多研究表明，內(nèi)生真菌能顯著提高鹽脅迫條件下野大麥［54］、醉馬草（Achnatherum inebrians）［55］、中華羊茅（Festuca sinensis）［56］、高羊茅（Festuca arundinacea）［55］、披堿草（Elymus nutans）［57］、黑麥草（Lolium perenne）［58］等冷季型禾草種子萌發(fā)能力。鹽脅迫逆境下，內(nèi)生真菌通過提高抗氧化酶活性、降低丙二醛含量和增加脯氨酸含量等生理途徑來增強禾草種子萌發(fā)能力［59］。另外，內(nèi)生真菌也通過調(diào)節(jié)種子滲透能力、增強種子活性氧清除能力和降低膜脂過氧化傷害等途徑緩解鹽脅迫逆境對禾草種子傷害［59］。本研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌能顯著提高紫花針茅種子萌發(fā)和幼苗生長階段的耐鹽性，這可能與內(nèi)生真菌促進禾草種子細胞滲透能力和增加抗氧化酶的活性，從而保護鹽脅迫環(huán)境下紫花針茅種子細胞膜受損，維持細胞內(nèi)外離子含量平衡，促進種子處于水分充盈環(huán)境，從而保證紫花針茅種子能正常完成種子萌發(fā)［60］。

大量研究表明，E+紫花針茅相對鹽害率低于E-。強Na2CO3和Na2SO4鹽脅迫環(huán)境下，E+種子對鹽害耐受力顯著高于E-，這與其他E+、E-禾草在鹽脅迫下種子萌發(fā)和幼苗生長階段的對比研究結(jié)果一致［61］。同時，鹽脅迫環(huán)境中E+種子表現(xiàn)出萌發(fā)數(shù)量多、萌發(fā)速度快等特征，從而證實內(nèi)生真菌能顯著影響鹽脅迫逆境下種子萌發(fā)進程，增加種子對鹽脅迫環(huán)境的耐受能力［61］。另外，隨著種子萌發(fā)過程結(jié)束，地上葉片持續(xù)伸展，內(nèi)生真菌將在葉部細胞隙間不斷擴張繁殖，表現(xiàn)出宿主生長同步性［62］。眾多研究表明，內(nèi)生真菌在鹽脅迫環(huán)境中能提高禾草苗期光合能力，從而儲備更多碳水化合物供地上組織生長和地下根系發(fā)育，進而表現(xiàn)出幼苗階段E+植株葉片大、分蘗多、莖稈壯等表型特征；與之相反，E-幼苗由于缺少內(nèi)生真菌侵染則在鹽脅迫條件下表現(xiàn)出葉片窄短、分蘗稀疏和莖稈纖細等特征［63］，本研究結(jié)果與其相吻合。

由此可見，內(nèi)生真菌侵染能顯著提高紫花針茅種子萌發(fā)和幼苗定植能力，這一結(jié)果也為紫花針茅成為青海湖流域高寒草原優(yōu)勢禾草提供直接證據(jù)，表明內(nèi)生真菌侵染可能成為紫花針茅適應(yīng)青海湖濱鹽漬化土壤且成為建群物種的主要原因之一。同時，后續(xù)將開展E+、E-幼苗生長階段內(nèi)生真菌是否通過調(diào)控細胞內(nèi)外鹽離子平衡、清除活性氧能力及增加抗氧化物質(zhì)等方面研究，從而揭示內(nèi)生真菌提高紫花針茅耐鹽性的生理生化機理。

4 結(jié)論

隨鹽濃度不斷增加，紫花針茅種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)持續(xù)降低，胚根發(fā)育和幼苗生長受到嚴重抑制。同時，不同鹽類型對紫花針茅種子萌發(fā)和幼苗生長特性表現(xiàn)出差異，Na2CO3和Na2SO4對紫花針茅種子萌發(fā)和幼苗生長相對鹽害率最高。另外，內(nèi)生真菌侵染能顯著提高紫花針茅種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、胚根長度和幼苗高度，表現(xiàn)出E+紫花針茅種子相對鹽害率低于E-；其中，內(nèi)生真菌侵染后紫花針茅對Na2CO3脅迫的耐受能力最強。綜上所述，內(nèi)生真菌侵染是紫花針茅適應(yīng)青海湖流域鹽漬化土壤且成為高寒草原優(yōu)勢禾草的主要原因之一，這將為利用內(nèi)生真菌-紫花針茅共生體進行鹽堿地改良和耐鹽禾草種質(zhì)創(chuàng)新奠定理論基礎(chǔ)。