杜黎黎

摘 要：以玉米優(yōu)良品種自交系魯原92為實(shí)驗(yàn)材料，以玉米幼苗胚葉和胚根為外植體，采用正交實(shí)驗(yàn)，分析了誘導(dǎo)愈傷組織的若干影響因素。結(jié)果表明：2，4-D在誘導(dǎo)愈傷組織中起著關(guān)鍵作用，添加一定濃度的KT對(duì)誘導(dǎo)起著促進(jìn)作用，添加微量的AgNO3明顯促進(jìn)愈傷誘導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：玉米；胚根；胚葉；組織培養(yǎng)；愈傷組織

中圖分類(lèi)號(hào) S513 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2014）16-24-03

組織培養(yǎng)是指在無(wú)菌條件下利用人工培養(yǎng)基對(duì)植物組織進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)，它是遺傳轉(zhuǎn)化、植物改良研究的基本環(huán)節(jié)之一。目前，國(guó)內(nèi)外從事玉米組培主要是從幼胚誘導(dǎo)出愈傷組織，利用其他部分作外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)取得成功的比較少見(jiàn)，然而用幼胚進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷組織，取材會(huì)受生長(zhǎng)季節(jié)的限制。為此，本實(shí)驗(yàn)采用玉米的胚葉和胚根作為外植體，進(jìn)行組織培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織，進(jìn)而產(chǎn)生再生植株，避免了取材受限制的缺陷，對(duì)玉米組織培養(yǎng)研究有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 接種材料為玉米幼苗的胚葉和胚根，原材料為玉米優(yōu)良自交系魯原92。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外植體選擇與準(zhǔn)備 在無(wú)菌操作間，把魯原92種子放在培養(yǎng)瓶中用無(wú)菌水中浸泡30min，倒出水后加入0.1%的HgCl2溶液浸泡消毒10min，在此過(guò)程中需不停攪拌。倒出升汞后加入70%的酒精浸泡攪拌消毒30s，倒出后用無(wú)菌水沖洗4～5遍，然后接種在MS基本培養(yǎng)基上，放在30℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)。待小苗長(zhǎng)至4～5cm時(shí)，取出待用。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo) 在超凈工作臺(tái)上，用消毒過(guò)的剪刀取小苗胚根的根尖及胚葉，用消毒過(guò)的鑷子將其接種到誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中。此培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，1L中加入25g蔗糖、12g瓊脂，附加不同激素等共設(shè)計(jì)了9種不同配方（表1），培養(yǎng)基的pH值控制在5.8～6.2（用NaOH調(diào)節(jié)pH值）。配制好的培養(yǎng)基要在高壓滅菌鍋中，121℃下滅菌20min。接種完成后，將接種后的材料分2組，一組放在組培室中，溫度為25～30℃，每日光照12h，光照強(qiáng)度為1 600～2 000lx的環(huán)境下進(jìn)行光培養(yǎng)；另一組放入培養(yǎng)箱中，溫度調(diào)至25～30℃進(jìn)行暗培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光照條件對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織的影響比較 由表2可以看出：在光培養(yǎng)的條件下，胚葉的誘導(dǎo)率明顯高于胚根，在暗培養(yǎng)的條件下，胚根的誘導(dǎo)率高于胚葉。由觀察得知，光培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織表面光滑，呈顆粒狀，分散性好，呈淡黃色，而暗培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織呈水泡狀，質(zhì)量不高。由此可見(jiàn)，光照環(huán)境更利于愈傷組織的產(chǎn)生，這與一般幼胚培養(yǎng)普遍需要暗環(huán)境有明顯的不同。可能的原因是在光環(huán)境下胚葉的細(xì)胞分化能力強(qiáng)，有利于形成愈傷組織。

2.2 不同2，4-D濃度對(duì)愈傷組織形成的影響比較 9種培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。愈傷組織一般有2種，一種表面光滑、透明、疏松呈淡黃色的Ⅱ型愈傷組織，其繼代增殖能力非常強(qiáng)；另一種是表面不光滑、不透明、細(xì)密、呈白色的Ⅰ型愈傷，其在以后的繼代增殖過(guò)程中易褐變，不具備再分化的能力，應(yīng)及早淘汰。在誘導(dǎo)愈傷組織過(guò)程中，2，4-D對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織形成有主導(dǎo)作用。本實(shí)驗(yàn)中，不同濃度的2，4-D都可誘導(dǎo)出愈傷組織，說(shuō)明玉米胚葉和胚根誘導(dǎo)愈傷需要添加一定量的2，4-D。不同的2，4-D濃度下外植體的出愈率列于表3。從表3可知，玉米的胚根、胚葉對(duì)2，4-D的反映敏感，當(dāng)2，4-D的濃度為6.0mg/L時(shí)，出愈率最高。說(shuō)明2，4-D對(duì)誘導(dǎo)玉米產(chǎn)生愈傷組織有明顯的促進(jìn)作用，但是高濃度2，4-D雖然能得到較高的出愈率，卻導(dǎo)致愈傷的生長(zhǎng)狀況較差，多呈水泡狀，且不能繼代，也就是說(shuō)這種愈傷不具備分化再生能力。因此，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為2，4-D濃度以2mg/L較為適宜。

2.3 不同KT濃度對(duì)愈傷組織形成的影響比較 本實(shí)驗(yàn)KT設(shè)計(jì)3個(gè)水平，來(lái)研究KT對(duì)胚葉胚根誘導(dǎo)愈傷的影響，玉米外植體使用不同濃度KT的出愈率列于表4。由表4可知，KT在玉米愈傷形成過(guò)程并不是必須的，因?yàn)橹灰?，4-D存在而不加入KT，誘導(dǎo)率也能達(dá)到43.5%，適量添加KT可提高玉米外植體的出愈率，當(dāng)KT的濃度為0.5mg/L，出愈率最高，但是高濃度的KT會(huì)造成誘導(dǎo)愈傷組織能力的下降。所以我們認(rèn)為加入低濃度的KT對(duì)誘導(dǎo)愈傷有一定促進(jìn)作用，但是濃度不易過(guò)高，以0.5mg/L比較適宜，濃度太高不利于愈傷形成。

2.4 不同6-BA濃度對(duì)愈傷組織形成的影響比較 玉米外植體使用不同濃度6-BA的出愈率列于表5。由表5可知，6-BA可提高玉米外植體的出愈率，當(dāng)其濃度為1.0mg/L時(shí)出愈率最高。3個(gè)水平的6-BA對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率影響的差異很小，故6-BA在誘導(dǎo)愈傷過(guò)程中作用不是很明顯。加入少量0.1mg/L的6-BA，可能對(duì)以后愈傷組織的分化有促進(jìn)作用，這與上海植物生理所衛(wèi)志明的觀點(diǎn)相同，他也認(rèn)為：雖然6-BA在誘導(dǎo)愈傷中作用不明顯，但是以后在愈傷分化中，前期加入6-BA對(duì)以后愈傷組織分化有明顯促進(jìn)作用。

2.5 不同AgNO3濃度對(duì)愈傷組織形成的影響比較 玉米外植體使用不同濃度AgNO3的出愈率列于表6。由表6可知，AgNO3能顯著提高出愈率，在一定濃度范圍內(nèi)，其濃度與出愈率成正相關(guān)性。

3 結(jié)論與討論

（1）通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在利用魯原92的胚葉、胚根產(chǎn)生再生植株時(shí)，MS+2，4-D2mg/L+KT 0.5mg/L+6-BA0.1mg/L+AgNO320mg/L是最佳的誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基。光培養(yǎng)更有利于魯原92產(chǎn)生愈傷組織。培養(yǎng)基中的L-脯氨酸和水解酪蛋白在誘導(dǎo)過(guò)程中起輔助作用。2，4-D的濃度在誘導(dǎo)過(guò)程中起主導(dǎo)作用。

（2）污染是組織培養(yǎng)過(guò)程中經(jīng)常遇到的問(wèn)題，污染率的高低決定了組織培養(yǎng)能否正常進(jìn)行。污染主要有外植體帶菌和各操作環(huán)節(jié)污染雜菌2條途徑。玉米常用70%的乙醇作為外植體表面的殺菌劑，70%的乙（下轉(zhuǎn)27頁(yè)）（上接25頁(yè)）醇對(duì)細(xì)胞有很強(qiáng)的穿透性和殺傷力，滅菌時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，約30s即可殺死外植體表面大部分微生物，一般因材料不同控制在5～60s，延長(zhǎng)滅菌時(shí)間會(huì)增加外植體損傷程度。操作環(huán)節(jié)可通過(guò)嚴(yán)格操作來(lái)控制，如對(duì)培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、鑷子等工具徹底滅菌，工作環(huán)境定期打掃、熏蒸，超凈工作臺(tái)開(kāi)啟15min后用70%的乙醇擦洗臺(tái)面；接種的鑷子，接完1皿（或1瓶）要消毒1次；操作人員在操作中要經(jīng)常用70%的乙醇擦洗手部等。

參考文獻(xiàn)

[1]張君，王丕武，武麗敏，等.正交試驗(yàn)法在玉米組織培養(yǎng)中的應(yīng)用[J].玉米科學(xué)，2003，11（1）：101-103.

[2]杜何為，張祖新，鄭用璉.玉米組織培養(yǎng)體系的研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003（4）：22-24，39.

[3]侯艷華，徐仲，蒼晶，等.玉米自交系愈傷組織的誘導(dǎo)及再生[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，24（6）：7-10.

[4]王景雪，孫毅，胡冬焱，等.激素等在誘導(dǎo)玉米胚葉產(chǎn)生愈傷組織中的作用[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，22（1）：14-17.

[5]孫紅煒，尚佑芬，楊崇良，等.影響玉米愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的有關(guān)因素研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，6：30-31.

[6]Hall RD.Plant Cell Culture Protocols[J].Humana Press，1999.

[7]傅作申，徐振彪，母秋華.玉米幼胚愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生[J].玉米科學(xué)，1998，6（3）：32-34.

[8]周洪生.甜玉米胚愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代、植株再生的研究[J].作物學(xué)報(bào)，1993，19（1）：55-61.

[9]李慧蓉.2，4-D在玉米幼葉培養(yǎng)中的歧義作用[J].武漢植物學(xué)研究，1992，10（2）：152-156.

[10]Hongchang Ma，et al.Direct Generation of Maize Haploids via another culture[J].Cytologia，1991（56）：103-106.

[11]董金皋，劉國(guó)勝，黃梧芳.玉米組織培養(yǎng)的進(jìn)展與技術(shù)關(guān)鍵[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1989，12（3）：155-162.

[12]Vasil V et al.Plant regeneration from friable embryogenic callus and cell suspension culture of Zea mays L[J].J Physiol，1986，126：399-408. （責(zé)編：張宏民）endprint

摘 要：以玉米優(yōu)良品種自交系魯原92為實(shí)驗(yàn)材料，以玉米幼苗胚葉和胚根為外植體，采用正交實(shí)驗(yàn)，分析了誘導(dǎo)愈傷組織的若干影響因素。結(jié)果表明：2，4-D在誘導(dǎo)愈傷組織中起著關(guān)鍵作用，添加一定濃度的KT對(duì)誘導(dǎo)起著促進(jìn)作用，添加微量的AgNO3明顯促進(jìn)愈傷誘導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：玉米；胚根；胚葉；組織培養(yǎng)；愈傷組織

中圖分類(lèi)號(hào) S513 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2014）16-24-03

組織培養(yǎng)是指在無(wú)菌條件下利用人工培養(yǎng)基對(duì)植物組織進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)，它是遺傳轉(zhuǎn)化、植物改良研究的基本環(huán)節(jié)之一。目前，國(guó)內(nèi)外從事玉米組培主要是從幼胚誘導(dǎo)出愈傷組織，利用其他部分作外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)取得成功的比較少見(jiàn)，然而用幼胚進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷組織，取材會(huì)受生長(zhǎng)季節(jié)的限制。為此，本實(shí)驗(yàn)采用玉米的胚葉和胚根作為外植體，進(jìn)行組織培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織，進(jìn)而產(chǎn)生再生植株，避免了取材受限制的缺陷，對(duì)玉米組織培養(yǎng)研究有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 接種材料為玉米幼苗的胚葉和胚根，原材料為玉米優(yōu)良自交系魯原92。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外植體選擇與準(zhǔn)備 在無(wú)菌操作間，把魯原92種子放在培養(yǎng)瓶中用無(wú)菌水中浸泡30min，倒出水后加入0.1%的HgCl2溶液浸泡消毒10min，在此過(guò)程中需不停攪拌。倒出升汞后加入70%的酒精浸泡攪拌消毒30s，倒出后用無(wú)菌水沖洗4～5遍，然后接種在MS基本培養(yǎng)基上，放在30℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)。待小苗長(zhǎng)至4～5cm時(shí)，取出待用。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo) 在超凈工作臺(tái)上，用消毒過(guò)的剪刀取小苗胚根的根尖及胚葉，用消毒過(guò)的鑷子將其接種到誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中。此培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，1L中加入25g蔗糖、12g瓊脂，附加不同激素等共設(shè)計(jì)了9種不同配方（表1），培養(yǎng)基的pH值控制在5.8～6.2（用NaOH調(diào)節(jié)pH值）。配制好的培養(yǎng)基要在高壓滅菌鍋中，121℃下滅菌20min。接種完成后，將接種后的材料分2組，一組放在組培室中，溫度為25～30℃，每日光照12h，光照強(qiáng)度為1 600～2 000lx的環(huán)境下進(jìn)行光培養(yǎng)；另一組放入培養(yǎng)箱中，溫度調(diào)至25～30℃進(jìn)行暗培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光照條件對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織的影響比較 由表2可以看出：在光培養(yǎng)的條件下，胚葉的誘導(dǎo)率明顯高于胚根，在暗培養(yǎng)的條件下，胚根的誘導(dǎo)率高于胚葉。由觀察得知，光培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織表面光滑，呈顆粒狀，分散性好，呈淡黃色，而暗培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織呈水泡狀，質(zhì)量不高。由此可見(jiàn)，光照環(huán)境更利于愈傷組織的產(chǎn)生，這與一般幼胚培養(yǎng)普遍需要暗環(huán)境有明顯的不同?？赡艿脑蚴窃诠猸h(huán)境下胚葉的細(xì)胞分化能力強(qiáng)，有利于形成愈傷組織。

2.2 不同2，4-D濃度對(duì)愈傷組織形成的影響比較 9種培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。愈傷組織一般有2種，一種表面光滑、透明、疏松呈淡黃色的Ⅱ型愈傷組織，其繼代增殖能力非常強(qiáng)；另一種是表面不光滑、不透明、細(xì)密、呈白色的Ⅰ型愈傷，其在以后的繼代增殖過(guò)程中易褐變，不具備再分化的能力，應(yīng)及早淘汰。在誘導(dǎo)愈傷組織過(guò)程中，2，4-D對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織形成有主導(dǎo)作用。本實(shí)驗(yàn)中，不同濃度的2，4-D都可誘導(dǎo)出愈傷組織，說(shuō)明玉米胚葉和胚根誘導(dǎo)愈傷需要添加一定量的2，4-D。不同的2，4-D濃度下外植體的出愈率列于表3。從表3可知，玉米的胚根、胚葉對(duì)2，4-D的反映敏感，當(dāng)2，4-D的濃度為6.0mg/L時(shí)，出愈率最高。說(shuō)明2，4-D對(duì)誘導(dǎo)玉米產(chǎn)生愈傷組織有明顯的促進(jìn)作用，但是高濃度2，4-D雖然能得到較高的出愈率，卻導(dǎo)致愈傷的生長(zhǎng)狀況較差，多呈水泡狀，且不能繼代，也就是說(shuō)這種愈傷不具備分化再生能力。因此，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為2，4-D濃度以2mg/L較為適宜。

2.3 不同KT濃度對(duì)愈傷組織形成的影響比較 本實(shí)驗(yàn)KT設(shè)計(jì)3個(gè)水平，來(lái)研究KT對(duì)胚葉胚根誘導(dǎo)愈傷的影響，玉米外植體使用不同濃度KT的出愈率列于表4。由表4可知，KT在玉米愈傷形成過(guò)程并不是必須的，因?yàn)橹灰?，4-D存在而不加入KT，誘導(dǎo)率也能達(dá)到43.5%，適量添加KT可提高玉米外植體的出愈率，當(dāng)KT的濃度為0.5mg/L，出愈率最高，但是高濃度的KT會(huì)造成誘導(dǎo)愈傷組織能力的下降。所以我們認(rèn)為加入低濃度的KT對(duì)誘導(dǎo)愈傷有一定促進(jìn)作用，但是濃度不易過(guò)高，以0.5mg/L比較適宜，濃度太高不利于愈傷形成。

2.4 不同6-BA濃度對(duì)愈傷組織形成的影響比較 玉米外植體使用不同濃度6-BA的出愈率列于表5。由表5可知，6-BA可提高玉米外植體的出愈率，當(dāng)其濃度為1.0mg/L時(shí)出愈率最高。3個(gè)水平的6-BA對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率影響的差異很小，故6-BA在誘導(dǎo)愈傷過(guò)程中作用不是很明顯。加入少量0.1mg/L的6-BA，可能對(duì)以后愈傷組織的分化有促進(jìn)作用，這與上海植物生理所衛(wèi)志明的觀點(diǎn)相同，他也認(rèn)為：雖然6-BA在誘導(dǎo)愈傷中作用不明顯，但是以后在愈傷分化中，前期加入6-BA對(duì)以后愈傷組織分化有明顯促進(jìn)作用。

2.5 不同AgNO3濃度對(duì)愈傷組織形成的影響比較 玉米外植體使用不同濃度AgNO3的出愈率列于表6。由表6可知，AgNO3能顯著提高出愈率，在一定濃度范圍內(nèi)，其濃度與出愈率成正相關(guān)性。

3 結(jié)論與討論

（1）通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在利用魯原92的胚葉、胚根產(chǎn)生再生植株時(shí)，MS+2，4-D2mg/L+KT 0.5mg/L+6-BA0.1mg/L+AgNO320mg/L是最佳的誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基。光培養(yǎng)更有利于魯原92產(chǎn)生愈傷組織。培養(yǎng)基中的L-脯氨酸和水解酪蛋白在誘導(dǎo)過(guò)程中起輔助作用。2，4-D的濃度在誘導(dǎo)過(guò)程中起主導(dǎo)作用。

（2）污染是組織培養(yǎng)過(guò)程中經(jīng)常遇到的問(wèn)題，污染率的高低決定了組織培養(yǎng)能否正常進(jìn)行。污染主要有外植體帶菌和各操作環(huán)節(jié)污染雜菌2條途徑。玉米常用70%的乙醇作為外植體表面的殺菌劑，70%的乙（下轉(zhuǎn)27頁(yè)）（上接25頁(yè)）醇對(duì)細(xì)胞有很強(qiáng)的穿透性和殺傷力，滅菌時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，約30s即可殺死外植體表面大部分微生物，一般因材料不同控制在5～60s，延長(zhǎng)滅菌時(shí)間會(huì)增加外植體損傷程度。操作環(huán)節(jié)可通過(guò)嚴(yán)格操作來(lái)控制，如對(duì)培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、鑷子等工具徹底滅菌，工作環(huán)境定期打掃、熏蒸，超凈工作臺(tái)開(kāi)啟15min后用70%的乙醇擦洗臺(tái)面；接種的鑷子，接完1皿（或1瓶）要消毒1次；操作人員在操作中要經(jīng)常用70%的乙醇擦洗手部等。

參考文獻(xiàn)

[1]張君，王丕武，武麗敏，等.正交試驗(yàn)法在玉米組織培養(yǎng)中的應(yīng)用[J].玉米科學(xué)，2003，11（1）：101-103.

[2]杜何為，張祖新，鄭用璉.玉米組織培養(yǎng)體系的研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003（4）：22-24，39.

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[4]王景雪，孫毅，胡冬焱，等.激素等在誘導(dǎo)玉米胚葉產(chǎn)生愈傷組織中的作用[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，22（1）：14-17.

[5]孫紅煒，尚佑芬，楊崇良，等.影響玉米愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的有關(guān)因素研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，6：30-31.

[6]Hall RD.Plant Cell Culture Protocols[J].Humana Press，1999.

[7]傅作申，徐振彪，母秋華.玉米幼胚愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生[J].玉米科學(xué)，1998，6（3）：32-34.

[8]周洪生.甜玉米胚愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代、植株再生的研究[J].作物學(xué)報(bào)，1993，19（1）：55-61.

[9]李慧蓉.2，4-D在玉米幼葉培養(yǎng)中的歧義作用[J].武漢植物學(xué)研究，1992，10（2）：152-156.

[10]Hongchang Ma，et al.Direct Generation of Maize Haploids via another culture[J].Cytologia，1991（56）：103-106.

[11]董金皋，劉國(guó)勝，黃梧芳.玉米組織培養(yǎng)的進(jìn)展與技術(shù)關(guān)鍵[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1989，12（3）：155-162.

[12]Vasil V et al.Plant regeneration from friable embryogenic callus and cell suspension culture of Zea mays L[J].J Physiol，1986，126：399-408. （責(zé)編：張宏民）endprint

摘 要：以玉米優(yōu)良品種自交系魯原92為實(shí)驗(yàn)材料，以玉米幼苗胚葉和胚根為外植體，采用正交實(shí)驗(yàn)，分析了誘導(dǎo)愈傷組織的若干影響因素。結(jié)果表明：2，4-D在誘導(dǎo)愈傷組織中起著關(guān)鍵作用，添加一定濃度的KT對(duì)誘導(dǎo)起著促進(jìn)作用，添加微量的AgNO3明顯促進(jìn)愈傷誘導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：玉米；胚根；胚葉；組織培養(yǎng)；愈傷組織

中圖分類(lèi)號(hào) S513 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2014）16-24-03

組織培養(yǎng)是指在無(wú)菌條件下利用人工培養(yǎng)基對(duì)植物組織進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)，它是遺傳轉(zhuǎn)化、植物改良研究的基本環(huán)節(jié)之一。目前，國(guó)內(nèi)外從事玉米組培主要是從幼胚誘導(dǎo)出愈傷組織，利用其他部分作外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)取得成功的比較少見(jiàn)，然而用幼胚進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷組織，取材會(huì)受生長(zhǎng)季節(jié)的限制。為此，本實(shí)驗(yàn)采用玉米的胚葉和胚根作為外植體，進(jìn)行組織培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織，進(jìn)而產(chǎn)生再生植株，避免了取材受限制的缺陷，對(duì)玉米組織培養(yǎng)研究有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 接種材料為玉米幼苗的胚葉和胚根，原材料為玉米優(yōu)良自交系魯原92。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外植體選擇與準(zhǔn)備 在無(wú)菌操作間，把魯原92種子放在培養(yǎng)瓶中用無(wú)菌水中浸泡30min，倒出水后加入0.1%的HgCl2溶液浸泡消毒10min，在此過(guò)程中需不停攪拌。倒出升汞后加入70%的酒精浸泡攪拌消毒30s，倒出后用無(wú)菌水沖洗4～5遍，然后接種在MS基本培養(yǎng)基上，放在30℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)。待小苗長(zhǎng)至4～5cm時(shí)，取出待用。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo) 在超凈工作臺(tái)上，用消毒過(guò)的剪刀取小苗胚根的根尖及胚葉，用消毒過(guò)的鑷子將其接種到誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中。此培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，1L中加入25g蔗糖、12g瓊脂，附加不同激素等共設(shè)計(jì)了9種不同配方（表1），培養(yǎng)基的pH值控制在5.8～6.2（用NaOH調(diào)節(jié)pH值）。配制好的培養(yǎng)基要在高壓滅菌鍋中，121℃下滅菌20min。接種完成后，將接種后的材料分2組，一組放在組培室中，溫度為25～30℃，每日光照12h，光照強(qiáng)度為1 600～2 000lx的環(huán)境下進(jìn)行光培養(yǎng)；另一組放入培養(yǎng)箱中，溫度調(diào)至25～30℃進(jìn)行暗培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光照條件對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織的影響比較 由表2可以看出：在光培養(yǎng)的條件下，胚葉的誘導(dǎo)率明顯高于胚根，在暗培養(yǎng)的條件下，胚根的誘導(dǎo)率高于胚葉。由觀察得知，光培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織表面光滑，呈顆粒狀，分散性好，呈淡黃色，而暗培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織呈水泡狀，質(zhì)量不高。由此可見(jiàn)，光照環(huán)境更利于愈傷組織的產(chǎn)生，這與一般幼胚培養(yǎng)普遍需要暗環(huán)境有明顯的不同。可能的原因是在光環(huán)境下胚葉的細(xì)胞分化能力強(qiáng)，有利于形成愈傷組織。

2.2 不同2，4-D濃度對(duì)愈傷組織形成的影響比較 9種培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。愈傷組織一般有2種，一種表面光滑、透明、疏松呈淡黃色的Ⅱ型愈傷組織，其繼代增殖能力非常強(qiáng)；另一種是表面不光滑、不透明、細(xì)密、呈白色的Ⅰ型愈傷，其在以后的繼代增殖過(guò)程中易褐變，不具備再分化的能力，應(yīng)及早淘汰。在誘導(dǎo)愈傷組織過(guò)程中，2，4-D對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織形成有主導(dǎo)作用。本實(shí)驗(yàn)中，不同濃度的2，4-D都可誘導(dǎo)出愈傷組織，說(shuō)明玉米胚葉和胚根誘導(dǎo)愈傷需要添加一定量的2，4-D。不同的2，4-D濃度下外植體的出愈率列于表3。從表3可知，玉米的胚根、胚葉對(duì)2，4-D的反映敏感，當(dāng)2，4-D的濃度為6.0mg/L時(shí)，出愈率最高。說(shuō)明2，4-D對(duì)誘導(dǎo)玉米產(chǎn)生愈傷組織有明顯的促進(jìn)作用，但是高濃度2，4-D雖然能得到較高的出愈率，卻導(dǎo)致愈傷的生長(zhǎng)狀況較差，多呈水泡狀，且不能繼代，也就是說(shuō)這種愈傷不具備分化再生能力。因此，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為2，4-D濃度以2mg/L較為適宜。

2.3 不同KT濃度對(duì)愈傷組織形成的影響比較 本實(shí)驗(yàn)KT設(shè)計(jì)3個(gè)水平，來(lái)研究KT對(duì)胚葉胚根誘導(dǎo)愈傷的影響，玉米外植體使用不同濃度KT的出愈率列于表4。由表4可知，KT在玉米愈傷形成過(guò)程并不是必須的，因?yàn)橹灰?，4-D存在而不加入KT，誘導(dǎo)率也能達(dá)到43.5%，適量添加KT可提高玉米外植體的出愈率，當(dāng)KT的濃度為0.5mg/L，出愈率最高，但是高濃度的KT會(huì)造成誘導(dǎo)愈傷組織能力的下降。所以我們認(rèn)為加入低濃度的KT對(duì)誘導(dǎo)愈傷有一定促進(jìn)作用，但是濃度不易過(guò)高，以0.5mg/L比較適宜，濃度太高不利于愈傷形成。

2.4 不同6-BA濃度對(duì)愈傷組織形成的影響比較 玉米外植體使用不同濃度6-BA的出愈率列于表5。由表5可知，6-BA可提高玉米外植體的出愈率，當(dāng)其濃度為1.0mg/L時(shí)出愈率最高。3個(gè)水平的6-BA對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率影響的差異很小，故6-BA在誘導(dǎo)愈傷過(guò)程中作用不是很明顯。加入少量0.1mg/L的6-BA，可能對(duì)以后愈傷組織的分化有促進(jìn)作用，這與上海植物生理所衛(wèi)志明的觀點(diǎn)相同，他也認(rèn)為：雖然6-BA在誘導(dǎo)愈傷中作用不明顯，但是以后在愈傷分化中，前期加入6-BA對(duì)以后愈傷組織分化有明顯促進(jìn)作用。

2.5 不同AgNO3濃度對(duì)愈傷組織形成的影響比較 玉米外植體使用不同濃度AgNO3的出愈率列于表6。由表6可知，AgNO3能顯著提高出愈率，在一定濃度范圍內(nèi)，其濃度與出愈率成正相關(guān)性。

3 結(jié)論與討論

（1）通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在利用魯原92的胚葉、胚根產(chǎn)生再生植株時(shí)，MS+2，4-D2mg/L+KT 0.5mg/L+6-BA0.1mg/L+AgNO320mg/L是最佳的誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基。光培養(yǎng)更有利于魯原92產(chǎn)生愈傷組織。培養(yǎng)基中的L-脯氨酸和水解酪蛋白在誘導(dǎo)過(guò)程中起輔助作用。2，4-D的濃度在誘導(dǎo)過(guò)程中起主導(dǎo)作用。

（2）污染是組織培養(yǎng)過(guò)程中經(jīng)常遇到的問(wèn)題，污染率的高低決定了組織培養(yǎng)能否正常進(jìn)行。污染主要有外植體帶菌和各操作環(huán)節(jié)污染雜菌2條途徑。玉米常用70%的乙醇作為外植體表面的殺菌劑，70%的乙（下轉(zhuǎn)27頁(yè)）（上接25頁(yè)）醇對(duì)細(xì)胞有很強(qiáng)的穿透性和殺傷力，滅菌時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，約30s即可殺死外植體表面大部分微生物，一般因材料不同控制在5～60s，延長(zhǎng)滅菌時(shí)間會(huì)增加外植體損傷程度。操作環(huán)節(jié)可通過(guò)嚴(yán)格操作來(lái)控制，如對(duì)培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、鑷子等工具徹底滅菌，工作環(huán)境定期打掃、熏蒸，超凈工作臺(tái)開(kāi)啟15min后用70%的乙醇擦洗臺(tái)面；接種的鑷子，接完1皿（或1瓶）要消毒1次；操作人員在操作中要經(jīng)常用70%的乙醇擦洗手部等。

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