陳建高，饒承龍，劉文正，吳 潘，王旭冉，南棟琪，楊文波，毛旭虎

400038 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))藥學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)系臨床微生物與免疫學(xué)教研室

類鼻疽伯克霍爾德菌(

Burkholderia

pseudomallei

,

B.

pseudomallei

)簡(jiǎn)稱類鼻疽菌，是一種能引起人畜共患類鼻疽病的革蘭陰性短桿菌，兼具B類生物威脅因子和Ⅰ類生物恐怖戰(zhàn)劑的特性，嚴(yán)重威脅人類的健康和公共衛(wèi)生安全。類鼻疽主要流行于熱帶及亞熱帶地區(qū)，包括我國(guó)海南、廣東、福建、香港、臺(tái)灣等省市。隨著全球氣候的變化、交通的便利、經(jīng)貿(mào)文化交流的頻繁，其人群感染發(fā)生率逐年增高，可預(yù)見我國(guó)出現(xiàn)類鼻疽疫情的危險(xiǎn)性將越來越高。加強(qiáng)類鼻疽菌感染致病機(jī)制的研究，對(duì)其有效防控具有重要的理論指導(dǎo)意義。

病原菌與宿主的相互作用是感染和致病的前提。為了深入研究類鼻疽菌在感染免疫過程中細(xì)菌與宿主的相互作用，前期課題組建立了如DAPI直接染色、類鼻疽菌特異性抗體免疫熒光染色等研究手段，但其存在分辨率不高、操作繁瑣、不能活體觀察等缺點(diǎn)。因此，建立一種活菌熒光示蹤的方法，有利于在細(xì)胞、組織或動(dòng)物模型中持續(xù)動(dòng)態(tài)地觀察該菌的感染與致病過程。目前國(guó)內(nèi)尚無熒光標(biāo)記類鼻疽菌構(gòu)建的報(bào)道，本文以類鼻疽菌常用的廣泛宿主pUCP28T載體為骨架質(zhì)粒，以常用的綠色、紅色和藍(lán)色熒光蛋白(green/red/blue fluorescent protein，GFP/RFP/BFP)為標(biāo)記物，通過DNA重組技術(shù)將上述熒光基因分別克隆到載體pUCP28T上，以電轉(zhuǎn)的方式導(dǎo)入重組質(zhì)粒，構(gòu)建多種熒光標(biāo)記的類鼻疽菌，用于類鼻疽菌在細(xì)胞、動(dòng)物體內(nèi)的分布、定殖和存活情況以及其致病機(jī)制的研究方面。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞 類鼻疽菌BPC006菌株由本室分離鑒定并保存，大腸桿菌DH5α由本室保存。pUCP28T-16 S質(zhì)粒由本室構(gòu)建并保存，GFP-RFP-LC3質(zhì)粒由日本大阪大學(xué)Tamotsu Yoshimori教授惠贈(zèng)，pUCP24T-BFP質(zhì)粒由陸軍軍醫(yī)大學(xué)顧江教授惠贈(zèng)。穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7購(gòu)于漢恒生物科技(上海)有限公司。

1.1.2 試劑及儀器 限制性內(nèi)切酶

Xba

Ⅰ、

Hind

Ⅲ、

Spe

Ⅰ和高保真酶PrimeSTAR? HS DNA Polymerase、T4 DNA連接酶、DL-2000 marker、DL-10000 marker等均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒等均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，IL-8細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒購(gòu)于達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。4%多聚甲醛和抗熒光猝滅封片劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，共聚焦皿購(gòu)自NEST公司。

AppliedBiosystems PCR儀，美國(guó)ABI公司；微生物電穿孔儀MicroPulser，0.2 cm電擊杯，酶標(biāo)儀，凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；動(dòng)態(tài)活細(xì)胞成像及數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)DeltaVision，美國(guó)GE公司；多功能智能成像系統(tǒng)iBrightCL1500，美國(guó)Thermo公司；水平電泳槽，HE-90型電泳儀，上海天能科技有限公司；熒光顯微鏡CELENA?S，韓國(guó)Logos biosystemes公司。

1.1.3 細(xì)菌和細(xì)胞培養(yǎng) 類鼻疽菌BPC006和大腸桿菌DH5α均在LB培養(yǎng)基中，于37 ℃，200 rmp振蕩培養(yǎng)。RAW264.7和A549細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。甲氧芐啶使用濃度250 μg/mL。所有涉及類鼻疽菌的實(shí)驗(yàn)操作在生物安全P2+實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，并嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室生物安全規(guī)范操作。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GFP-RFP-LC3質(zhì)粒的

gfp

和

rfp

基因序列設(shè)計(jì)引物GFP-F/R和RFP-F/R，并在GFP-F/R引物5’端分別插入

Xba

Ⅰ和

Hind

Ⅲ酶位點(diǎn)，在RFP-F/R引物5’端分別插入

Xba

Ⅰ和

Spe

Ⅰ酶位點(diǎn)；同理根據(jù)pUCP24T-BFP質(zhì)粒的

bfp

基因設(shè)計(jì)引物BFP-F/R，并在上下游引物5’端插入

Xba

Ⅰ和

Hind

Ⅲ酶位點(diǎn)。引物均由華大基因科技有限公司合成。本實(shí)驗(yàn)所用引物序列詳見表1。

表1 熒光質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定引物

基因片段引物名稱引物序列(5'→ 3')限制性核酸內(nèi)切酶片段大小bfpBFP-FGCTCTAGAATGAGCGAGCTGATTAAGGAGAACATGXbaⅠ713BFP-RCCAAGCTTACTAGTTTAGTGCCCCAGTTTGCTAGGGAGHind Ⅲ、SpeⅠgfpGFP-FTTTCTAGAATGATTAAAGGAGAAGAACTTTTCACXbaⅠ733GFP-RCCAAGCTTTTATTTGTAGAGCTCATCCATGCCHind ⅢrfpRFP-FGCTCTAGAATGGCGAGTAGCGAAGACGXba Ⅰ689RFP-RGGACTAGTTAAGCACCGGTGGAGTGACGACSpe Ⅰ

1.2.2 綠色/藍(lán)色/紅色熒光蛋白(

gfp

/

bfp

/

rfp

)基因的擴(kuò)增 以質(zhì)粒GFP-RFP-LC3為模板，分別以GFP-F/R和RFP-R/F為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得

gfp

/

bfp

基因片段。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：2×Prime STAR? GC Buffer 25 μL，dNTP Mixture 4 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，Prime STAR?HS DNA Polymerase (2.5 U/μL) 0.5 μL，DMSO 2 μL，ddHO 16.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸1.5 min。同理，以質(zhì)粒pUCP24T-BFP為模板，以BFP-F/R為上下游引物PCR擴(kuò)增獲得

bfp

基因片段。將PCR擴(kuò)增的

gfp

/

bfp

/

rfp

基因用1%的瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209)說明。1.2.3 含熒光基因(

gfp

/

rfp

/

bfp

)重組表達(dá)質(zhì)粒pUCP28T-

gfp

/

rfp

/

bfp

的構(gòu)建 將膠回收的

gfp

/

bfp

基因和pUCP28T質(zhì)粒經(jīng)

Xba

Ⅰ和

Hind

Ⅲ雙酶切后，用T4 DNA連接酶于16 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，然后涂布于含250 μg/mL甲氧芐啶的LB平板進(jìn)行篩選，挑取陽性單克隆菌落，于250 μg/mL甲氧芐啶的LB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，取少量菌液送華大基因科技有限公司測(cè)序驗(yàn)證，其余菌液離心后提質(zhì)粒，用

Xba

Ⅰ和

Hind

Ⅲ雙酶切鑒定。由于

rfp

基因上存在兩個(gè)

Hind

Ⅲ酶切位點(diǎn)，故需將構(gòu)建成功的pUCP28T-BFP質(zhì)粒和

rfp

基因經(jīng)

Xba

Ⅰ和

Spe

Ⅰ雙酶切后連接，同上，獲得pUCP28T-RFP質(zhì)粒，后續(xù)用

Xba

Ⅰ和

Spe

Ⅰ雙酶切驗(yàn)證。1.2.4 類鼻疽菌BPC006電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備 從LB固體平板挑BPC006單菌落于5 mL SOB培養(yǎng)基震蕩過夜，再按1∶10比例將過夜培養(yǎng)菌液接種到新鮮 SOB培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)到

D

(600)為0.6～0.8。將菌液置于冰上放置20 min，再于4 ℃，2 000 g，離心10 min，取50 mL預(yù)冷的無菌ddHO洗滌一遍后離心，菌沉淀再用25 mL預(yù)冷的10%無菌甘油洗滌2遍，離心沉淀收集菌體，加10%甘油500 μL重懸，每100 μL每管分裝于-80 ℃暫存。

1.2.5 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化BPC006感受態(tài)細(xì)胞 將感受態(tài)細(xì)胞BPC006與重組質(zhì)粒以10∶1體積于冰上混勻，加入到冰上預(yù)冷的0.2 cm電擊杯中，冰上放置10 min。3 kV、200 Ω、25 μF電擊后(時(shí)間常數(shù)為4.5～5 ms)，立即加入1 mL 37 ℃預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，37 ℃振蕩孵育2 h，取200 μL菌液涂布含250 μg/mL甲氧芐啶的LB平板，37 ℃孵箱培養(yǎng)36 h，挑單菌落重懸于適量的4%多聚甲醛中固定，取10 μL滴于載玻片，在熒光顯微鏡下觀察，有熒光的菌落即為陽性克隆。

1.2.6 熒光菌株表達(dá)穩(wěn)定性檢測(cè) 將熒光類鼻疽菌BPC006接種于無抗性的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，每隔16～18 h按0.1%的比例轉(zhuǎn)接到新鮮的無抗LB培養(yǎng)基中，連續(xù)傳代20次，取樣適量稀釋后，涂布于無抗LB平板(3個(gè)重復(fù))，置于孵箱37 ℃培養(yǎng)36 h，于多功能智能成像系統(tǒng)iBrightCL1500下拍照觀察熒光菌落，并計(jì)算熒光菌落數(shù)/總菌落數(shù)，即為熒光菌株的穩(wěn)定表達(dá)率。

1.2.7 炎性因子IL-8的檢測(cè) 將類鼻疽菌按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)10感染人肺上皮細(xì)胞A549，共孵2 h后加入250 μg/mL的卡那霉素，再孵育1 h后，置換新鮮的無抗完全DMEM培養(yǎng)基，分別在感染12、24 h收集感染細(xì)胞培養(yǎng)上清，并按說明書步驟檢測(cè)IL-8含量。

1.2.8 活細(xì)胞成像系統(tǒng)觀察類鼻疽菌與自噬標(biāo)記分子LC3的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化 將穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7以1.5×10接種于激光共聚焦皿中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中(5% CO，37 ℃)過夜培養(yǎng)。選取紅色熒光類鼻疽菌以MOI為10感染RAW264.7細(xì)胞，感染1.5 h后，用PBS清洗共聚焦皿3遍，然后加卡那霉素到250 μg/mL，孵育0.5 h后，PBS洗3遍，換無抗的完全DMEM培養(yǎng)基，于熒光顯微鏡上進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，并在高分辨率活細(xì)胞成像系統(tǒng)上動(dòng)態(tài)觀察類鼻疽菌與自噬標(biāo)記分子LC3共聚的動(dòng)態(tài)變化。

2 結(jié)果

2.1 熒光標(biāo)記類鼻疽菌的構(gòu)建

2.1.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 首先通過PCR擴(kuò)增分別從模板上獲得熒光基因

gfp

/

rfp

/

bfp

片段，經(jīng)目的片段和載體雙酶切后連于含有16 S啟動(dòng)子的表達(dá)載體pUCP28T上，構(gòu)建重組表達(dá)熒光質(zhì)粒(圖 1A～C)。具體地，

gfp

/

rfp

/

bfp

基因的PCR擴(kuò)增片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，在約750 bp處有1條特異的DNA條帶，與GFP、RFP、BFP基因理論大小一致。接著，將連接成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至大腸桿菌DH5α中進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增，菌液抽提質(zhì)粒后，質(zhì)粒pUCP28T-GFP和pUCP28T-BFP用

Xba

Ⅰ和

Hind

Ⅲ雙酶切鑒定，質(zhì)粒pUCP28T-RFP用

Xba

Ⅰ和

Spe

Ⅰ雙酶切鑒定，均得出了與理論大小相符的酶切條帶(圖 1D)，并將重組質(zhì)粒送至公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示插入片段正確，表明

gfp

/

rfp

/

bfp

基因均已成功克隆到類鼻疽菌表達(dá)載體pUCP28T質(zhì)粒中。

A、B、C分別為熒光質(zhì)粒pUCP28T-GFP、pUCP28T-BFP、pUCP28T-RFP構(gòu)建示意圖；D： 熒光質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果 M: DL-2000標(biāo)準(zhǔn)；1: pUCP28T；2: pUCP28T-GFP；3: pUCP28T-RFP；4: pUCP28T-BFP；5～8分別為Xba Ⅰ和Hind Ⅲ或Spe Ⅰ分別雙酶切鑒定pUCP28T、pUCP28T-GFP、pUCP28T-RFP、pUCP28T-BFP載體

2.1.2 熒光蛋白的表達(dá) 將構(gòu)建成功的熒光重組質(zhì)粒pUCP28T-GFP、pUCP28T-RFP、pUCP28T-BFP分別電轉(zhuǎn)化到類鼻疽菌BPC006中，在含甲氧芐啶的LB平板上挑取生長(zhǎng)菌落制片，在熒光顯微鏡下，通過發(fā)光表型篩選到了陽性克隆(圖 2)。

圖2 熒光顯微鏡觀察構(gòu)建的熒光標(biāo)記類鼻疽菌的熒光效果

2.2 熒光標(biāo)記類鼻疽菌的生物學(xué)性質(zhì)研究

2.2.1 細(xì)菌生長(zhǎng)特性的檢測(cè) 考慮到外源性GFP、RFP、BFP蛋白的表達(dá)對(duì)類鼻疽菌自身生長(zhǎng)繁殖能力有無影響，我們通過體外培養(yǎng)未標(biāo)記和熒光標(biāo)記細(xì)菌，繪制生長(zhǎng)曲線。如圖所示，熒光標(biāo)記細(xì)菌在體外培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)繁殖能力與未標(biāo)記細(xì)菌無明顯差異(圖 3)。

未標(biāo)記菌：無熒光標(biāo)記類鼻疽菌；GFP/RFP/BFP分別表示綠色、紅色、藍(lán)色熒光標(biāo)記的類鼻疽菌；將體外液體LB培養(yǎng)中的細(xì)菌進(jìn)行D(600)吸光度檢測(cè)，繪制生長(zhǎng)曲線

2.2.2 感染細(xì)胞能力的變化 在前期研究的工作基礎(chǔ)上，炎癥因子IL-8的變化是評(píng)價(jià)類鼻疽菌感染A549細(xì)胞模型的重要檢測(cè)指標(biāo)。與對(duì)照組相比，未標(biāo)記與標(biāo)記菌株在感染12和24小時(shí)后均可以引起炎癥因子IL-8的表達(dá)明顯上調(diào)，且無明顯差異，提示熒光標(biāo)記類鼻疽菌感染宿主細(xì)胞的能力較未標(biāo)記菌株無明顯差異(圖 4)。

陰性對(duì)照：未感染組；未標(biāo)記菌：無熒光標(biāo)記類鼻疽菌；GFP/RFP/BFP分別表示綠色、紅色、藍(lán)色熒光標(biāo)記的類鼻疽菌 a：P <0.01,與陰性對(duì)照比較

2.2.3 遺傳穩(wěn)定性檢測(cè) 將綠色和紅色熒光標(biāo)記的類鼻疽菌經(jīng)連續(xù)稀釋傳代20次后，在無抗LB平板上仍能培養(yǎng)出帶有熒光的菌落(圖 5)，且熒光菌落占總菌落數(shù)百分比為(92±5)%(綠色熒光菌)和(95±13)%(紅色熒光菌)，表明GFP和RFP標(biāo)記的重組熒光類鼻疽菌在傳代至20代時(shí)仍能穩(wěn)定表達(dá)熒光蛋白。

圖5 GFP和RFP標(biāo)記類鼻疽菌傳20代后的熒光菌落圖

2.3 熒光標(biāo)記類鼻疽菌與宿主細(xì)胞互作的應(yīng)用研究

通過活細(xì)胞成像系統(tǒng)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察熒光標(biāo)記類鼻疽菌與宿主細(xì)胞自噬標(biāo)記分子LC3共定位的變化。在類鼻疽菌感染RAW264.7巨噬細(xì)胞2 h的細(xì)胞模型中，通過熒光顯微鏡下觀察，紅色熒光標(biāo)記的類鼻疽菌熒光明亮，能夠與RAW264.7細(xì)胞中的GFP-LC3綠色熒光明顯區(qū)分(圖 6)，結(jié)果提示后續(xù)無需再對(duì)類鼻疽菌進(jìn)行熒光抗體標(biāo)記，可用于直接觀察類鼻疽菌與宿主細(xì)胞自噬相互作用的動(dòng)態(tài)變化過程情況。

圖6 熒光顯微鏡觀察類鼻疽菌感染RAW264.7細(xì)胞后細(xì)菌和細(xì)胞的變化

進(jìn)一步，我們?cè)诟叻直媛驶罴?xì)胞成像系統(tǒng)中實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察類鼻疽菌侵入宿主細(xì)胞后，細(xì)胞自噬與類鼻疽菌互作的動(dòng)態(tài)變化情況。如圖7所示，同樣的，如上所述，在類鼻疽菌感染RAW264.7細(xì)胞2 h后，我們?cè)诨罴?xì)胞工作站中觀察到隨著類鼻疽菌侵入RAW264.7細(xì)胞后，自噬標(biāo)志物GFP-LC3與紅色熒光標(biāo)記的類鼻疽菌發(fā)生共聚，并逐漸形成包裹類鼻疽菌的自噬小體，且整個(gè)過程在數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘內(nèi)即可完成。

圖7 高分辨率活細(xì)胞成像系統(tǒng)觀察類鼻疽菌與RAW264.7細(xì)胞內(nèi)GFP-LC3共定位的變化

3 討論

類鼻疽菌作為一種胞內(nèi)感染病原菌，為了實(shí)現(xiàn)在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存、感染和致病，有效逃逸宿主細(xì)胞免疫清除是其成功定植和播散的前提。由于類鼻疽菌特殊的病原生物學(xué)特性，其防控還存在諸多困境，如天然耐藥、臨床癥狀不特異、缺乏快速準(zhǔn)確的臨床診斷技術(shù)、無疫苗使用等。究其原因，根本問題在于類鼻疽菌的感染與免疫機(jī)制不明確，如在類鼻疽菌感染宿主的過程中，介導(dǎo)細(xì)菌免疫逃逸的重要致病因子有哪些、它們?nèi)绾握{(diào)控宿主免疫清除、細(xì)菌-宿主免疫互作的具體分子機(jī)制如何等問題尚未闡釋清楚。因此，深入研究類鼻疽菌與宿主互作及免疫逃逸，揭示該菌致病和傳播分子機(jī)制，將為類鼻疽的防控奠定重要理論基礎(chǔ)。

本課題組長(zhǎng)期圍繞類鼻疽菌逃逸宿主細(xì)胞免疫清除分子機(jī)制開展系統(tǒng)研究，前期工作中發(fā)現(xiàn)類鼻疽菌可通過阻礙宿主細(xì)胞吞噬囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)成熟、誘導(dǎo)miRNAs靶向抑制自噬關(guān)鍵基因ATG10以及操縱NR1D2-ATGL調(diào)控軸干擾脂噬途徑從而妨礙宿主細(xì)胞自噬清除等多種途徑逃逸宿主細(xì)胞免疫清除作用，達(dá)到持續(xù)性感染的目的。但是，研究多采用細(xì)胞爬片固定后免疫熒光染色，或者提取細(xì)胞內(nèi)相關(guān)成分進(jìn)行體外生化分析等，只能做到對(duì)某個(gè)時(shí)間點(diǎn)的記錄，無法進(jìn)行類鼻疽菌與宿主細(xì)胞互作的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察，這無疑對(duì)揭示類鼻疽菌感染免疫機(jī)制是一種研究手段的缺陷。構(gòu)建熒光標(biāo)記的類鼻疽菌活菌，將為實(shí)現(xiàn)直接、適時(shí)和動(dòng)態(tài)觀察細(xì)菌與宿主的互作提供有力的工具。目前熒光標(biāo)記細(xì)菌技術(shù)已在結(jié)核分枝桿菌、軍團(tuán)嗜肺菌、沙門氏菌、志賀氏菌等病原體中廣泛應(yīng)用，常用的標(biāo)記熒光包括綠色、紅色、藍(lán)色等。熒光蛋白作為細(xì)菌的標(biāo)記物具有多種優(yōu)勢(shì)，以綠色熒光蛋白為例，GFP于1974年從水母Aequorea victoria中被發(fā)現(xiàn)，相對(duì)分子量為31kD，已被用作多種真核和原核生物體的熒光標(biāo)志或者胞內(nèi)報(bào)告蛋白。比較于其他生物發(fā)光系統(tǒng)而言，GFP的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在當(dāng)受到藍(lán)光或紫外光激發(fā)后發(fā)出明亮綠色熒光的過程中不需要其他輔助因子，而其獨(dú)特性質(zhì)的原因來自于它的激發(fā)中心由3個(gè)氨基酸殘基(SerTyrGly)組成的環(huán)化自動(dòng)催化生色團(tuán)；然后，對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行非侵入性處理后進(jìn)行熒光檢測(cè)，GFP的表達(dá)就能夠在活細(xì)胞中被直接觀察到；再者，GFP能夠在單個(gè)細(xì)胞中被檢測(cè)和定量，這不同于其他需要較多檢測(cè)裝備的標(biāo)記示蹤系統(tǒng)。因此，我們首先構(gòu)建了GFP標(biāo)記的類鼻疽菌，以期為課題組后續(xù)類鼻疽菌基礎(chǔ)與應(yīng)用研究提供重要的手段。同時(shí)，鑒于如果宿主細(xì)胞采用了相同的顏色標(biāo)記，本文也采用同樣的技術(shù)構(gòu)建了RFP/BFP標(biāo)記的類鼻疽菌，以滿足不同實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)不同顏色熒光標(biāo)記的需求。

啟動(dòng)子對(duì)目的基因的表達(dá)至關(guān)重要。為了獲得熒光蛋白在類鼻疽菌中的高效表達(dá)，本文在前期工作中構(gòu)建了多種啟動(dòng)子序列，包括類鼻疽菌的功能基因的啟動(dòng)或者其他細(xì)菌的外源性啟動(dòng)子，但均不能有效啟動(dòng)下游熒光基因的表達(dá)甚至影響類鼻疽菌的存活，最后經(jīng)過一系列的篩選，使用了類鼻疽菌的16 S rDNA啟動(dòng)子作為重組質(zhì)粒表達(dá)的啟動(dòng)子，三種熒光蛋白才在類鼻疽菌中得到了理想表達(dá)，單個(gè)細(xì)菌在熒光顯微鏡下均呈現(xiàn)出不同顏色的明亮熒光。另外，我們改進(jìn)了外源性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入類鼻疽菌的方式，在以往的研究中均采用的是通過大腸桿菌SM10接合的方式導(dǎo)入，轉(zhuǎn)化效率低且時(shí)間長(zhǎng)；而本實(shí)驗(yàn)中改用了制備類鼻疽菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)并通過電轉(zhuǎn)的方式將重組質(zhì)粒導(dǎo)入類鼻疽菌，轉(zhuǎn)化效率高且快速。我們還對(duì)熒光標(biāo)記的類鼻疽菌進(jìn)行了生長(zhǎng)特性和遺傳穩(wěn)定性研究，結(jié)果表明，和野生型BPC006一樣，構(gòu)建的工程菌體外培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線基本一致，感染宿主細(xì)胞的特性也無差異表現(xiàn)，體外無選擇壓力下，連續(xù)傳代20代，細(xì)菌的熒光和質(zhì)粒保有率超過90%，完全滿足后續(xù)感染研究工作的需要。

自噬是宿主細(xì)胞通過自噬小體包裹胞內(nèi)病原菌并經(jīng)自噬-溶酶體途徑對(duì)病原體進(jìn)行免疫清除的一種方式，其中LC3即自噬相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3)，是自噬過程中重要且常用的標(biāo)志蛋白。我們利用RFP標(biāo)記的類鼻疽菌和GFP-LC3標(biāo)記的RAW264.7細(xì)胞的感染模型中觀察了類鼻疽菌與宿主細(xì)胞相互作用過程中自噬的變化，熒光顯微鏡下可見紅色的細(xì)菌和綠色的細(xì)胞都分外明亮，能夠明顯區(qū)分，可用于后續(xù)類鼻疽菌與宿主自噬等互作機(jī)制的相關(guān)研究。

本文構(gòu)建的熒光蛋白穩(wěn)定表達(dá)的標(biāo)記菌株除了用于細(xì)菌與宿主細(xì)胞互作的研究，如動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)類鼻疽菌如何侵入細(xì)胞以及侵入的時(shí)間、逃逸吞噬囊泡的過程、與感染宿主的胞質(zhì)免疫、傳播路徑以及胞內(nèi)增殖與宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸等以外，也可通過將熒光蛋白基因與類鼻疽菌的啟動(dòng)子進(jìn)行融合，研究已知啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)或者鑒定在特殊環(huán)境下啟動(dòng)子的活性，以及通過將熒光蛋白基因與類鼻疽菌重要致病因子基因進(jìn)行融合，研究該蛋白的定位和分泌方式等；另外，熒光標(biāo)記的類鼻疽菌還可用于抗菌藥物的篩選、抗菌活性的評(píng)價(jià)等，直觀簡(jiǎn)便快速易行。

綜上，本文構(gòu)建了多種熒光標(biāo)記的類鼻疽菌，該標(biāo)記系統(tǒng)具有高度敏感性、非侵入性熒光檢測(cè)、快速檢測(cè)和定量以及在單個(gè)活菌中檢測(cè)基因表達(dá)等優(yōu)勢(shì)。利用熒光標(biāo)記菌株，將進(jìn)一步幫助我們發(fā)現(xiàn)類鼻疽菌特殊的適應(yīng)性機(jī)制，提高對(duì)其持續(xù)性感染機(jī)理的認(rèn)識(shí)，快速高通量篩選抗菌藥物，具有較大的應(yīng)用價(jià)值。