譚 磊，佘 漢，郭寧珂，周遠(yuǎn)群，彭小勇，劉良明，李 濤，毛慶祥，胡 弋

400042 重慶，陸軍特色醫(yī)學(xué)中心：麻醉科1，野戰(zhàn)外科研究部戰(zhàn)傷休克與輸血研究室，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2

膿毒癥是一種危及生命的器官功能障礙，是由于宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)引起。而心臟是人體最重要的器官，當(dāng)膿毒癥伴隨心肌功能的嚴(yán)重?fù)p害時(shí)其死亡率可高達(dá)40%。針對(duì)膿毒癥心肌損傷，目前臨床主要治療措施包括補(bǔ)充有效血容量、抗感染等對(duì)癥處理，尚沒(méi)有確切有效的治療措施。

瑞咯啶(復(fù)方電解質(zhì)注射液Ⅱ)是一種新型的晶體液，其理論滲透濃度309 mOsmol/L，實(shí)測(cè)滲透壓290 mOsmol/kg HO，與血漿保持一致。并且瑞咯啶電解質(zhì)含量與血漿成分相近；更重要的是瑞咯啶配方中含有L-蘋(píng)果酸(330 mg/500 mL)，L-蘋(píng)果酸作為碳酸根前體，可有效減低液體中氯離子含量，降低高氯性酸中毒風(fēng)險(xiǎn)，改善預(yù)后。一項(xiàng)薈萃分析發(fā)現(xiàn)，高氯晶體液與急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)/腎衰風(fēng)險(xiǎn)顯著增加相關(guān)。蘋(píng)果酸可在肌肉中被代謝，因此與醋酸鹽類(lèi)似，比乳酸鹽更有優(yōu)勢(shì)。而對(duì)比醋酸鹽半衰期15 min，蘋(píng)果酸鹽半衰期為30～60 min，其維持時(shí)間更長(zhǎng)，更有利于改善體內(nèi)水電解質(zhì)酸堿平衡紊亂。研究顯示瑞咯啶治療失血性休克效果較乳酸林格液和醋酸林格液更佳，且在器官功能保護(hù)方面有明顯的優(yōu)勢(shì)。瑞咯啶因含有特殊成分蘋(píng)果酸能改善心肌缺血再灌注損傷，增強(qiáng)心肌收縮力，減少心肌損傷后炎性因子表達(dá)。瑞咯啶用于危重的埃博拉病毒感染的患者，可維持循環(huán)穩(wěn)定，治療效果明顯。但瑞咯啶對(duì)膿毒癥心肌損傷是否具有保護(hù)作用，目前尚不清楚。為此，本研究利用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(cecal ligation and puncture，CLP)制備大鼠膿毒癥模型，觀察瑞咯啶是否對(duì)膿毒癥大鼠心肌功能有保護(hù)作用，為膿毒癥心肌損傷提供有效的治療選擇。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

SPF級(jí)SD大鼠280只，雌雄各半，12～14周齡，體質(zhì)量200～220 g(由陸軍特色醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。瑞咯啶(Sterofundin)購(gòu)自德國(guó)B.布勞恩·梅爾桑根股份有限公司(B.Braun Melsungen AG)；乳酸林格液購(gòu)自中國(guó)四川科倫藥業(yè)股份有限公司；多巴胺注射液購(gòu)自中國(guó)亞邦醫(yī)藥股份有限公司。

1.2 膿毒癥大鼠模型制備

SD大鼠術(shù)前禁食8 h，自由飲水，根據(jù)文獻(xiàn)[11]方法制備大鼠CLP膿毒癥模型。制作模型12 h后，監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈血壓( mean arterial blood pressure，MAP)，當(dāng)MAP下降30%或以上，模型建立成功。本實(shí)驗(yàn)?zāi)摱景Y模型成功率>90%。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及設(shè)計(jì)

將SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字抽樣法平均分成4組，①假手術(shù)(Sham) 組:不做任何處理僅開(kāi)關(guān)腹；②膿毒癥(sepsis, Sep) 組：盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)制作膿毒癥模型；③常規(guī)治療(conventional treatment，Ct)組：膿毒癥模型12 h后，經(jīng)股靜脈輸注乳酸林格氏液35 mL/kg+多巴胺5～10 μg/(kg·min)3 h，同時(shí)肌注頭孢呋辛鈉100 mg/kg，維持MAP>70 mmHg；④瑞咯啶治療(malate ringer’s solution，Mr)組：在CLP建立12 h后，經(jīng)股靜脈輸注瑞咯啶35 mL/kg+多巴胺5～10 μg/(kg·min)3 h，同時(shí)肌注頭孢呋辛鈉100 mg/kg，維持MAP>70 mmHg。

實(shí)驗(yàn)分為5批進(jìn)行，第1批(

n

=8)在治療完成2 h后用于檢測(cè)大鼠心輸出量(cardiac output，CO)和肝腎功，第2批(

n

=32)在建立CLP模型前、CLP 12 h、復(fù)蘇后1 h和復(fù)蘇后2 h這4個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)心肌損傷標(biāo)志物和肝腎血流量變化情況，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)用8只大鼠不重復(fù)使用，第3批(

n

=8)在復(fù)蘇結(jié)束2 h后測(cè)MAP及動(dòng)靜脈血?dú)夥治?，?批(

n

=6)在復(fù)蘇結(jié)束后2 h取心臟組織做病理切片，第5批(

n

=16)用于觀察大鼠的存活時(shí)間和存活率。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 大鼠心輸出量(CO)、心臟指數(shù)、每搏指數(shù)及肝腎功測(cè)定 大鼠麻醉固定行頸靜脈插管，將導(dǎo)管開(kāi)口端送至右心開(kāi)口處，頸動(dòng)脈插入熱稀釋導(dǎo)管至主動(dòng)脈近心端后能觀察到導(dǎo)管明顯搏動(dòng)，連接心輸出量測(cè)定儀(CardiomaxⅢ，美國(guó))，將溫度探頭放入0 ℃冰鹽水中，待溫度探頭溫度穩(wěn)定后，經(jīng)頸靜脈快速推注0.3 mL冰鹽水，同時(shí)按下檢測(cè)按鈕記錄各組大鼠CO和心率(heart rate，HR)，根據(jù)文獻(xiàn)[12]的方法計(jì)算心臟指數(shù)(cardiac index，CI)、每搏指數(shù)(stroke index，SI)和CO等。檢測(cè)完成后經(jīng)頸靜脈插管抽靜脈血用全自動(dòng)生化儀進(jìn)行檢測(cè)谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、尿素氮(urea nitrogen，Urea)，肌酐(creatinine，Crea)。

1.4.2 大鼠心損標(biāo)志物、肝腎血流量測(cè)定 大鼠麻醉后固定于鼠板并開(kāi)腹充分暴露肝、腎器官，置于激光散斑血流量測(cè)定儀探頭正下方，器官位于激光中央；檢測(cè)肝、腎血流量，每次的測(cè)量需在器官的相同位置；軟件讀取器官血液灌注量數(shù)據(jù)并保存，采集圖片并保存；隨后采集靜脈血1 mL用全自動(dòng)生化儀進(jìn)行檢測(cè)心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)。

1.4.3 大鼠MAP及動(dòng)靜脈血?dú)鉁y(cè)定 大鼠麻醉固定后進(jìn)行股動(dòng)、靜脈插管，插管完成后連接血壓計(jì)測(cè)MAP，完成后分別抽取動(dòng)、靜脈血各1 mL用血?dú)夥治鰞x測(cè)定動(dòng)、靜脈血?dú)?，記錄血?dú)庋醴謮?pO)、血紅蛋白(Hb)、動(dòng)脈血氧飽和度(SaO)以及靜脈血氧飽和度(SvO)，根據(jù)文獻(xiàn)[13-14]的方法計(jì)算組織氧供(DO=

CI

×13.4×Hb×SaO)和氧耗[VO=

CI

×13.4×Hb×(SaO-SvO)]。

1.4.4 大鼠心臟組織HE染色 大鼠麻醉后固定，剪開(kāi)胸腔取出心臟，立即在PBS溶液中沖洗凈心腔內(nèi)血液，4%多聚甲醛溶液固定48～72 h。固定后取心尖相同部位組織切成2～3 mm厚的小塊，放置脫水盒中慢速水流沖洗過(guò)夜，隨后進(jìn)行透明、浸蠟、包埋、切片及染色處理，封片晾干后在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4.5 大鼠存活情況觀察 大鼠治療結(jié)束后結(jié)扎血管，逐層縫合傷口，放回籠內(nèi)正常飲食飲水，每30分鐘觀察1次，觀察至治療后24 h，記錄大鼠的生存狀態(tài)和存活時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以表示。多組比較進(jìn)行單因素方差分析。

P

<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瑞咯啶對(duì)膿毒癥大鼠心臟功能的影響

與Sham組比較，Sep組大鼠CO、CI、SI明顯降低；與Sep組比較，Ct組大鼠CO、CI和SI有所改善(

P

<0.05)；Mr組大鼠CO、CI和SI明顯改善，較Sep組分別增加了48.9%、52.9%和21.7%，且明顯高于Ct組(

P

<0.05)。同時(shí)Sep組大鼠血壓明顯降低，降低至70 mmHg左右；Ct組血壓稍有回升到90 mmHg左右；而Mr組血壓改善更明顯，與Sep組比較血壓增加了43.2%(

P

<0.05)。進(jìn)一步檢測(cè)了心肌損傷標(biāo)志物肌鈣蛋白T(cTnT)和乳酸脫氫酶(LDH)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sep組cTnT和LDH隨時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，說(shuō)明心肌損傷逐漸加重；Ct組cTnT稍微有所回降，但LDH仍然處于較高水平，心肌損傷無(wú)明顯緩解；與Sep組和Ct組比較，Mr組cTnT和LDH均明顯下降，說(shuō)明心肌損傷得到明顯改善。通過(guò)心臟病理切片HE染色放大20倍，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sham組大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)排列整齊；Sep組大鼠心肌細(xì)胞明顯腫脹伴空泡形成，心肌纖維排列紊亂，間隙增寬；Ct組較Sep組變化稍有改善；Mr組大鼠心肌細(xì)胞間質(zhì)水腫明顯減輕，心肌纖維排列紊亂明顯恢復(fù)，見(jiàn)圖1。提示瑞咯啶可顯著改善膿毒癥大鼠心臟功能。通過(guò)分析Ct組和Mr組多巴胺輸注量發(fā)現(xiàn)， 兩組輸注量分別是(6.25±0.71)μg·kg·min和(6.00±0.53)μg·kg·min，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)。說(shuō)明兩組的效果差異主要來(lái)自Mr復(fù)蘇液。

a：P<0.05，與Sham組比較；b：P<0.05，與Sep組比較；c：P<0.05，與Ct組比較

2.2 瑞咯啶對(duì)膿毒癥大鼠重要器官肝腎功能的影響

通過(guò)激光血流測(cè)定儀發(fā)現(xiàn)Sep組大鼠肝腎血流量明顯降低；Ct組輸注LR后即刻大鼠肝腎血流量明顯改善，但是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，肝腎血流量明顯降低，不能很好地維持在較高水平；Mr組輸注MR后肝腎血流量明顯改善，且能維持在較高水平，輸注后即刻，1、2、3 h肝腎血流量較Sep組分別增加28.4%、14.3%、49.7%、70.6%，腎血流量分別增加115.2%、109%、103.1%、108%。通過(guò)檢測(cè)ALT、AST、Crea、Urea水平發(fā)現(xiàn)，Mr輸注后顯著減輕大鼠肝腎功能損傷。檢測(cè)大鼠氧供氧耗發(fā)現(xiàn)Sep組大鼠的氧供和氧耗均顯著降低，較Sham組分別降低53.3% 和46.7%；Ct組氧供和氧耗有所改善，與Sep組比較分別增加25%和24.6%；Mr組大鼠氧供和氧耗提升明顯，與Sep組比較分別增加49.1%(

P

<0.05)和53.6%(

P

<0.05)。與此同時(shí)，大鼠血?dú)夥治鼋Y(jié)果顯示Sep組乳酸明顯增高，Ct組經(jīng)常規(guī)治療2 h后大鼠體內(nèi)乳酸水平稍減少32.1%；而經(jīng)瑞咯啶治療2 h后大鼠血?dú)馊樗崴捷^Sep組效果更明顯，減少40.6%(

P

<0.05)，見(jiàn)圖2。表明MR可通過(guò)提高肝腎等重要器官灌注改善器官功能。

a：P<0.05，與Sham組比較；b：P<0.05，與Sep組比較；c：P<0.05，與LR組比較

2.3 瑞咯啶對(duì)膿毒癥大鼠存活率和存活時(shí)間的影響

Sep組無(wú)大鼠存活至24 h；Ct組較Sep組存活時(shí)間稍有延長(zhǎng)，24 h存活率為6.25%；而Mr組大鼠生存明顯延長(zhǎng)[(17.6±6.8)h]且與Sep組比較差異明顯(

P

<0.05)，24 h存活率為31.3%，見(jiàn)圖3。

a：P<0.05，與Sham組比較；b：P<0.05，與Sep組比較

3 討論

本研究通過(guò)CLP膿毒癥大鼠模型發(fā)現(xiàn)瑞咯啶對(duì)膿毒癥所致心肌損傷有明顯的保護(hù)作用。輸注瑞咯啶后可明顯提高膿毒癥大鼠的CO、CI、SI及MAP，改善心臟功能，減輕心肌細(xì)胞間質(zhì)水腫與心肌組織損傷；改善了膿毒癥大鼠氧供、氧耗狀態(tài)，進(jìn)一步提高肝、腎等重要臟器血液灌注，改善器官功能，最終提高膿毒癥大鼠的存活率和生存時(shí)間。

膿毒癥是包括生理、生物和生化及內(nèi)環(huán)境紊亂的過(guò)度炎癥反應(yīng)綜合征，由機(jī)體對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)引起。膿毒癥和后續(xù)炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)和死亡。據(jù)全球疾病負(fù)擔(dān)研究顯示，2017年估計(jì)有4 890萬(wàn)例新發(fā)膿毒癥，死亡病例約為1 100萬(wàn)，占全球總死亡數(shù)的19.7%。膿毒癥所致的心肌損傷是引發(fā)多器官功能障礙的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是膿毒癥發(fā)生、發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)，當(dāng)膿毒癥伴隨心肌功能的嚴(yán)重?fù)p害時(shí)其死亡率可高達(dá)40%。因此尋找能夠有效保護(hù)膿毒癥心功能的措施具有極其重要的臨床意義。

根據(jù)膿毒癥的最新救治指南，針對(duì)膿毒癥首先應(yīng)進(jìn)行晶體擴(kuò)容，而目前臨床常用的晶體液乳酸林格液雖然能快速補(bǔ)充有效血容量，發(fā)揮其復(fù)蘇作用，但由于其成分單一，治療效果有限，且含有28 mmol/L的乳酸根，會(huì)加重膿毒癥后機(jī)體乳酸堆積，導(dǎo)致高乳酸血癥；其中Na131 mmol/L，明顯低于血漿Na濃度，大量輸注后易導(dǎo)致低鈉血癥；且滲透壓明顯低于血漿，膿毒癥時(shí)大量補(bǔ)充乳酸林格液結(jié)果導(dǎo)致組織水腫加重，因此復(fù)蘇效果有限。

瑞咯啶作為一種新型復(fù)蘇晶體液，近年來(lái)在圍術(shù)期的應(yīng)用中備受關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)瑞咯啶輸注后可明顯提高膿毒癥大鼠CO，較膿毒癥大鼠CO增加高達(dá)48.9%(

P

<0.01)，同時(shí)心肌細(xì)胞間質(zhì)水腫明顯減輕，心肌纖維排列紊亂明顯恢復(fù)，因此瑞咯啶對(duì)膿毒癥大鼠心功能有明顯改善有作用；更重要的是瑞咯啶含有細(xì)胞能量代謝不可或缺的中間代謝物——L-蘋(píng)果酸(330 mg/500 mL)。既往研究顯示在膿毒癥狀態(tài)下機(jī)體心肌損傷使心肌細(xì)胞線粒體功能障礙， ATP合成嚴(yán)重不足，心肌細(xì)胞能量代謝障礙，心功能障礙進(jìn)一步加重。而蘋(píng)果酸可通過(guò)蘋(píng)果酸天冬氨酸穿梭，將外源性蘋(píng)果酸通過(guò)蘋(píng)果酸-α-酮戊二酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(oxoglutarate malate carrier， OMC)通道進(jìn)入細(xì)胞線粒體內(nèi)，在蘋(píng)果酸脫氫酶的作用下生成NADH，心肌細(xì)胞中的NADH在脫氫酶的作用下，使草酰乙酸還原成蘋(píng)果酸，后者通過(guò)線粒體內(nèi)膜上的OMC進(jìn)入基質(zhì)，在基質(zhì)脫氫酶的作用下重新生成草酰乙酸和NADH；NADH 進(jìn)入電子呼吸鏈生成ATP，而基質(zhì)內(nèi)生成的草酰乙酸經(jīng)谷草轉(zhuǎn)氨酶的作用生成天冬氨酸，后者經(jīng)谷氨酸天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(aspartate glutamate carrier， AGC)轉(zhuǎn)運(yùn)出基質(zhì)再轉(zhuǎn)變成草酰乙酸，繼續(xù)進(jìn)行穿梭。因此，輸注瑞咯啶可能持續(xù)外源性補(bǔ)充蘋(píng)果酸從而增加了心肌能量合成的原材料，蘋(píng)果酸通過(guò)蘋(píng)果酸天冬氨酸穿梭持續(xù)產(chǎn)生ATP，為膿毒癥所致的損傷心肌持續(xù)供能，從而改善心肌細(xì)胞線粒體功能，改善心臟功能。與此同時(shí)蘋(píng)果酸是三羧酸循環(huán)代謝中間物，直接參與心臟線粒體能量代謝，合成ATP，調(diào)節(jié)線粒體功能，從而發(fā)揮對(duì)膿毒癥心肌損傷的保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)瑞咯啶對(duì)膿毒癥大鼠心肌損傷有重要保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其改善心肌細(xì)胞能量供應(yīng)密切相關(guān)；但其是否能改善心肌細(xì)胞線粒體功能還有待研究；而瑞咯啶在人膿毒癥中是否有效亦需進(jìn)一步研究證實(shí)。