崔 遙， 鐘 方 麗， 王 曉 林， 王 朝 勃

(吉林化工學院 化學與制藥工程學院， 吉林 吉林 132022 )

0 引 言

刺玫果是薔薇科屬植物山刺玫的成熟果實[1]，含有豐富的三萜類、黃酮類、鞣質、維生素等活性成分[2]。原花青素是一大類多酚類化合物的總稱，由于其能夠在熱酸性條件下產生花青素而被命名為原花青素[3]，抗氧化能力是維生素C的20倍、維生素E的50倍[4]，抗氧化活性物質能減少或清除自由基的氧化反應，能防治疾病、延緩衰老[5]。多糖是以醛糖或酮糖通過糖苷鍵鏈接而成的高分子化合物，又稱多聚糖[6]。刺玫果多糖能夠激活免疫系統(tǒng)，在抗疲勞[7]、抗衰老、降血脂、降血糖[8]、抗氧化、抗腫瘤[9]等方面發(fā)揮重要作用。與合成藥物相比，中草藥副作用小、安全，近年來對中草藥抗氧化成分的提取愈加重視[10-11]。

目前，國內外對刺玫果的研究多數(shù)針對完整的果實，很少將刺玫果籽和果肉分開進行研究[12]。刺玫果籽作為刺玫果加工副產物，富含大量的原花青素及刺玫果籽油，具有較高的開發(fā)價值[13]。原花青素的提取方法包括直接浸提法、有機溶劑提取法、超聲波輔助法、酶提取法以及微波輔助法[14]等。刺玫果多糖的提取方法主要有水提法、超聲波輔助法、微波輔助法[15]等。超聲波輔助法能提高提取效率，缺點是高溫會使熱敏物質分解[16]、超聲時間處理不當也會使多糖結構被破壞。本研究利用柱層析法[17]進行提取，該方法與原花青素的直接浸提法、多糖的水提法類似，均利用溶劑進行提取，在上柱前將原料與提取溶劑混合后進行超聲，該部分應用了超聲波輔助法，柱層析法用一種溶劑提取原料后，更換大極性溶劑提取另一類成分。柱層析法可同時提取兩類及以上成分，避免孤立地提取其中一類成分而造成原料和提取溶劑的浪費，而且工藝簡單，操作簡便[18]。本研究確定提取的最佳工藝參數(shù)，利用柱層析法同時提取原花青素與多糖，采用醇沉法將二者分離，并考察了刺玫果籽原花青素與多糖提取物清除羥基自由基和抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：刺玫果，安徽亳州醫(yī)藥總公司；原花青素對照品，成都曼思特生物科技有限公司；葡萄糖對照品，天津市瑞金特化學品有限公司；α-葡萄糖苷酶，上海寶曼生物科技有限公司；4-硝基苯α-D-吡喃半乳糖苷(PNPG)，北京夢怡美生物科技有限公司；阿卡波糖，西安拓豐生物科技有限公司；無水甲醇，天津市瑞金特化學品有限公司；其他試劑均為國產分析純。

主要儀器：TU-1950型紫外-可見分光光度儀，北京普析通用儀器有限責任公司；PL-9602型酶標儀，北京普朗新技術有限公司；RE-52C型旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；CHA-S型數(shù)顯恒溫振蕩器，金壇市華城開元試驗儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預處理

取刺玫果于60 ℃干燥至恒重后剝離刺玫果籽，粉碎，過80目篩得刺玫果籽粉末。

1.2.2 原花青素及多糖質量分數(shù)的測定方法

1.2.2.1 原花青素質量分數(shù)的測定

采用硫酸鐵銨-濃鹽酸法[19]。取適量原花青素對照品，無水甲醇溶解，吸取不同濃度梯度對照品溶液1 mL于10 mL容量瓶中，加入反應混合液9 mL，沸水浴加熱40 min，冰水浴冷卻15 min，正丁醇定容。以不加原花青素對照品的平行樣為空白，于550 nm處測定吸光度，繪制原花青素標準曲線(y=0.018 9x+0.006 3，R2=0.999 4)。

吸取供試品溶液1 mL于10 mL容量瓶中，按照硫酸鐵銨-濃鹽酸法，以不加供試品溶液的平行樣為空白，測定550 nm處吸光度，根據標準曲線計算供試品溶液中原花青素的質量分數(shù)。

w(原花青素)=ρ1V1f1/1 000m1

式中：w(原花青素)為供試品溶液中原花青素質量分數(shù)，mg/g；ρ1為刺玫果籽提取液中原花青素質量濃度，μg/mL；V1為原花青素提取液體積，mL；f1為稀釋倍數(shù)；m1為刺玫果籽粉末質量，g。

1.2.2.2 多糖質量分數(shù)的測定

采用苯酚-濃硫酸法[20]。取葡萄糖對照品適量，用蒸餾水配制成不同濃度梯度的對照品溶液。取對照品溶液2.0 mL 于10 mL容量瓶中，加入4%苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸7.0 mL，靜置至室溫，40 ℃水浴加熱30 min，冷卻至室溫。以不加葡萄糖對照品的平行樣為空白，于490 nm處測定吸光度，繪制葡萄糖標準曲線(y=0.053 6x-0.043 3，R2=0.999 5)。

吸取供試品溶液2 mL于10 mL容量瓶中，按照苯酚-濃硫酸法，以不加供試品溶液的平行樣為空白，于490 nm處測定吸光度，再根據標準曲線計算供試品溶液中多糖的質量分數(shù)。

w(多糖)=ρ2V2f2/1 000m2

式中：w(多糖)，為供試品溶液中多糖質量分數(shù)，mg/g；ρ2為刺玫果籽提取液中多糖的質量濃度，同μg/mL；V2為多糖提取液的體積，mL；f2為稀釋倍數(shù)；m2為刺玫果籽粉末的質量，g。

1.2.3 樣品上柱前處理工藝參數(shù)的確定

1.2.3.1 溶劑體積分數(shù)的確定

稱取12份刺玫果籽粉末，每份1.0 g，分別加入體積分數(shù)為0、20%、40%、60%、80%、100%乙醇水溶液10 mL，室溫搖床振蕩(200 r/min)1 h，6 000 r/min離心10 min，分別按照原花青素及多糖的質量分數(shù)測定方法進行測定，計算原花青素、多糖的質量分數(shù)。確定刺玫果籽原花青素、多糖的溶劑體積分數(shù)。

1.2.3.2 吸漲率和浸泡平衡時間的確定

稱取12份刺玫果籽粉末，每份1.0 g，分別加入相應配比的提取溶劑10 mL，室溫搖床振蕩(200 r/min)，浸泡時間分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h，6 000 r/min離心10 min，分別測定上清液體積，總體積(10 mL)減去上清液體積，差值即刺玫果籽原花青素與多糖的吸漲率。

在吸漲率的確定試驗中，當上清液中對應的原花青素與多糖的質量分數(shù)基本不變時所對應的時間即為浸泡平衡時間，確定原花青素與多糖的浸泡平衡時間。

1.2.3.3 超聲輔助時間的確定

稱取刺玫果籽粉末10份，每份1.0 g，分別加入相應配比的提取溶劑10 mL，室溫超聲輔助5、10、15、20、25 min后搖床振蕩(200 r/min)至浸泡平衡時間，6 000 r/min離心10 min，分別按照原花青素與多糖的質量分數(shù)測定方法進行測定，確定刺玫果籽原花青素與多糖的超聲輔助時間。

1.2.4 柱層析法分別提取及聯(lián)合提取原花青素與多糖

選取直徑為1.5 cm的玻璃層析柱，精密稱取刺玫果籽粉末5.0 g，加入原花青素的提取溶劑，即60%乙醇水溶液濕樣上柱，保持60%乙醇水溶液沒過樣品，室溫靜置至浸泡平衡時間，以1吸漲率為1個收集單位，以0.4 mL/min收集，共收集3份洗脫液，殘渣(60%乙醇水溶液洗脫3次后的刺玫果籽粉末)加入1吸漲率的60%乙醇水溶液，經超聲提取1 h，抽濾再得到1份殘渣提取液，分別測定3份洗脫液和1份殘渣提取液中原花青素的質量。同樣方法，用純水上樣，收集3份洗脫液和1份殘渣(用純水洗脫3次后的刺玫果籽粉末)提取液，分別測定3份洗脫液和1份殘渣提取液中多糖的質量。以收集的3份洗脫液和1份殘渣提取液中原花青素、多糖的質量作為100%，計算刺玫果籽中原花青素、多糖的總質量，確定提取次數(shù)。

原花青素與多糖的提取連續(xù)進行，首先提取刺玫果籽原花青素，方法與分別提取刺玫果籽原花青素相同，選取直徑為1.5 cm的玻璃層析柱，精密稱取刺玫果籽粉末5.0 g，60%乙醇水溶液濕樣上柱，保持60%乙醇水溶液沒過樣品，室溫靜置至浸泡平衡時間，以1吸漲率為1個收集單位，以0.4 mL/min的體積流量進行收集，收集3份后，洗脫液更換為多糖的提取溶劑即純水，再收集3份洗脫液。計算刺玫果籽中原花青素、多糖的質量及提取率。

提取率=mx/m0×100%

式中：mx為柱層析同時提取時原花青素、多糖洗脫液中所含相應目標成分的質量，mg；m0為分別提取時原花青素、多糖洗脫液中所含相應目標成分的總質量，mg。

1.2.5 刺玫果籽提取液中原花青素與多糖的分離及相應成分的質量分數(shù)測定

合并柱層析同時提取得到的原花青素與多糖提取液，減壓濃縮至20 mL，加80 mL無水乙醇至醇體積分數(shù)達80%，充分搖勻，冰箱4 ℃靜置過夜，6 000 r/min離心10 min，上清液為原花青素提取液，沉淀為粗多糖。將上清液與沉淀均制成干浸膏(將原花青素提取液和粗多糖沉淀干燥至恒重，呈粉末狀態(tài))，測定干浸膏中原花青素與多糖的質量分數(shù)。

刺玫果籽原花青素提取物中不僅含有原花青素，還可能含有黃酮類、皂苷類等活性成分，因此對刺玫果籽原花青素提取物中總黃酮、總皂苷的質量分數(shù)也進行測定。取原花青素干浸膏，利用硝酸鋁絡合法[21]和香草醛-濃硫酸法[22]測定原花青素干浸膏中總黃酮和總皂苷質量分數(shù)。

1.2.6 清除羥基自由基

將柱層析提取得到的原花青素與多糖干浸膏加入相應配比的提取溶劑，溶解成不同濃度梯度的溶液即供試品溶液。

取1.5 mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液1 mL 于10 mL比色管中，依次加入PBS緩沖液2 mL、蒸餾水1 mL和0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液1 mL，充分混合，加0.1% H2O21 mL，于37 ℃ 恒溫反應60 min，536 nm處測得吸光度Ap。將1 mL 0.1%的H2O2溶液替換為1 mL蒸餾水，同法測得Ab。將1 mL蒸餾水替換為1 mL質量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL的原花青素供試品溶液或質量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0 mg/mL的多糖供試品溶液，同法操作測得As。計算不同樣品對羥基自由基的清除率。將維生素C對照品配制成質量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0、1.25、1.5、1.6、1.7、2.0 mg/mL的供試品溶液，計算其對羥基自由基的清除率[23-24]。以質量濃度為橫坐標，供試品溶液對羥基自由基的清除率為縱坐標，繪制標準曲線，計算IC50。

式中：As為樣品組吸光度；Ap為對照組吸光度；Ab為本底組吸光度。

1.2.7 抑制α-葡萄糖苷酶活性

向96孔板依次加入80 μL的PBS緩沖溶液和20 μL 2.5 mmol/L的PNPG底物溶液，最后加入20 μL質量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 mg/mL的刺玫果籽原花青素供試品溶液或質量濃度為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL的多糖供試品溶液，酶標板放置在37 ℃水浴鍋中加熱10 min，加入20 μL α-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃水浴加熱1 h，100 μL 0.2 mol/L的Na2CO3終止溶液終止反應，室溫放置15 min，用酶標儀于405 nm 處測得吸光度Ay。用20 μL PBS緩沖液代替20 μL 供試品溶液，測得Ak。用20 μL PBS緩沖溶液代替20 μL α-葡萄糖苷酶溶液[25]，測得Ab。將阿卡波糖配制成質量濃度為1.010、3.006、5.010、7.014、10.020、20.050 mg/mL的供試品溶液，以質量濃度為橫坐標，供試品溶液和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率為縱坐標繪制標準曲線，計算IC50。

式中：Ak為對照組吸光度；Ay為樣品組吸光度；Ab為本底組吸光度。

2 結果與討論

2.1 樣品上柱前處理工藝參數(shù)

2.1.1 溶劑體積分數(shù)

原花青素易溶于乙醇溶液，多糖易溶于水。如圖1所示，當溶劑體積分數(shù)為60%乙醇水溶液時，提取液中原花青素質量分數(shù)達到最大值16.17 mg/g；溶劑體積分數(shù)為純水時，提取液中多糖的質量分數(shù)達到最大值62.02 mg/g，故柱層析提取時，原花青素提取溶劑選用體積分數(shù)為60%的乙醇水溶液，多糖提取溶劑選用純水。

圖1 乙醇體積分數(shù)對提取液中原花青素和 多糖質量分數(shù)的影響

2.1.2 吸漲率和浸泡平衡時間

由圖2可知，刺玫果籽粉末對60%乙醇水溶液和純水的吸收量不相同。原花青素的吸漲率為2.4 mL/g，多糖的吸漲率為2.2 mL/g，提取原花青素按照刺玫果籽粉末質量的2.4倍收集洗脫液，提取多糖按照刺玫果籽粉末質量的2.2倍收集洗脫液。

圖2 浸泡時間對提取液中原花青素和多糖 吸漲率的影響

由圖3可知，隨著浸泡時間的延長，提取液中原花青素與多糖的質量分數(shù)逐漸升高，當浸泡時間達到2 h后，提取液中原花青素的質量分數(shù)基本不再發(fā)生變化。當浸泡時間達到3 h后，提取液中多糖的質量分數(shù)基本不再發(fā)生變化。因此原花青素在層析柱中的浸泡平衡時間為2 h，多糖在層析柱中的浸泡平衡時間為3 h，在柱層析同時提取時選擇二者中時間較長者作為浸泡平衡時間，即3 h。

圖3 浸泡時間對提取液中原花青素和多糖 質量分數(shù)的影響

2.1.3 超聲輔助時間

由圖4可知，超聲輔助時間為20 min時，提取液中原花青素質量分數(shù)達到最大值19.63 mg/g；當超聲輔助時間為10 min時，提取液中多糖質量分數(shù)達到最大值93.57 mg/g。因此在柱層析提取原花青素時超聲輔助時間為20 min，柱層析提取多糖時超聲輔助時間為10 min。利用超聲波輔助法在適當時間內可提高提取液中原花青素與多糖的質量分數(shù)，這可能是由于超聲波產生的機械作用和空化效應破碎了植物細胞壁，有效成分呈游離狀態(tài)溶入提取溶劑中[26]。超聲處理時間過長，會造成原花青素與多糖結構發(fā)生破壞。

圖4 超聲輔助時間對提取液中原花青素和多 糖質量分數(shù)的影響

2.2 刺玫果籽中原花青素與多糖的柱層析法提取

根據表1數(shù)據計算可知，分別提取時，殘渣提取液中原花青素為4.70 mg，原花青素總質量為97.16 mg，前3份提取液中原花青素總提取率為95.16%；殘渣提取液中多糖為20.85 mg，多糖總質量為458.64 mg，前3份提取液中多糖總提取率為95.46%。因此原花青素、多糖均需要收集3份洗脫液。聯(lián)合提取時，3份洗脫液中原花青素和多糖提取率分別為95.08%和94.27%。柱層析法同時提取刺玫果籽中原花青素和多糖與單獨提取的提取率差別不大，證明同時提取兩種物質與單獨提取一種物質的效率幾乎相同，柱層析法具有提取效率高、節(jié)約溶劑等優(yōu)勢。

表1 提取液中原花青素、多糖的質量和提取率Tab.1 Mass and extraction rate of proanthocyanidins and polysaccharides in extract liquor

2.3 刺玫果籽中原花青素、多糖分離及干浸膏中成分的質量分數(shù)

合并柱層析同時提取得到的原花青素和多糖提取液，經過濃縮、醇沉、干燥，得到原花青素和多糖干浸膏，分別測定刺玫果籽原花青素干浸膏中原花青素、總黃酮、總皂苷的質量分數(shù)，測定刺玫果籽多糖干浸膏中多糖的質量分數(shù)。結果表明，刺玫果籽原花青素干浸膏中原花青素、總黃酮、總皂苷質量分數(shù)分別為145.3、399.4、32.7 mg/g，刺玫果籽多糖干浸膏中多糖質量分數(shù)為361.3 mg/g。

2.4 原花青素、多糖提取物對羥基自由基的清除作用

如圖5所示，刺玫果籽原花青素、多糖提取物清除羥基自由基的能力與濃度呈正相關趨勢，即提取物濃度增大，清除率也隨之增大。刺玫果籽原花青素提取物質量濃度在0.1～0.7 mg/mL線性關系良好，y=122.64x-4.985 7，R2=0.900 4，IC50=0.448 4 mg/mL；刺玫果籽多糖提取物質量濃度在0.1～1.0 mg/mL線性關系良好，y=77.152x+3.228 9，R2=0.922 2，IC50=0.606 2 mg/mL。維生素C對照品的質量濃度在0.1～2.0 mg/mL線性關系良好，y=40.411x-7.186 9，R2=0.974 3，IC50=1.415 1 mg/mL。根據IC50可知，原花青素和多糖提取物均具有清除羥基自由基的能力，均強于維生素C。

圖5 提取物對羥基自由基的清除能力Fig.5 Scavenging ability of proanthocyanidin extracts to hydroxyl radical

2.5 原花青素、多糖提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

對部分質量濃度與自由基抑制部分作線性關系曲線，計算不同質量濃度原花青素或多糖提取物的抑制率，得到劑量響應曲線，計算IC50。IC50越小說明其相應的體外活性越強。如圖6～8所示，刺玫果籽原花青素、多糖提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力與濃度呈正相關趨勢，即提取物濃度增大，抑制率也隨之增大。刺玫果籽原花青素提取物質量濃度在0.01～0.10 mg/mL線性關系良好，y=644.75x+18.083，R2=0.964 4，IC50=0.050 0 mg/mL。刺玫果籽多糖提取物質量濃度在0.05～0.70 mg/mL線性關系良好，y=34.873x+37.142，R2=0.990 2，IC50=0.369 0 mg/mL。阿卡波糖對照品的質量濃度在1.01～20.05 mg/mL線性關系良好，y=2.316 7x+26.831，R2=0.946 6，IC50=10.000 0 mg/mL。原花青素與多糖提取物的IC50均小于阿卡波糖，說明原花青素與多糖提取物均具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力，且均強于阿卡波糖。

圖6 原花青素提取物對α-葡萄糖苷酶活性 的抑制作用Fig.6 Inhibition to α-glucosidase activity by proanthocyanidins extracts

圖7 多糖提取物對α-葡萄糖苷酶活性的 抑制作用Fig.7 Inhibition to α-glucosidase activity by polysaccharides extracts

圖8 阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig.8 Inhibition to α-glucosidase activity by acarbose

3 結 論

通過柱層析法提取刺玫果籽中的原花青素與多糖，分別采用料液比為1∶2.4的60%乙醇水溶液作為原花青素的提取溶劑并超聲20 min，料液比為1∶2.2的純水作為多糖的提取溶劑并超聲10 min，同時提取時在層析柱內浸泡3 h。結果表明，柱層析法同時提取刺玫果籽中原花青素與多糖的提取率均接近95%，提取液經醇沉法進一步分離，得到刺玫果籽原花青素提取液及多糖沉淀，刺玫果籽原花青素干浸膏中原花青素、總黃酮、總皂苷的質量分數(shù)分別為145.3、399.4、32.7 mg/g，刺玫果籽多糖干浸膏中多糖的質量分數(shù)為361.3 mg/g。體外活性試驗結果表明，刺玫果籽中原花青素與多糖提取物均具有良好的清除羥基自由基的能力和抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力。常規(guī)提取方法每次只能提取一種物質，且提取溫度高、提取次數(shù)多、溶劑消耗多，而柱層析法可以同時提取2～3種物質，在提取原花青素的同時可以提取多糖，常溫即可進行、工藝簡單、節(jié)約提取溶劑，是天然產物活性成分提取的有效方法。