劉滿軍，石會(huì)麗，陳 昊，杜 君，高 蓉

（陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710018）

從上世紀(jì)70年代開(kāi)始，以松香為原料加工制成的銀屑平片在我院皮膚科臨床應(yīng)用至今，經(jīng)幾代臨床大夫及藥學(xué)科研工作者不懈努力，不斷改進(jìn)，使毒副作用不斷降低，證明療效愈來(lái)愈確切。通過(guò)研究認(rèn)為活性成分是松香酸，但由于其性質(zhì)不穩(wěn)定，藥品放置之后，松香酸會(huì)產(chǎn)生諸多變異成分，而引起病人惡心、嘔吐等不良反應(yīng)，這樣會(huì)中斷病人服藥，引起疾病反復(fù)，不僅對(duì)病人產(chǎn)生影響，還造成藥物浪費(fèi)。以上原因一直影響著這一藥物在臨床的推廣應(yīng)用，為此，設(shè)想將松香提取松香酸，并通過(guò)化學(xué)合成制備成穩(wěn)定性較好的鈉鹽，再制成直接作用于皮膚的凝膠劑或者口服制劑。因藥物的理化性質(zhì)與其生物膜的滲透性存在著相關(guān)性，所以這種相關(guān)性有助于預(yù)測(cè)藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，并為劑型設(shè)計(jì)提供指導(dǎo)[1]。但目前，尚未見(jiàn)測(cè)定松香酸鈉的油水分配系數(shù)和平衡溶解度等理化性質(zhì)的文獻(xiàn)報(bào)道，本文旨在通過(guò)采用搖瓶法[2-6]和HPLC法測(cè)定松香酸鈉[7]在不同pH值條件下的平衡溶解度和油水分配系數(shù)來(lái)推測(cè)松香酸鈉的體內(nèi)與皮膚吸收過(guò)程，并為其開(kāi)發(fā)新劑型制劑設(shè)計(jì)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-16型高效液相色譜儀（日本島津）；LC-16型泵；SIL-16型進(jìn)樣器；SPD-16型紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器；CTO-16L型柱溫箱；DGU-20A型脫氣機(jī)；Lab-Solution化學(xué)工作站；BSA224S型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)儀器有限公司）；DELTA-320型pH計(jì)（瑞士Mettler Toledo公司）；SHA-BA型水浴恒溫振蕩器（常州市中貝儀器有限公司）。

松香酸鈉原料（自制，批號(hào):20201101，純度99.0%）；松香酸鈉對(duì)照品（自制，批號(hào):20201201，純度99.82%）；H3PO4（國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司）；KH2PO4、K2HPO4，西安化學(xué)試劑廠；Na2HPO4（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；NaH2PO4、乙醇、丙酮、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇、正辛醇，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；NaOH（汕頭市西隴化工廠）；HCl、氯仿，四川西隴科學(xué)有限公司；NaCl（重慶北碚精細(xì)化工廠）；30%H2O2，河北建寧藥業(yè)有限公司，以上試劑均為分析純；水為純化水。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 溶液的配制

（1）緩沖液的配制 根據(jù)中國(guó)藥典2020版第四部通則8004[8]，配制pH值分別為1.2、2.0、5.0、6.8、7.0、7.4、8的磷酸鹽緩沖溶液。

（2）松香酸鈉對(duì)照品溶液配制 精密稱取松香酸鈉對(duì)照品3.78mg，于50mL的量瓶中，加甲醇溶解，超聲10min，定容至刻度，制得75.6μg·mL-1儲(chǔ)備溶液，備用。

（3）松香酸鈉原料儲(chǔ)備溶液配制 精密稱取松香酸鈉原料10.520mg，于100mL的量瓶中，加甲醇溶解，超聲10min，定容至刻度，制得105.2μg·mL-1儲(chǔ)備溶液，備用。

1.2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性

色譜柱 島津Shim-pack GISS C18，（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相:乙腈-0.1%甲酸（60∶40）；檢測(cè)波長(zhǎng):241nm；流速:1.0mL·min-1；柱溫:30℃；進(jìn)樣量:10μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 松香酸鈉HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of rosin acid sodium

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察[9]

在上述色譜條件下，流動(dòng)相和不同pH值緩沖溶液均對(duì)松香酸鈉的含量測(cè)定無(wú)干擾。松香酸鈉濃度（X）在1.512～378.0μg·mL-1濃度范圍與峰面積（Y）線性關(guān)系良好，線性回歸方程為Y=42659283.50X-102043.18，R2=1.00；將標(biāo)準(zhǔn)曲線末端濃度的樣品逐步稀釋進(jìn)樣，信噪比（S/N）=3.03時(shí)的濃度（8.2ng·mL-1）為檢測(cè)限，信噪比（S/N）=10.8時(shí)的濃度（27.47ng·mL-1）為定量限；低、中、高濃度（37.8、75.6、151.2μg·mL-1）對(duì)照品溶液測(cè)定結(jié)果的RSD分別為0.56%、1.21%、0.99%，說(shuō)明本方法儀器精密度良好；按照制備標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的方法制備高、中、低（154.0、75.0、9.8μg·mL-1）3個(gè)濃度的松香酸鈉溶液各3份，測(cè)定值與真實(shí)值的比值即為回收率。平均回收率為100.03%，RSD為1.92%（n=9）。

2.2 松香酸鈉原料樣品的含量測(cè)定

分別精密稱取3份樣品，制得含量約50μg·mL-1的甲醇溶液，按1.2項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，以線性方程計(jì)算含量，結(jié)果均值為99.0%（n=3）。

2.3 松香酸鈉在不同溶劑中平衡溶解度的測(cè)定

分別精密吸取5mL的不同溶劑（水、0.9%的生理鹽水、pH值分別為1.2、2.0、5.0、6.8、7.0、7.4的緩沖液，甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、三氯甲烷），于10mL具塞試管中，加適量松香酸鈉藥粉末至溶液出現(xiàn)大量不溶性白色粉末，超聲處理30min使充分濕潤(rùn)后，將此試管口密封，置于（37±0.5）℃恒溫水浴振蕩器中（轉(zhuǎn)速150r·min-1），振搖48h，使形成平衡的過(guò)飽和溶液；離心（3000r·min-1、10min）后，取上層溶液，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后，用相應(yīng)的溶媒稀釋10倍，進(jìn)樣10μL，按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算，得出松香酸鈉在水等不同溶劑中的平衡溶解度。平行測(cè)定3次，取平均值，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同溶劑中松香酸鈉平衡溶解度測(cè)定結(jié)果（x±s，n=3）Tab.1 Determination results of rosin acid sodium equilibrium solubility in different solvents（x±s，n=3）

由表1可知，松香酸鈉在不同溶劑中的平衡溶解度有很大差異，其大小排序在有機(jī)相中為：甲醇＞乙醇＞正丁醇＞丙酮＞乙酸乙酯＞氯仿；在水相中為：0.9%生理鹽水＞水＞pH值6.8緩沖液＞pH值7.0緩沖液＞pH值7.4緩沖液＞pH值1.2緩沖液＞pH值5.0緩沖液＞pH值2.0緩沖液。

2.4 松香酸鈉穩(wěn)定性影響因素實(shí)驗(yàn)考察[8]

2.4.1 高溫試驗(yàn) 依據(jù)2020版藥典四部通則9001《原料藥物與制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則》，稱取適量松香酸鈉粉末適量，置于培養(yǎng)皿中，攤成小于5mm厚的薄層，敞口分別放置于在電熱鼓風(fēng)干燥箱中，70℃加熱一定時(shí)間。精密稱取加熱后樣品一定量3份，用甲醇定容，超聲處理10min使充分溶解，配制成約40μg·mL-1的溶液，用0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液進(jìn)樣10μL，按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算。將測(cè)定值與稱量值進(jìn)行比較。

2.4.2 強(qiáng)光試驗(yàn) 依據(jù)2020版藥典四部通則9001，取適量松香酸鈉粉末，同上，將攤好樣品培養(yǎng)皿敞口置于穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)箱中，用強(qiáng)光（5000Lx）照射一定時(shí)間之后，精密稱取照射后的樣品3份，配成約40μg·mL-1的甲醇溶液，以下同“高溫試驗(yàn)”項(xiàng)下。

2.4.3 氧化試驗(yàn)[9]精密吸取105.2μg·mL-1松香酸鈉儲(chǔ)備溶液1mL和30%H2O21mL置10mL容量瓶中，充分混勻，室溫放置1h，然后用甲醇稀釋至刻度，搖勻備用。以下同“高溫試驗(yàn)”項(xiàng)下。將測(cè)定值與儲(chǔ)備液濃度進(jìn)行比較。

2.4.4 強(qiáng)酸破壞試驗(yàn)[9]精密吸取105.2μg·mL-1松香酸鈉溶液1mL和6.0M HCl 1mL置10mL容量瓶中，充分混勻，室溫放置1h，然后用NaOH 6.0M中和，最后用甲醇稀釋至刻度，以下同“高溫試驗(yàn)”項(xiàng)下。

2.4.5 強(qiáng)堿破壞實(shí)驗(yàn)[9]精密吸取105.2μg·mL-1松香酸鈉溶液1mL和6.0M NaOH 1mL置10mL容量瓶中，充分混勻，室溫放置1h，然后用6.0M HCl中和，最后用甲醇稀釋至刻度，以下同“高溫試驗(yàn)”項(xiàng)下。

2.4.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對(duì)于以上不同影響因素下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，歸納總結(jié)見(jiàn)表2。

表2 不同影響因素下松香酸鈉的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.2 Stability test results of rosin acid sodium under different influencing factors（n=3）

由表2可知，影響穩(wěn)定性的因素由大到小排序：強(qiáng)堿＞氧化劑＞高溫＞光照＞強(qiáng)酸。含量依次下降21.16%、16.35%、13.64%、9.82%、9.41%。

2.5 松香酸鈉油水分配系數(shù)的測(cè)定[9-13]

油、水相選擇 本實(shí)驗(yàn)選擇正辛醇為油相，pH值分別為1.2、2.0、5.0、6.8、7.0、7.4、8.0的緩沖液及蒸餾水為水相。

飽和油、水相的制備 吸取pH值為1.2、2.0、5.0、6.8、7.4、8.0緩沖液及蒸餾水各15mL，分別于同體積的正辛醇混合，在恒溫（37±0.5）℃下振搖48h，靜置，分層備用。上層作為飽和油相，下層作為飽和水相。

水飽和油相松香酸鈉飽和溶液的制備與濃度測(cè)定 精密吸取水飽和正辛醇溶液30mL，置具塞試管中，加入過(guò)量的松香酸鈉，先超聲30min，使充分濕潤(rùn)后，置恒溫振蕩器中，在恒溫（37±0.5）℃下振搖48h，取出、離心10min（3000r·min-1），上清液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，稀釋5倍，按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算松香酸鈉在水飽和正辛醇的濃度C0。

油水分配系數(shù)測(cè)定 精密吸取含松香酸鈉的水飽和正辛醇溶液2mL，8份，分別置5mL具塞試管中，分別加入2mL正辛醇飽和的水及正辛醇飽和的pH分別為1.2、2.0、5.0、6.8、7.0、7.4、8.0的緩沖液，將口密封后的試管放入恒溫水浴振蕩器中，在恒溫（37±0.5）℃下振搖48h，取下層水相，0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液10μL進(jìn)樣，按1.2項(xiàng)下色譜條件分析測(cè)定，依標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算松香酸鈉分配平衡時(shí)水相濃度Cw，依據(jù)P=（C0-Cw）/Cw計(jì)算油水分配系數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 松香酸鈉正辛醇在不同pH值溶液中油水分配系數(shù)（37℃，n=3）Tab.3 Oil-water partition coefficient of rosin acid sodium in the different pH value solution of octyl alcohol（37℃，n=3）

圖2為松香酸鈉在37℃正辛醇的不同pH值溶液中油水分配系數(shù)。

圖2 松香酸鈉在37℃正辛醇的不同pH值溶液中油水分配系數(shù)Fig.2 Oil-water partition coefficient of rosin acid sodium in 37℃octyl alcohol in different pH value of the solution

由表3、圖2可知，在水及pH值為1.2～8.0的磷酸緩沖液介質(zhì)中，松香酸鈉的lgP均大于0，說(shuō)明其在油相中的溶解度大于水相中的溶解度，表明其具有良好的脂溶性。

3 結(jié)論

首次建立了松香酸鈉的HPLC分析方法，本方法快速、簡(jiǎn)單、靈敏度高、精密度、重復(fù)性和回收率均符合法規(guī)要求，表明該測(cè)定方法可行。

松香酸鈉的相關(guān)物料保存時(shí)，應(yīng)密閉、避光、低溫、避強(qiáng)酸強(qiáng)堿及氧化劑。

查閱文獻(xiàn)[13,14]，測(cè)定油水分配系數(shù)的方法有：搖瓶法、HPLC法、產(chǎn)生柱法和薄層色譜法等，但屬搖瓶法是最為簡(jiǎn)單，用時(shí)短，結(jié)果準(zhǔn)確，故選用搖瓶法測(cè)定。正辛醇與多數(shù)有機(jī)溶液極性相似，其溶解度參數(shù)與生物膜參數(shù)一致，可以選用其作為模擬生物膜相的有機(jī)溶劑，故選用正辛醇-水體系測(cè)定油水分配系數(shù)（lgP），結(jié)果可知，松香酸鈉的lgP隨著pH值的增大而減小，將其制成經(jīng)皮給藥制劑時(shí)，必須對(duì)其供藥體系的pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，使之具有更好的透皮效果。隨著pH值的升高，脂溶性先增大，后減小；當(dāng)pH值在2～5時(shí)達(dá)到最大，理論上應(yīng)該與胃、十二指腸pH值較為接近，提示松香酸鈉在十二指腸內(nèi)可被吸收。

平衡溶解度和油水分配系數(shù)與在機(jī)體內(nèi)的溶解、吸收、分布、轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝等過(guò)程緊密相關(guān)，是體現(xiàn)藥物透過(guò)生物膜能力的重要參數(shù)，對(duì)預(yù)測(cè)藥物在皮膚及體內(nèi)的吸收具有重要意義[14]。因此，本次測(cè)定松香酸鈉平衡溶解度和油水分配系數(shù)，作為新制劑設(shè)計(jì)時(shí)參考。