羅貴聰，任建偉，林奮杰，羅嘉威

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是主要由動(dòng)靜脈畸形出血、動(dòng)脈瘤破裂等導(dǎo)致的常見腦血管疾病，目前在我國的發(fā)病率為每年6/10萬～10.5/10萬，致殘率、致死率較高[1]。研究發(fā)現(xiàn)，SAH發(fā)生后，氧合血紅蛋白等毒性產(chǎn)物及壞死細(xì)胞釋放的內(nèi)容物會(huì)激活腦組織炎性反應(yīng)，引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)功能缺陷[2]。有數(shù)據(jù)顯示，60%以上的SAH病人遺留有神經(jīng)功能障礙后遺癥，嚴(yán)重影響病人的日常行動(dòng)能力[3]。因此，改善SAH后病人的運(yùn)動(dòng)功能極為重要。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)中樞系統(tǒng)損傷發(fā)生時(shí)，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)在腦組織中的表達(dá)水平迅速升高，其可通過磷酸化激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信號通路，影響腦損傷后的神經(jīng)功能恢復(fù)[4-5]。Peng等[6]研究顯示，GPR30激動(dòng)劑減弱SAH大鼠神經(jīng)元凋亡的作用途徑與調(diào)控原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src(SRC)/EGFR/STAT3信號通路有關(guān)。月見草油是從月見草種子中提煉的油脂，用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)無毒、無副作用，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等各種藥理作用[7-8]。Badri等[9]研究發(fā)現(xiàn)，月見草油和電刺激相結(jié)合的療法能改善雄性大鼠坐骨神經(jīng)擠壓傷后的神經(jīng)功能，但目前月見草油在SAH中的作用尚不明確?；诖?，本研究應(yīng)用月見草油對SAH大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察大鼠運(yùn)動(dòng)功能改變及EGFR/STAT3通路激活情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠60只，體質(zhì)量190～220 g，購自上海茂生衍生物科技有限公司，許可證號：SCXK(滬)2017-0004。

1.1.2 主要試劑 月見草油(貨號：MB8809)購自上海榕柏生物技術(shù)有限公司；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號：G1120-10)購自上海信帆生物科技有限公司；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)試劑盒(貨號：KGA702C200)購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；大鼠白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(貨號：KET9001、KET9004、KET9007)購自艾美捷科技有限公司；兔源一抗EGFR抗體、STAT3抗體、磷酸化STAT3(p-STAT3)抗體、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體、二抗羊抗兔IgG(貨號：ab52894、ab68153、ab76315、ab186930、ab6721)購自Abcam公司。

1.1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀(型號：Stat Fax-2100)購自美國Awareness公司；光學(xué)顯微鏡(型號：AH-2)購自日本Olympus公司；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(型號：MG8000)購自美國Thmorgan公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及SAH大鼠模型制備 將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、SAH組及月見草油低、中、高劑量組，每組12只。SAH組及月見草油低、中、高劑量組大鼠采用頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺法建立SAH大鼠模型[10]，具體操作為：術(shù)前大鼠禁食6 h，按300 mg/kg向大鼠腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，以仰臥位固定大鼠，頸部剃毛，皮膚消毒，沿頸部中線剪開皮膚、組織，顯露出右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，在距離頸動(dòng)脈分叉部位5 mm處用血管夾阻斷頸外動(dòng)脈，于血管夾近端將頸外動(dòng)脈剪開，插入4-0單股尼龍線經(jīng)由頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入顱內(nèi)，感覺有抵抗感后繼續(xù)向前推約3 mm，刺穿大腦前動(dòng)脈與大腦中動(dòng)脈分叉處，停留15 s后撤回，結(jié)扎皮膚并縫合。假手術(shù)組大鼠在穿刺線進(jìn)入顱內(nèi)有抵抗感時(shí)立刻撤回，結(jié)扎皮膚并縫合，其余手術(shù)步驟與SAH大鼠模型建立步驟相同。手術(shù)期間大鼠體溫保持在37 ℃。

1.2.2 給藥處理 術(shù)后30 min，月見草油低、中、高劑量組大鼠分別灌胃135 mg/kg、270 mg/kg、540 mg/kg月見草油[11]，假手術(shù)組、SAH組大鼠灌胃等量生理鹽水。

1.2.3 大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能評分 造模成功后24 h，由對分組不知情的實(shí)驗(yàn)者，在安靜環(huán)境中對大鼠5 min內(nèi)自主活動(dòng)、前肢對稱性、攀籠功能、四肢對稱性、軀體感覺功能和觸須感覺進(jìn)行評估。滿分18分，評分越低，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重[12]。

1.2.4 HE染色 大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能評分結(jié)束后，每組取6只大鼠，用10%水合氯醛麻醉后將大鼠斷頭處死，冰上取腦。將腦組織置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，冠狀切片，切片厚5 μm。將切片脫蠟至水，HE染色，脫水、透明、封片，每張切片在光學(xué)顯微鏡(×400)下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察腦組織病理學(xué)變化。

1.2.5 TUNEL染色 取上述腦組織切片，脫蠟至水，使用TUNEL試劑盒進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行，每張切片在光學(xué)顯微鏡(×400)下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察細(xì)胞染色情況，統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞百分比(即凋亡率)，計(jì)算均值。

1.2.6 ELISA檢測腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平 大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能評分結(jié)束后，將每組剩余的6只大鼠用10%水合氯醛麻醉后斷頭處死，冰上取腦，分成兩份。將其中1份腦組織于冰上研磨勻漿，使用ELISA檢測試劑盒及酶標(biāo)儀檢測IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測腦組織中EGFR、p-STAT3、STAT3蛋白表達(dá)水平 將另1份腦組織置于冰上研磨勻漿，加裂解液裂解30 min，離心20 min分離上清液，二喹啉甲酸(BCA)法定量，100 ℃加熱15 min變性，取適量上清液經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用封閉液封閉1.5 h，放在一抗稀釋液(EGFR抗體、STAT3抗體、p-STAT3抗體、GAPDH抗體，1∶1 000)中4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次(每次10 min)，轉(zhuǎn)移至二抗稀釋液(羊抗兔IgG，1∶2 000)中室溫孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光顯色，掃描圖像，Image J分析蛋白條帶灰度，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度的比值。

2 結(jié) 果

2.1 月見草油對大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能評分的影響 與假手術(shù)組相比，SAH組大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能評分明顯降低(P<0.05)；與SAH組相比，月見草油低、中、高劑量組大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能評分均明顯升高(P<0.05)；隨著月見草油劑量的升高，大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能評分依次升高(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能評分比較(±s) 單位：分

2.2 月見草油對大鼠腦組織病理學(xué)變化的影響 HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常、核仁清晰、排列整齊，SAH組大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞壞死嚴(yán)重，表現(xiàn)為細(xì)胞核溶解、碎裂或消失，月見草油低、中、高劑量組大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷均有不同程度的減輕。詳見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理學(xué)變化(HE染色，×400)

2.3 月見草油對大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，SAH組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與SAH組相比，月見草油低、中、高劑量組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；隨著月見草油劑量的升高，大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率依次降低(P<0.05)。詳見圖2、表2。

圖2 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色，×200)

表2 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率比較(±s) 單位：%

2.4 月見草油對腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影響 與假手術(shù)組相比，SAH組大鼠腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯升高(P<0.05)；與SAH組相比，月見草油低、中、高劑量組大鼠腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯降低(P<0.05)；隨著月見草油劑量的升高，大鼠腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平依次降低(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較(±s) 單位：pg/mg

2.5 月見草油對腦組織中EGFR、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比，SAH組大鼠腦組織中EGFR、p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05)；與SAH組相比，月見草油低、中、高劑量組大鼠腦組織中EGFR、p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)；隨著月見草油劑量的升高，大鼠腦組織中EGFR、p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)依次降低(P<0.05)。詳見圖3、表4。

圖3 各組大鼠腦組織中EGFR、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)情況

表4 各組大鼠腦組織中EGFR、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)比較(±s)

3 討 論

SAH是常見的腦血管疾病，損傷機(jī)制復(fù)雜，會(huì)引起早期腦損傷、遲發(fā)性腦損傷、腦血管痙攣和全身炎癥反應(yīng)綜合征[13]。盧子明等[14]研究認(rèn)為，早期腦損傷對SAH病人預(yù)后有重要影響，而炎癥反應(yīng)是早期腦損傷發(fā)生的重要機(jī)制。肖剛等[15]研究認(rèn)為，抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)可改善SAH大鼠血腦屏障損傷。本研究采用頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺法建立SAH大鼠模型，結(jié)果顯示，SAH組大鼠腦組織中產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)壞死跡象，腦組織細(xì)胞凋亡率明顯升高，大鼠的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能評分明顯降低，提示SAH發(fā)生會(huì)引起炎癥反應(yīng)及腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡，造成腦損傷及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能減退，這與之前的報(bào)道結(jié)果[13]一致。SAH致死、致殘的主要原因可能是腦血管痙攣和早期腦損傷，但錢達(dá)等[16]研究認(rèn)為，許多藥物成功逆轉(zhuǎn)腦血管痙攣后，SAH的預(yù)后也沒有得到顯著改善，改善早期腦損傷會(huì)是未來治療SAH的主要目標(biāo)之一。Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，改善神經(jīng)元存活可減輕SAH誘導(dǎo)的早期腦損傷。因此，本研究旨在尋找一種能減輕炎癥反應(yīng)、降低腦細(xì)胞凋亡率的藥物，以改善SAH大鼠的早期腦損傷及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能。

月見草油是從月見草種子中提取的油脂，含有人體生長必需及人體不能合成的多種不飽和脂肪酸，能發(fā)揮抗炎、抗氧化等作用，具有較高的藥用價(jià)值，其作為中草藥常用于治療心腦血管疾病[7-8]。本研究結(jié)果顯示，使用月見草油干預(yù)SAH大鼠后，大鼠腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯降低，且IL-1β、IL-6、TNF-α水平變化與月見草油劑量有關(guān)，提示月見草油可降低SAH大鼠腦部炎癥反應(yīng)，且隨劑量升高其作用增強(qiáng)。同時(shí)，使用月見草油后，SAH大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷均有不同程度減輕，腦組織細(xì)胞凋亡率亦明顯降低，提示月見草油可以抑制腦組織細(xì)胞凋亡并減輕大腦皮層腦組織損傷，可能與腦部炎癥反應(yīng)減輕有關(guān)。以大腦皮層為主的高級中樞是調(diào)控運(yùn)動(dòng)功能的神經(jīng)系統(tǒng)。本研究結(jié)果也顯示，月見草油降低SAH大鼠大腦皮層腦組織損傷后，大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能評分明顯升高，提示月見草油能提高SAH大鼠運(yùn)動(dòng)功能，可能與抑制炎癥反應(yīng)、抑制腦組織損傷、抑制腦細(xì)胞凋亡有關(guān)。

EGFR是一種活性多肽，在上皮、間質(zhì)及神經(jīng)組織中廣泛表達(dá)，能結(jié)合配體將STAT3磷酸化激活，進(jìn)而調(diào)控通路下游多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄[18-19]。錢紅等[20-21]研究發(fā)現(xiàn)，抑制EGFR/STAT3通路可能是miR-7抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的主要作用機(jī)制，沉默EGFR可通過阻礙STAT3磷酸化抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)。龐金偉等[22]研究亦表明，STAT3通路激活可能參與SAH小鼠早期腦損傷的發(fā)生發(fā)展過程，并可能與調(diào)控SAH發(fā)生后的早期神經(jīng)炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，SAH組大鼠腦組織中EGFR、p-STAT3/STAT3蛋白水平較假手術(shù)組明顯升高，提示EGFR/STAT3通路參與SAH的發(fā)生。使用月見草油干預(yù)治療可降低SAH大鼠腦組織中EGFR、p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)，并呈劑量依賴性，提示月見草油可抑制EGFR/STAT3通路激活，并初步推測EGFR/STAT3通路激活受到抑制可能是月見草油發(fā)揮降低SAH大鼠炎癥水平、抑制腦組織損傷、抑制腦細(xì)胞凋亡、提高SAH大鼠運(yùn)動(dòng)功能等作用的機(jī)制之一。

綜上所述，月見草油能抑制EGFR/STAT3通路激活，降低炎癥水平，抑制腦細(xì)胞凋亡及腦組織損傷，恢復(fù)大鼠運(yùn)動(dòng)功能，可能為臨床改善SAH病人預(yù)后提供重要的理論參考依據(jù)。