陳其城，蔣 志，張駿鴻，葉 飛，曹立幸

檳榔堿是中藥檳榔的主要活性成分[1]，其氫溴酸化合物是檳榔堿的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。既往的研究表明，檳榔堿為M3受體激動劑，可促進(jìn)胃腸道收縮[2]。胃腸運(yùn)動不僅受腸神經(jīng)系統(tǒng)（ENS）調(diào)節(jié)，也受中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的調(diào)控。側(cè)腦室是CNS最大的腦室，通過腦脊液與腦干神經(jīng)核團(tuán)，特別是迷走神經(jīng)復(fù)合體，包括迷走運(yùn)動背核（DMV）和孤束核（NTS）有緊密的聯(lián)系[3]。經(jīng)側(cè)腦室微量注射可以了解藥物是否通過CNS發(fā)揮對胃腸運(yùn)動的作用，Kinzig等[4]使用側(cè)腦室、第四腦室、DMV等注射胃促生長激素的方式，證實了胃促生長激素通過CNS調(diào)控胃腸運(yùn)動作用。而檳榔堿是否能通過CNS調(diào)控胃腸道運(yùn)動仍不清楚。本課題組前期已經(jīng)明確氫溴酸檳榔堿有促胃腸動力作用[5-6]，并利用應(yīng)力傳感器建立了犬胃腸移行性復(fù)合運(yùn)動（MMC）的記錄方法[7]，本研究觀察氫溴酸檳榔堿側(cè)腦室給藥對犬胃腸動力的作用及其中樞調(diào)控胃腸運(yùn)動的下行通路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性12月齡健康比格犬6只，體質(zhì)量（14.0±1.0）kg，購自廣州醫(yī)藥研究總院有限公司實驗動物研究開發(fā)中心。本實驗方案通過廣東省中醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：2018003）。

1.2 實驗試劑 氫溴酸檳榔堿（中國阿拉丁公司），阿托品（美國sigma公司），丙泊酚注射液(四川國瑞藥業(yè)有限責(zé)任公司)。

1.3 主要儀器 應(yīng)力傳感器（美國Micromeasurements公 司， 型號：J2A-06-S110K-10C）導(dǎo)線連接電橋，并用Porti多通道動態(tài)和靜態(tài)測量系統(tǒng)(荷蘭TMSI公司)記錄胃腸運(yùn)動信號。不銹鋼胃瘺造管（內(nèi)孔徑2 cm×高4 cm×底盤直徑3.5 cm）。

1.4 犬胃腸運(yùn)動觀察 術(shù)前2周訓(xùn)練動物，使之適應(yīng)實驗環(huán)境。術(shù)前禁食12 h，先用丙泊酚5 mg/kg基礎(chǔ)麻醉，隨后靜脈灌流10～20 mg/(kg·h)維持麻醉。在無菌條件，氣管插管全麻下完成下列手術(shù): 1)腹部安裝胃瘺管：在賁門下4 cm胃體處安裝一個不銹鋼胃瘺管用于實驗時灌入藥物，以避免動物拒絕口服藥物。2)應(yīng)力傳感器植入：用5個高靈敏度應(yīng)力傳感器分別縫在胃體（胃竇上2 cm）、胃竇(距幽門上2 cm)、近端十二指腸(距幽門下5 cm)、近端空腸(距Treitz韌帶1 cm)及遠(yuǎn)端結(jié)腸(降結(jié)腸中部)以記錄胃腸機(jī)械收縮活動。應(yīng)力傳感器導(dǎo)線由不銹鋼套管引出體外。3）頸外靜脈插管，使用內(nèi)徑0.1 mm外徑0.15 mm硅膠管，10 U肝素鈉鹽水封管。4）側(cè)腦室、第Ⅳ腦室置管：應(yīng)用腦立體定位儀，于額頂縫、人字縫交點，旁開0.5 cm，使用顱鉆各鉆1孔，放入金屬置管（內(nèi)徑0.2 mm），置管深度1.5 cm，做側(cè)腦室置管，然后使用牙托粉固定。

1.5 干預(yù)方法 1）所有動物先觀察120 min，以記錄各組動物MMC參數(shù)。并在植入傳感器手術(shù)當(dāng)天麻醉狀態(tài)及術(shù)后1 d后清醒狀態(tài)下，在MMC曲線處于Ⅰ相時，從低劑量至高劑量依次給予側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿（1.25、2.5和5 μg，每次20 μL），每個劑量間隔至少2 h，每只動物重復(fù)2次。2）為了明確氫溴酸檳榔堿的作用是通過膽堿能神經(jīng)起作用，應(yīng)用膽堿能受體拮抗劑阿托品進(jìn)行阻斷實驗：完成上述觀察后，各組動物先記錄胃腸運(yùn)動120 min，隨后在靜脈灌流阿托品50 μg/( kg·h)的情況下，按分組給予側(cè)腦室藥物注射后再記錄60 min。3）為了明確氫溴酸檳榔堿的下行通路，進(jìn)行雙側(cè)頸迷走神經(jīng)切斷術(shù)：完成上述實驗后，待動物恢復(fù)1周后進(jìn)行雙側(cè)頸迷走神經(jīng)切斷術(shù)，于丙泊酚維持麻醉，氣管插管無菌條件下，動物取仰臥位，從左右頸總動脈仔細(xì)分離迷走神經(jīng)，使用1#絲線結(jié)扎近端和遠(yuǎn)端，分別剪去0.5 cm頸迷走神經(jīng)。按1）所述方案重復(fù)觀察。

1.6 觀察指標(biāo) 實驗時將應(yīng)力傳感器與多通道動態(tài)和靜態(tài)測量系統(tǒng)相連，記錄胃腸運(yùn)動，包括：1）MMC參數(shù)：MMC總時程及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ相時程。2）藥物的作用：計算給藥前后20 min的胃腸運(yùn)動參數(shù)：（1）收縮波頻率：收縮波頻率=收縮波次數(shù)/時間；（2）平均振幅：振幅之和/收縮波次數(shù)；（3）動力指數(shù)：單位時間收縮波振幅總和，即頻率×平均振幅。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組給藥前后比較均采用配對t檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氫溴酸檳榔堿對犬胃腸運(yùn)動的影響 應(yīng)力傳感器植入術(shù)后丙泊酚維持麻醉的情況下，犬胃體、胃竇、十二指腸、空腸和結(jié)腸收縮運(yùn)動顯著抑制，周期性MMC運(yùn)動消失，只存在無收縮運(yùn)動的Ⅰ相樣靜息期；給予側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿1.25、2.5和5 μg后，均可增強(qiáng)犬胃體、胃竇、十二指腸、空腸和結(jié)腸收縮運(yùn)動，Ⅰ相靜息期運(yùn)動模式立即轉(zhuǎn)變?yōu)棰笙鄻痈哒穹哳l率收縮模式，收縮持續(xù)5～10 min（圖1）。分別與給藥前和生理鹽水比較，除外1.25 μg的劑量，2.5 μg和5 μg的氫溴酸檳榔堿側(cè)腦室注射后，胃腸收縮動力指數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001，圖2）。

圖1 麻醉狀態(tài)下犬側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿對胃腸運(yùn)動曲線的影響

圖2 麻醉狀態(tài)下犬側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿對胃腸動力指數(shù)的影響

在MMC Ⅰ相時給予側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿1.25、2.5和5 μg，與麻醉狀態(tài)相比較，清醒狀態(tài)下給予氫溴酸檳榔堿不同劑量均可產(chǎn)生更強(qiáng)烈、更持久的收縮（圖3），與給藥前比較，較低劑量（1.25 μg）氫溴酸檳榔堿即可顯著增強(qiáng)胃體、胃竇、十二指腸和空腸收縮動力指數(shù)（均P＜0.05，圖4）。與麻醉狀態(tài)比較，清醒狀態(tài)下給予1.25 μg氫溴酸檳榔堿可使胃腸動力指數(shù)增加66.94%～132.06%。

圖3 清醒空腹?fàn)顟B(tài)下犬側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿對胃腸運(yùn)動曲線的影響

圖4 清醒空腹?fàn)顟B(tài)下犬側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿對胃腸動力指數(shù)的影響

2.2 阿托品完全阻斷側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿對犬胃腸運(yùn)動的增強(qiáng)作用 經(jīng)靜脈一次性注射阿托品50 μg/kg，并持續(xù)灌流阿托品50 μg/(kg·h)以維持胃腸運(yùn)動抑制效果（圖5）。灌流阿托品10 min后，側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿1.25、2.5和5 μg均不能增強(qiáng)胃腸收縮運(yùn)動。

圖5 阿托品完全阻斷側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿對犬胃腸運(yùn)動的增強(qiáng)作用

2.3 雙側(cè)頸迷走神經(jīng)切斷術(shù)后犬胃腸運(yùn)動情況 典型的空腹?fàn)顟B(tài)下清醒犬MMC如圖6所示，MMC主要由Ⅰ相靜息期，Ⅱ相間斷收縮期，Ⅲ相高振幅高頻率收縮期和IV相恢復(fù)期組成。胃竇Ⅲ相收縮波可向下傳播，使十二指腸、空腸甚至結(jié)腸產(chǎn)生移行性運(yùn)動。切斷犬頸雙側(cè)迷走神經(jīng)并不能廢除胃腸MMC運(yùn)動，MMC靜息和運(yùn)動交替現(xiàn)象依舊存在（圖7）。迷走神經(jīng)切斷術(shù)后，犬MMC運(yùn)動周期明顯延長，尤其是Ⅰ相持續(xù)時間顯著延長（表1），胃體和胃竇Ⅲ相收縮持續(xù)時間減少，平均收縮振幅分別由（26.74±3.37）g和（22.33±2.60）g下降至（17.42±2.18）g和（15.20±1.44）g；而十二指腸、空腸則Ⅲ相收縮與正常對照比較差異不顯著，結(jié)腸簇狀收縮間隔時間明顯延長（表1）。

表1 雙側(cè)頸迷走神經(jīng)切斷術(shù)后犬胃腸MMC運(yùn)動周期

圖6 清醒犬空腹?fàn)顟B(tài)下犬胃腸MMC曲線圖

圖7 雙側(cè)頸迷走神經(jīng)切斷術(shù)后犬胃腸MMC曲線圖

2.4 側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿對雙側(cè)頸迷走神經(jīng)切斷術(shù)后犬胃腸運(yùn)動的影響 切斷雙側(cè)頸迷走神經(jīng)后給予側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿1.25、2.5和5 μg后，均未能使胃體至結(jié)腸產(chǎn)生明顯收縮增強(qiáng)（均P＞0.05，圖8）。

圖8 側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿對雙側(cè)頸迷走神經(jīng)切斷術(shù)后犬胃腸運(yùn)動的影響

3 討論

檳榔堿是中藥檳榔主要的藥理活性成分，含量在0.1%～0.5%之間[1]，檳榔的生物堿難溶于水，檳榔堿在堿性條件下易分解為檳榔次堿和去甲檳榔堿，遇酸可以形成類似于鹽的物質(zhì)[8]，通常以結(jié)合鹽的形式存在，氫溴酸檳榔堿為其穩(wěn)定的化合物。《中國藥典2020年版》規(guī)定，以氫溴酸檳榔堿作為對照品，檢測得檳榔中檳榔堿含量不得少于0.2%。因此，大多數(shù)研究也利用氫溴酸檳榔堿研究檳榔堿的含量及藥理學(xué)活性[9-10]。

檳榔堿是我院制劑五達(dá)顆粒的主要活性成分之一，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（445.27±12.39）μg/g[11]，可能是其產(chǎn)生促胃腸動力作用的主要物質(zhì)。通過胃腸肌條離體實驗已經(jīng)證實，氫溴酸檳榔堿可以通過M3受體增強(qiáng)小鼠[2]和大鼠[5]胃腸肌條收縮運(yùn)動。利用ICC細(xì)胞缺乏的W突變小鼠證明，氫溴酸檳榔堿促進(jìn)小鼠小腸收縮的作用也與抑制電壓門控鉀離子通道，使平滑肌慢波去極化有關(guān)[6]。這些對檳榔堿的研究大多都是在組織及細(xì)胞水平完成的，使用應(yīng)力傳感器植入的方式實時記錄在體動物胃腸機(jī)械運(yùn)動能更好的反映藥物的效果[7,12]。本課題組前期研究用應(yīng)力傳感器實時記錄了比格犬[7]和小鼠[12]的胃腸機(jī)械運(yùn)動，本研究記錄麻醉及清醒狀態(tài)犬胃腸運(yùn)動的情況，其中清醒犬的MMC數(shù)據(jù)可與經(jīng)典文獻(xiàn)相互印證[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室給予氫溴酸檳榔堿可以顯著增加胃體、胃竇、十二指腸、空腸和結(jié)腸收縮運(yùn)動，表明氫溴酸檳榔堿具有中樞促胃腸動力作用。該效應(yīng)可被阿托品完全阻斷，這提示檳榔堿主要是通過迷走神經(jīng)膽堿能通路起作用的。神經(jīng)追蹤技術(shù)表明，為胃腸道提供副交感神經(jīng)支配的迷走神經(jīng)運(yùn)動神經(jīng)元起源于DMV[14]。而DMV神經(jīng)元的活動，以及迷走神經(jīng)的傳出活動，也受到來自腦干和中樞神經(jīng)系統(tǒng)高級核團(tuán)的突觸輸入的調(diào)節(jié)[15]。在麻醉條件下，DMV神經(jīng)元由持續(xù)的抑制性氨基丁酸(GABA)能輸入調(diào)節(jié)，這些抑制性輸入主要來自于鄰近的NTS[16]。丙泊酚可以激活GABA受體，產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制[17]，抑制性的GABA能神經(jīng)通過DMV支配胃腸運(yùn)動[18]，并使周期性的移行性復(fù)合運(yùn)動消失。而在丙泊酚維持麻醉的情況下，給予側(cè)腦室注射檳榔堿依然可以產(chǎn)生顯著的胃腸運(yùn)動增強(qiáng)作用，這表明GABA能神經(jīng)不參與檳榔堿的中樞效應(yīng)。

位于側(cè)腦室的迷走神經(jīng)復(fù)合體含有DMV和NTS兩個核團(tuán)，是迷走神經(jīng)傳入和傳出中樞的通路[19]，若將迷走神經(jīng)切斷，則這一通路即被阻斷，中樞對胃腸運(yùn)動的調(diào)控能力也被削弱。本實驗也證實，切斷雙側(cè)頸迷走神經(jīng)后，犬胃腸MMC周期延長，MMC II/Ⅲ相收縮期振幅、頻率和動力指數(shù)明顯下降，提示中樞迷走-迷走反射可能參與胃腸MMC的調(diào)節(jié)。而且通過手術(shù)切斷頸雙側(cè)迷走神經(jīng)阻斷其下傳通路[20]后，側(cè)腦室注射氫溴酸檳榔堿對胃腸運(yùn)動的增強(qiáng)作用也被完全阻斷，表明檳榔堿的作用是通過中樞迷走神經(jīng)復(fù)合體及其迷走-迷走反射通路實現(xiàn)的。

綜上，檳榔堿側(cè)腦室給藥可以劑量依賴性地增強(qiáng)胃體至結(jié)腸的收縮運(yùn)動，該效應(yīng)可能是通過迷走膽堿能神經(jīng)下行通路而實現(xiàn)的，但是CNS的許多核團(tuán)（如孤束核、下丘腦、迷走神經(jīng)背核、延髓極后區(qū)等）[3]以及脊髓交感神經(jīng)[21]也能通過下行通路調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動。而檳榔堿是通過中樞哪一核團(tuán)支配胃腸道動力，是否通過脊髓交感神經(jīng)通路，這仍需要后續(xù)進(jìn)一步的實驗研究。