李雪琳，王菲凡，彭丹紅

(1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院江北院區(qū) 婦產(chǎn)科，江蘇 南京 210044； 2.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009； 3.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 婦產(chǎn)科，江蘇 南京 210009)

子宮內(nèi)膜息肉(endometrial polyp，EP)是子宮內(nèi)膜局部過度增生所形成的突向?qū)m腔的贅生物，常引起異常子宮出血及不孕，可發(fā)生惡變[1]。胰島素抵抗(insulin resistance，IR)通過誘導(dǎo)高胰島素血癥激活胰島素下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路磷脂酰肌醇- 3磷酸激酶(phosphatidylinositol 3- kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)[2- 3]，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)膜細(xì)胞異常增殖和凋亡，這可能是EP發(fā)生過程中潛在的發(fā)病機(jī)制。本研究旨在通過檢測胰島素下游信號通路關(guān)鍵蛋白PI3K、Akt的表達(dá)水平，探究EP的發(fā)生與胰島素抵抗的關(guān)系，為 EP的預(yù)防、監(jiān)測及治療提供新的思路和方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年5月至2020年3月在東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院婦科門診就診發(fā)現(xiàn)宮腔異常回聲或子宮內(nèi)膜增厚且行宮腔鏡診刮術(shù)的患者100例。EP組50例，納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡<50歲伴規(guī)律月經(jīng)，彩超懷疑EP，或?qū)m腔鏡檢查組織學(xué)證實(shí)為EP者。非EP組50例，納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡<50歲伴規(guī)律月經(jīng)，宮腔鏡檢查或診刮確診無EP患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：有宮腔鏡檢查禁忌證；長期口服性激素藥物；急性生殖器官炎癥；卵巢切除史。

1.2 觀察指標(biāo)

空腹血糖(FBG)及空腹胰島素(FIN)；孕激素(P)、總睪酮(T)、泌乳素(PRL)及性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)；總膽固醇(TCHO)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL- C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL- C)；游離睪酮指數(shù)(free androgen index,FAI)：FAI=[T(nmol·L-1)×100]/SHBG(nmol·L-1)；HOMA- 胰島素抵抗指數(shù)(HOMA- insulin resistance index，HOMA- IR)：HOMA- IR =[FBG(mmol·L-1)×FIN(mIU·L-1)]/22.5，HOMA- IR≥2.69判定為IR[1]。免疫組化檢測內(nèi)膜組織PI3K及Akt蛋白的表達(dá)水平。

1.3 手術(shù)處理

兩組患者均于月經(jīng)干凈3～7 d即子宮內(nèi)膜增殖期行手術(shù)治療，EP組行宮腔鏡下內(nèi)膜息肉切除術(shù)，非EP組行宮腔鏡檢查術(shù)或診刮術(shù)，術(shù)中獲取的組織標(biāo)本均于10%福爾馬林固定后行病理檢查。

1.4 免疫組化檢測

1.4.1 實(shí)驗(yàn)材料 新鮮組織標(biāo)本固定在10%的福爾馬林中，石蠟包埋切片，冷卻成待切組織石蠟塊。采用EnVision兩步法行免疫組化檢測。

1.4.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 磷脂酰肌醇激酶(PI3Kβ)抗體(bs- 10657R)和Akt單克隆抗體(bsm- 33325M)試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。PBS緩沖液(PH7.4～7.6)配制：每袋2 000 ml規(guī)格的PBS粉劑加入2 000 ml的蒸餾水，充分溶解。二抗檢測系統(tǒng)為Dako公司通用型工作液。DAB顯色劑購自Dako公司，每毫升DAB稀釋液中加入1滴DAB濃縮液。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)步驟 石蠟包埋組織塊經(jīng)修整后，切片機(jī)切成2～4 μm的石蠟片，在46 ℃溫水中展片，黏附在防脫載玻片上，組織漂烘儀65 ℃烤片1～2 h，染色。

1.4.4 結(jié)果判讀 每份標(biāo)本制作4張切片，其中2張分別進(jìn)行2個指標(biāo)的檢測，1張作陰性對照，另外1張備用。顯微圖像結(jié)果分析：在光學(xué)顯微鏡下觀察組織切片是否著色，根據(jù)染色程度及陽性細(xì)胞百分比判定結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)和wilcoxon秩和檢驗(yàn)，應(yīng)用Pearson相關(guān)分析指標(biāo)間相關(guān)性，二元多因素Logistic回歸分析篩選EP發(fā)病危險因素，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料的比較

EP組平均年齡(35.640±6.602)歲，非EP組平均年齡(36.420±6.683)歲。兩組在超重、肥胖及腹型肥胖比例上差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，在年齡、孕次以及流產(chǎn)次數(shù)方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，在BMI、腰圍上差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 EP組與非EP組一般資料的比較

2.2 兩組血液學(xué)指標(biāo)的比較

EP組胰島素抵抗者19例(38%)，非EP組8例(16%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.861，P<0.05)。EP組FIN水平、HOMA- IR明顯高于非EP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，兩組FBG差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。兩組TG、TCHO、HDL- C、LDL- C水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。兩組T、SHBG、FAI水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),PRL、P水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表2 EP組與非EP組血糖及胰島素水平比較

表3 EP組與非EP組血脂水平的比較

表4 EP組與非EP組血清性激素水平的比較

2.3 兩組免疫組化結(jié)果比較

陰性對照內(nèi)膜組織中腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞均呈藍(lán)色(圖1 A)；PI3K蛋白主要位于腺上皮細(xì)胞包膜和包質(zhì)，陽性表現(xiàn)為胞質(zhì)棕黃色(圖1 B)；Akt蛋白主要位于腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞胞核，陽性表現(xiàn)為胞核棕黃色或棕褐色(圖1 C)。

A.PBS陰性對照；B.PI3K蛋白在內(nèi)膜組織中的表達(dá)；C.Akt蛋白在內(nèi)膜組織中的表達(dá)圖1 免疫組化染色結(jié)果(IHC免疫組化法 ×100)

EP組PI3K蛋白、Akt蛋白陽性表達(dá)率顯著高于非EP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,表5、6),PI3K、Akt蛋白表達(dá)評分高于非EP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。采用Pearson檢驗(yàn)，HOMA- IR與PI3K、Akt蛋白評分呈正相關(guān)(P<0.01)。

表5 EP組與非EP組PI3K蛋白表達(dá)情況的比較 例

表6 EP組與非EP組Akt蛋白表達(dá)情況的比較 例

3 討 論

目前有較多關(guān)于EP發(fā)生危險因素及發(fā)病機(jī)制的研究，但尚無統(tǒng)一定論。相關(guān)研究[4- 7]顯示，高齡、絕經(jīng)時間延遲、代謝綜合征、肥胖是EP發(fā)病的危險因素，孕次增加對EP的形成有一定保護(hù)作用。本研究中EP組患者超重及肥胖人數(shù)明顯增加，結(jié)論與既往研究相符。有研究[8- 9]認(rèn)為FAI是間接反映血清游離睪酮水平的良好指標(biāo)。胰島素抵抗及其誘發(fā)的高胰島素血癥可導(dǎo)致血清T增高及SHBG降低，進(jìn)而導(dǎo)致血清游離睪酮增高，為外周雌激素轉(zhuǎn)換提供更多的底物。另外，高雄激素血癥可抑制排卵，持續(xù)雌激素刺激最終導(dǎo)致子宮內(nèi)膜過度增生。

國內(nèi)外研究[10- 12]顯示，高胰島素血癥、IR與子宮內(nèi)膜異常增生性疾病的發(fā)生顯著相關(guān)。胰島素主要通過細(xì)胞膜上的胰島素受體發(fā)揮其作用[13]。PI3K/Akt通路的靶點(diǎn)是一些調(diào)節(jié)脂質(zhì)和碳水化合物代謝以及細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)鍵蛋白[14]。胰島素可通過相應(yīng)受體激活PI3K/Akt信號通路，從而影響細(xì)胞的增殖和凋亡。本研究中，EP組PI3K和Akt蛋白表達(dá)評分與陽性表達(dá)率均明顯高于非EP組(P<0.05)。隨著HOMA- IR值的升高，內(nèi)膜組織PI3K及Akt蛋白的表達(dá)評分也升高，HOMA- IR值與PI3K及Akt蛋白表達(dá)之間存在高度正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。IR通過誘導(dǎo)高胰島素血癥激活胰島素下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PI3K/Akt途徑，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)膜細(xì)胞異常增殖和凋亡，這可能是EP發(fā)生過程中的潛在發(fā)病機(jī)制。PI3K/Akt可以通過調(diào)控基因表達(dá)在細(xì)胞的存活、分化、生長、運(yùn)動和凋亡等多種生理和病理過程中起到重要作用[14]。多種生長因子和信號傳導(dǎo)復(fù)合物，包括纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、人生長因子(HGF)、血管位蛋白1(Ang1)和胰島素，都能啟動PI3K的激活過程[15]。為了進(jìn)一步明確IR、PI3K/Akt信號通路與EP之間的聯(lián)系，未來需要更嚴(yán)謹(jǐn)、細(xì)致的實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證IR及其激活的PI3K/Akt途徑究竟是通過促進(jìn)細(xì)胞增殖，還是抑制細(xì)胞凋亡，或者是加強(qiáng)細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)合成，從而促進(jìn)子EP的形成。綜上，IR和信號通路PI3K/Akt的激活是導(dǎo)致子宮內(nèi)膜局部過度增生進(jìn)而形成EP的原因之一。未來期待多中心、大樣本的研究來進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)論。