冷春濤，劉景，袁媛

(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院 口腔科，新疆 烏魯木齊 830011)

兒童恒牙齲齒易引發(fā)牙髓炎，為避免患牙發(fā)生缺失需要盡早治療[1]。牙髓組織中包含多能間充質(zhì)干細(xì)胞，其中人牙髓細(xì)胞(dental pulp cells, DPCs)包含了可分化為各種類型的牙髓干細(xì)胞,還包含成牙本質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞[2- 3]。目前關(guān)于DPCs分化和牙組織再生調(diào)節(jié)的分子機(jī)制仍不清楚。AF4/FMR2家族成員4(AF4/FMR2 family member 4, AFF4)是一種骨架延伸蛋白，可通過(guò)骨形成蛋白(bone morphogenetic protein 2, BMP2)調(diào)節(jié)人間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cells, MSCs)的成骨分化[4]。但是AFF4在年輕恒牙牙髓炎中的表達(dá)特征和對(duì)牙髓細(xì)胞成骨分化的影響并不十分清楚。本研究假設(shè)AFF4與牙髓炎患者牙髓組織缺失有關(guān)，并且AFF4在牙髓細(xì)胞的牙源性分化過(guò)程中是必不可少的。為了驗(yàn)證該假設(shè)，我們收集年輕恒牙牙髓炎患者牙髓組織，檢測(cè)AFF4的表達(dá)，并研究AFF4對(duì)牙髓細(xì)胞增殖、凋亡、分化的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床組織

牙髓樣本取自2019年1月至2020年12月在我院接受恒牙脫落手術(shù)的48例8～16歲牙髓炎患者的恒牙組織和48例8～16歲健康自然脫落的恒牙組織，以及15例自然脫落的健康成年人(34～57歲)恒牙組織。所有參與者或其監(jiān)護(hù)人均簽署了書(shū)面知情同意書(shū)，本研究獲得了我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批號(hào)20200923)。

1.2 試劑與耗材

DPCs購(gòu)于賽業(yè)生物科技有限公司。α修飾的Eagle培養(yǎng)基(a- MEM)和胎牛血清(FBS)購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。AFF4過(guò)表達(dá)載體(pcDNA3.1- AFF4，pcDNA- AFF4)和空載體(pcDNA- ctrl)均購(gòu)于上海吉瑪公司。Trizol試劑盒與Lipofectamine 3000 試劑均購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。RIPA緩沖液購(gòu)于美國(guó)Pierce公司， PrimeScript RT Regent Kit和SYBR Premix Ex Taq購(gòu)于日本TaKaRa公司。辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗兔 IgG購(gòu)于美國(guó)Jackson Immuno Research公司， SuperSignal試劑購(gòu)于美國(guó)Pierce公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit- 8, CCK- 8)試劑購(gòu)于上海KeyGEN Biotech 公司。兔抗AFF4及骨鈣蛋白(osteocalcin, OCN)、骨橋蛋白(osteopontin, OPN)、成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子(Osteoblast specific transcription factor, OSX)、肌節(jié)同源盒2(muscle segment homeobox gene 2, MSX2)、末端無(wú)同源盒5(distal- less homeobox 5, DLX5)、runt相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子2(Runt- associated transcription factor2, RUNX2)、磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde- phosphate dehydrogenase, GAPDH)及分光光度計(jì)酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Bio- Rad公司；Annexin- V- FITC/PI雙染試劑盒購(gòu)于中國(guó)江蘇凱根生物科技有限公司；DAB試劑盒購(gòu)于北京ZSGB- BIO公司。茜素紅 S 溶液購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

用a- MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)DPCs，a- MEM培養(yǎng)基中含有10% FBS、100 U·ml-1青霉素和100 mg·ml-1鏈霉素，DPCs在37 ℃含有5% CO2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)過(guò)表達(dá)載體生產(chǎn)商的說(shuō)明，使用pcDNA- AFF4和Lipofectamine 3000試劑共同轉(zhuǎn)染DPCs細(xì)胞，設(shè)為pcDNA- AFF4組；用pcDNA- ctrl和Lipofectamine 3000 試劑共同轉(zhuǎn)染DPCs細(xì)胞，設(shè)為pcDNA- ctrl組。轉(zhuǎn)染后48 h通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT- PCR)證實(shí)表達(dá)效率。

1.4 qRT- PCR 檢測(cè)AFF4、OCN、OPN、OSX、MSX2、RUNX2及DLX5的mRNA表達(dá)水平

qRT- PCR根據(jù)制造商的說(shuō)明進(jìn)行操作，應(yīng)用Trizol試劑收集DPCs或牙髓組織中的總RNA。采用PrimeScript RT Regent Kit從 1 mg RNA中反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用 SYBR Premix Ex Taq試劑盒在ABI 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行qPCR，引物序列見(jiàn)表1。選擇GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。2-ΔΔCT的計(jì)算公式如下：ΔCt= Ct目的基因-Ct內(nèi)參，記為ΔCt對(duì)照，用各組的ΔCt分別減去ΔCt對(duì)照平均，求得ΔΔCt值，再計(jì)算各組2-ΔΔCT值，即為各組中基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)AFF4、OCN、OPN、OSX、MSX2、RUNX2及DLX5的蛋白表達(dá)

收集DPCs或牙髓組織，用冷PBS洗滌兩次，然后在補(bǔ)充有蛋白酶抑制劑的RIPA 緩沖液中冰上裂解[5]。將細(xì)胞裂解液在4 ℃下15 000×g離心 15 min以去除細(xì)胞碎片。將上清液加入含有2% SDS 和 1% 2- 巰基乙醇的上樣緩沖液中， 95 ℃加熱5 min。使用SDS聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白裂解物，并使用濕轉(zhuǎn)移裝置轉(zhuǎn)移至PVDF膜。膜在室溫下用5%牛奶封閉1 h，與兔抗AFF4(1∶600)、OCN(1∶800)、OPN(1∶500)、OSX(1∶300)、MSX2(1∶600)、RUNX2(1∶500)、DLX5(1∶500)在4 ℃下過(guò)夜，然后與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗兔IgG孵育4 h。電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯示蛋白條帶，ImageJ- lab 3.0 分析條帶強(qiáng)度。ALP 活性由堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒(Beyotime biotechghai, China)測(cè)定。

1.6 免疫組化染色

牙髓組織用4%福爾馬林固定，石蠟包埋，切成3 μm 厚的切片。切片在二甲苯中常規(guī)脫蠟并在酒精梯度中再水化。在檸檬酸鈉 (pH 6.0) 或 Tris- EDTA 溶液 (pH 8.0) 中加熱 10 min回收組織抗原。用 3% H2O2封閉切片，與抗AFF4(1∶400) 進(jìn)行孵育，在4 ℃過(guò)夜。在PBS 中洗滌 3 次后，將切片與二抗在室溫下孵育 30 min。應(yīng)用 DAB 試劑盒(ZSGB- BIO，北京，中國(guó))對(duì)載玻片進(jìn)行染色。經(jīng)蘇木精復(fù)染并用中性香脂封固后，使用 Olympus BX- UCB 光場(chǎng)顯微鏡觀察組織切片。在 × 400 放大倍數(shù)下捕獲 5 個(gè)隨機(jī)場(chǎng)用于強(qiáng)度分析。使用Image- pro Plus軟件進(jìn)行半定量圖像分析。在軟件中打開(kāi)圖像，校準(zhǔn)光密度，在測(cè)量菜單中點(diǎn)擊計(jì)數(shù)/大小，選擇手動(dòng)進(jìn)入分割對(duì)話框，其中感興趣的區(qū)域設(shè)置為色相0 ～ 30、飽和度0 ～ 255、強(qiáng)度0 ～ 255；統(tǒng)計(jì)平均光密度，用其代表染色強(qiáng)度[6- 7]。

1.7 CCK- 8法檢測(cè)細(xì)胞活力

DPCs的增殖能力使用CCK- 8試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。DPCs(3 × 104個(gè)·ml-1)在相應(yīng)處理后接種在96孔板中，孵育 72 h后將細(xì)胞與 10 μl CCK- 8 溶液在37 ℃、5% CO2條件下孵育2 h。使用分光光度計(jì)酶標(biāo)儀(Bio- Rad，Hercules，CA，USA)測(cè)量 490 nm 處的光密度(OD)值。

1.8 Annexin V FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

pcDNA- AFF4組和pcDNA- ctrl組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集約 1 × 105個(gè)細(xì)胞，用冷PBS 洗滌兩次。 重懸于500 μl 結(jié)合緩沖液中，將細(xì)胞用5 μl Annexin- V- FITC 和5 μl PI在室溫下避光染色15 min。應(yīng)用FACSAria 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.9 ALP染色及ALP活性檢測(cè)

兩組DPCs在24孔培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d。細(xì)胞用冷PBS洗滌3 次，然后用ALP染色液孵育，避光30 min。ALP 活性根據(jù)試劑盒制造商提供的說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

1.10 茜素紅S染色

DPCs用牙源性培養(yǎng)基在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)3周。用 4% 多聚甲醛固定10 min，在黑暗中用茜素紅S溶液對(duì)細(xì)胞染色10 min。用PBS中的10%氯化十六烷基吡啶對(duì)被茜素紅S染色的骨結(jié)節(jié)進(jìn)行脫色，并通過(guò)測(cè)量562 nm的吸光度來(lái)定量鈣濃度。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P< 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AFF4在年輕恒牙牙髓炎患者組織中的表達(dá)特征

與健康組比較，牙髓炎組中AFF4 mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，免疫組化染色顯示AFF4在健康組牙髓組織明顯表達(dá)，在牙髓炎組中表達(dá)明顯降低(P<0.05)。年輕恒牙組AFF4 mRNA表達(dá)明顯高于成年恒牙組(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

a P<0.05A.qRT- PCR檢測(cè)年輕健康恒牙和牙髓炎牙髓組織AFF4 mRNA表達(dá)；B.蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)牙髓組織AFF4 蛋白表達(dá)；C.免疫組化染色檢測(cè)牙髓組織AFF4 蛋白的表達(dá)(蘇木精染色 ×200)，黑色箭頭表示AFF4陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域；D.qRT- PCR檢測(cè)年輕恒牙和成年恒牙牙髓組織中AFF4 mRNA的表達(dá)圖1 qRT- PCR、蛋白質(zhì)印跡法、免疫組化法檢測(cè)AFF4 在人牙髓組織中的表達(dá)

2.2 牙髓組織中AFF4與成骨分化蛋白的相關(guān)性

與健康組比較，牙髓炎組中OCN、OPN、OSX、MSX2、DLX5、RUNX2的表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；OCN、OPN、OSX、MSX2、DLX5、RUNX2的表達(dá)水平均與AFF4呈正相關(guān)(均P<0.05)。見(jiàn)圖2。

A.qRT- PCR檢測(cè)健康組和牙髓炎組中OCN、OPN、OSX、MSX2、DLX5、RUNX2 mRNA的表達(dá)水平，a與健康組比較，P<0.05；B.AFF4與OCN、OPN、OSX、MSX2、DLX5、RUNX2的相關(guān)性分析圖2 健康組和牙髓炎組中OCN、OPN、OSX、MSX2、DLX5、RUNX2 mRNA的表達(dá)水平及其與AFF4 mRNA表達(dá)的相關(guān)性

2.3 AFF4過(guò)表達(dá)對(duì)人牙髓細(xì)胞增殖能力的影響

與pcDNA- ctrl組比較，pcDNA- AFF4組AFF4蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與pcDNA- ctrl組比，pcDNA- AFF4組DPCs的增殖率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

a與pcDNA- ctrl組比較，P<0.05A.蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)AFF4的蛋白表達(dá)水平；B.CCK- 8檢測(cè)DPCs增殖率圖3 AFF4過(guò)表達(dá)對(duì)DPCs增殖率的影響

2.4 AFF4過(guò)表達(dá)對(duì)DPCs凋亡的影響

與pcDNA- ctrl組相比，pcDNA- AFF4組DPCs凋亡率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，凋亡標(biāo)志物Caspase 3和Bax/bcl- 2的表達(dá)水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

a與pcDNA- ctrl組比較，P<0.05A.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；B～D.蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Caspase 3和Bax/bcl- 2的蛋白表達(dá)水平圖4 AFF4過(guò)表達(dá)對(duì)DPCs凋亡率的影響

2.5 AFF4過(guò)表達(dá)對(duì)人牙髓細(xì)胞成骨分化的影響

ALP(牙源性分化的早期標(biāo)志物)在AFF4過(guò)表達(dá)(pcDNA- AFF4組)DPCs中明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖 5A)。茜素紅 S 染色結(jié)果和定量結(jié)果顯示，AFF4 過(guò)表達(dá)后細(xì)胞外基質(zhì)礦化增加(圖 5B)。qRT- PCR和蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，pcDNA- AFF4組牙源相關(guān)基因OCN、OPN、OSX、MSX2、RUNX2、DLX5的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)(P<0.05，表2、圖5C)。

表2 qRT- PCR檢測(cè)OCN、OPN、OSX、MSX2、RUNX2、DLX5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平

a與pcDNA- ctrl組比較，P<0.05A.ALP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ALP活性(×200)，白色箭頭表示ALP陽(yáng)性區(qū)域；B.茜素紅 S染色觀察DPCs礦化程度(×200)，白色箭頭表示茜素紅S染色陽(yáng)性區(qū)域；C.蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)OCN、OPN、OSX、MSX2、RUNX2、DLX5的蛋白表達(dá)水平圖5 AFF4過(guò)表達(dá)對(duì)DPCs成骨分化的影響

3 討 論

牙髓炎是一種影響牙髓組織的最常見(jiàn)的病理性疾病，可導(dǎo)致牙髓壞死并使牙齒喪失活力，牙質(zhì)變脆易折裂，易缺失，并且失去牙髓免疫防御反應(yīng)[6,8]。細(xì)菌感染和細(xì)菌毒素侵襲是導(dǎo)致牙髓炎發(fā)展的關(guān)鍵原因，而臨床上的常規(guī)治療方法一般為拔牙或根管治療[9]。近年來(lái)，修復(fù)缺失的牙齒組織已成為牙髓炎終極治療目標(biāo)，此領(lǐng)域的研究已受到廣泛關(guān)注，其中包括基于干細(xì)胞分化的療法[8]。牙髓被認(rèn)為是再生治療的合適來(lái)源，因?yàn)镈PCs能夠分化成包括成牙本質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞類型[10]。此外，與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞等其他來(lái)源相比，DPCs更易獲取[11]。仍需深入探討DPCs的成骨分化能力和內(nèi)在機(jī)制。

AFF4作為超延伸復(fù)合物(SEC)的支架蛋白，在RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄延伸調(diào)控中發(fā)揮重要作用[12]。AFF4主要作為轉(zhuǎn)錄激活劑進(jìn)行研究，對(duì)RNA 延伸有積極作用[13]。據(jù)報(bào)道，它與白血病、HIV 轉(zhuǎn)錄和頭頸癌有關(guān)[13- 15]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)成年恒牙牙髓組織中AFF4的表達(dá)明顯低于年輕恒牙牙髓組織，而且年輕恒牙的牙髓炎患者中AFF4表達(dá)也低于健康組；另外我們觀察到了牙髓炎組OCN、OPN、OSX、MSX2、DLX5、RUNX2的表達(dá)均降低，AFF4的表達(dá)也降低，AFF4與OCN、OPN、OSX、MSX2、DLX5、RUNX2的表達(dá)水平呈正相關(guān)。這表明AFF4與牙髓的成骨分化有關(guān)。

研究表明AFF4在DPCs的牙源性誘導(dǎo)過(guò)程中升高[16]。本研究觀察到，AFF4過(guò)表達(dá)明顯促進(jìn)成骨分化和OCN、OPN、OSX、MSX2、DLX5、RUNX2的表達(dá)。研究也證實(shí)，AFF4 的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了DPCs 中成骨分化的水平[16]。這些發(fā)現(xiàn)表明 AFF4 是DPCs牙源性分化的關(guān)鍵因素。AFF4 包含一個(gè)共同的保守 C 端同源域，該域也存在于其余 AFF 蛋白成員中，并且它具有與 SEC 其他亞基相互作用的 N 端區(qū)域。在其家族成員中，AFF4 是人體組織中分布最廣的因子，它與多種生命活動(dòng)有關(guān)[17]。為探討AFF4 對(duì)人 DPCs 成骨分化的影響，我們研究了其表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)AFF4 的表達(dá)在年輕恒牙牙髓組織中最高，而且AFF4 過(guò)表達(dá)促進(jìn)了DPCs的成骨分化。本研究還發(fā)現(xiàn)AFF4能調(diào)節(jié)DPCs細(xì)胞的增殖活性并抑制其凋亡率，表明AFF4可作為調(diào)控牙髓炎中牙髓細(xì)胞凋亡的靶點(diǎn)。

綜上所述，AFF4 在年輕恒牙牙髓炎牙髓組織中低表達(dá)，而在年輕恒牙健康牙髓組織中表達(dá)水平增加。AFF4 過(guò)表達(dá)促進(jìn) DPCs 的增殖和成骨分化，而且抑制DPCs的凋亡。支架蛋白AFF4 作為一種關(guān)鍵的表觀遺傳調(diào)節(jié)因子，在人類 DPCs 的成骨分化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。本研究可為牙髓疾病及骨修復(fù)重建的臨床治療提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。