羅佳文，潘家興，李建紅

(1.萬寧市人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，海南 萬寧 571500；2.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，海南 ?？?570216)

癲癇是由于大腦中(特別是丘腦- 皮質(zhì)系統(tǒng)和上中腦)高度同步的神經(jīng)元異常放電引起的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是缺血性腦卒中的常見并發(fā)癥之一[1]，可增加腦卒中患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)[2]。因此，研究卒中后癲癇的發(fā)病原因及易感因素具有重要意義。炎癥和細(xì)胞凋亡是缺血性腦卒中和癲癇發(fā)展的共病基礎(chǔ)[2-4]。聚集素蛋白(CLU)也被稱為載脂蛋白J，是一種多功能伴侶蛋白，參與多種組織的發(fā)育、細(xì)胞死亡和脂質(zhì)運(yùn)輸(CSF)等[5]。動(dòng)物研究表明，CLU表達(dá)降低與癲癇神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和炎癥機(jī)制有關(guān)[6]。從遺傳學(xué)機(jī)制分析，單核苷酸多態(tài)性(SNPs)可能通過改變相關(guān)基因的表達(dá)來影響疾病的易感性[7]。CLU基因位于染色體8p21- p12上，包含9個(gè)外顯子。據(jù)報(bào)道，CLUSNPs與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)，如阿爾茨海默病(AD)、帕金森病、多發(fā)性硬化和假性剝脫[7-10]。目前7個(gè)SNPs(rs9331908、rs11136000、rs867231、rs867230、rs9331888、rs9314349和rs484377)已被識(shí)別，它們參與了≥90%CLU基因突變[11]，然而CLUSNPs與腦卒中后癲癇之間的關(guān)系仍未確定。通過對(duì)國(guó)際人口數(shù)據(jù)庫(kù)和中國(guó)人口數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索發(fā)現(xiàn)，rs11136000、rs9314349和rs9331949位點(diǎn)的突變頻率相對(duì)較高。因此，本研究旨在探討CLUSNPs(rs11136000、rs9314349和rs9331949)與缺血性腦卒中后癲癇易感性的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究方案經(jīng)萬寧市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2017021)，所有參與者都提交了書面知情同意書。這項(xiàng)研究是根據(jù)《赫爾辛基宣言》進(jìn)行的。2017年1月至2021年8月，從萬寧市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的病房和門診招募缺血性腦卒中患者，通過持續(xù)超過24 h的局部神經(jīng)體征或血管源性癥狀來定義缺血性腦卒中，并通過基線腦部計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)和(或)磁共振成像(MRI)以及48～72 h后使用對(duì)比劑的腦CT來確診[12]。根據(jù)臨床癥狀(肢體抽搐、頸部僵硬等癲癇發(fā)作癥狀)和陽性腦電圖(EEG)檢查診斷卒中后癲癇[13]，最終共收集249例卒中后癲癇患者作為癲癇組，其中男137例，女112例，平均年齡(56.51±15.25)歲。另外選取250例沒有繼發(fā)癲癇的腦卒中患者作為對(duì)照組，其中男157例，女93例，平均年齡(57.32±11.24)歲。在腦卒中事件發(fā)生之前，所有病例都沒經(jīng)歷過癲癇發(fā)作。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 入院時(shí)年齡在18歲以上；(2) 漢族；(3) 急性首發(fā)缺血性腦卒中；(4) 完整的醫(yī)療和護(hù)理資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1) 短暫性腦缺血發(fā)作或原發(fā)性出血性腦卒中；(2) 既往有癲癇病史；(3) 抗癲癇藥物治療以預(yù)防癲癇發(fā)作或其他疾病(如精神病和偏頭痛)；(4) 潛在致癇性共病，包括顱內(nèi)腫瘤、腦手術(shù)史或重癥創(chuàng)傷性腦損傷、腦靜脈血栓、大型腦動(dòng)脈瘤、腦動(dòng)脈畸形、腦積水和腦血管炎。

1.2 DNA提取和基因分型

使用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生物科技)從外周血樣本中分離基因組DNA，并在基因分型前儲(chǔ)存于-80 ℃。使用SNaPshot基因分型技術(shù)(美國(guó)ABI公司)對(duì)CLU基因的3個(gè)SNPs(rs11136000、rs9314349 和 rs9331949)進(jìn)行基因分型，確定最小等位基因頻率(MAFs)分別為0.146、0.171和0.232。這些SNPs在多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和SNaPshot分析中使用的引物序列見表1。另外，隨機(jī)抽取5%的樣品進(jìn)行質(zhì)量控制。

表1 用于SNPs的多重PCR和SNaPshot引物序列

1.3 血清CLU水平檢測(cè)

使用腦卒中診斷時(shí)(癥狀發(fā)作24 h內(nèi))的血清樣本。采集靜脈血樣后在室溫下凝結(jié)30 min，然后在實(shí)驗(yàn)室離心(1 000 r·min-1，4 ℃，15 min)。采用人凝集素定量酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測(cè)定血清CLU濃度。每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)試3次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 2組患者CLU SNP基因型和等位基因分布

癲癇組與對(duì)照組rs11136000位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但是rs9314349位點(diǎn)和rs9331949位點(diǎn)基因型分布及等位基因頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。與TT基因型相比，CC基因型和TC基因型與腦卒中后癲癇風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)，而且這種影響在CC純合子中更為明顯(P<0.05)。這些結(jié)果與等位基因C的加性保護(hù)效應(yīng)相一致。

表2 癲癇組和對(duì)照組患者CLU基因型和等位基因頻率的分布 例

2.2 性別分層分析

根據(jù)性別分層，女性和男性CLUrs11136000位點(diǎn)TC/CC基因型頻率降低與腦卒中后癲癇的關(guān)系顯著(P<0.01，表3)。在男性患者中未觀察到C等位基因與腦卒中后癲癇的關(guān)系(P>0.05，表4)。

表3 rs11136000位點(diǎn)SNPs與女性腦卒中后癲癇的關(guān)系 例

表4 rs11136000位點(diǎn)SNPs與男性腦卒中后癲癇的關(guān)系 例

2.3 2組患者臨床特征和血清CLU水平比較

單因素分析顯示，癲癇組與對(duì)照組在Charlson’s共病指數(shù)>2、卒中偏側(cè)性、大動(dòng)脈粥樣硬化性腦卒中及溶栓治療方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余變量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 癲癇組與對(duì)照組患者基線臨床資料的比較

2.4 多因素Logistic回歸分析

選擇Charlson’s共病指數(shù)>2、血清CLU水平、卒中偏側(cè)性、大動(dòng)脈粥樣硬化性腦卒中、性別、年齡、溶栓治療作為自變量，納入多因素Logistic回歸模型，結(jié)果顯示，右側(cè)腦卒中、大動(dòng)脈粥樣硬化性、溶栓治療是腦卒中后癲癇易感性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，而CLU基因rs11136000位點(diǎn)TC基因型和CC基因型都是腦卒中后癲癇發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立保護(hù)因素(P<0.05)。見表6。

表6 多因素Logistic回歸分析與腦卒中后癲癇發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)的危險(xiǎn)因素

2.5 腦卒中后癲癇患者rs11136000位點(diǎn)基因型與血清CLU水平的關(guān)系

癲癇組患者血清CLU水平顯著低于對(duì)照組[66.86(54.60，82.60)μg· ml-1vs.73.10(57.70，100.50)μg· ml-1,Z=-3.619，P<0.001]。在癲癇組中CLU基因rs11136000位點(diǎn)TC/CC基因型患者(C等位基因攜帶者)血清CLU水平顯著高于TT基因型患者(Z=-3.765，P<0.05)。見圖1。

圖1 腦卒中后癲癇患者CLU基因rs11136000位點(diǎn)基因型與血清CLU水平的關(guān)系

3 討 論

研究表明，大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后垂死的海馬神經(jīng)元中的CLU mRNA和蛋白水平顯著降低[14]。此外，海馬神經(jīng)元中核CLU表達(dá)降低已被證明伴隨海馬酸誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作后廣泛的海馬細(xì)胞死亡和細(xì)胞凋亡[15]。此外，耐藥癲癇患者腦脊液中CLU水平也低于藥物反應(yīng)性癲癇患者[16]。因此，CLU可能與癲癇的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。在本研究中，我們?cè)u(píng)估了CLU基因rs11136000、rs9314349和rs9331949位點(diǎn)SNPs對(duì)腦卒中后癲癇易感性的影響，并發(fā)現(xiàn)了rs11136000位點(diǎn)CC/TC基因型和C等位基因頻率增加與缺血性腦卒中后癲癇發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈正向關(guān)聯(lián)。

CLU基因位于染色體8p21- p12上，包含9個(gè)外顯子。SNPs可能通過改變相關(guān)基因的表達(dá)來影響疾病的易感性。據(jù)報(bào)道，CLUSNPs與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)[8- 10]。CCG單倍型(rs2279590- rs11136000- rs9331888)已被成功鑒定為AD的遺傳易感性因子[17]。rs9331949 C等位基因已被證明與漢族遲發(fā)性AD風(fēng)險(xiǎn)增加顯著相關(guān)[18]。然而，CLUSNPs與腦卒中后癲癇之間的關(guān)系仍未確定。我們的研究是首次在小樣本中國(guó)漢族人群中調(diào)查CLUSNPs與腦卒中后癲癇之間的遺傳學(xué)關(guān)系，結(jié)果顯示攜帶 rs11136000位點(diǎn)C等位基因(保護(hù)性等位基因)的腦卒中患者繼發(fā)癲癇的風(fēng)險(xiǎn)較低。與上述發(fā)現(xiàn)一致的是，一項(xiàng)針對(duì)澳大利亞人群的研究中，rs11136000位點(diǎn)C等位基因的攜帶者在穹窿、腰帶、胼胝體和縱向神經(jīng)束中顯示出明顯的低白質(zhì)完整性特征，而這些區(qū)域是已知的癲癇樣放電的易感區(qū)域[19]。癲癇被認(rèn)為是一種由神經(jīng)元和(或)神經(jīng)元群之間結(jié)構(gòu)和功能連接紊亂引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。最近基于中國(guó)人群的神經(jīng)成像研究則發(fā)現(xiàn)CLU基因rs11136000位點(diǎn)SNPs對(duì)旁海馬回灰質(zhì)萎縮以及海馬的功能連接都有顯著影響[20]。上述遺傳學(xué)數(shù)據(jù)均說明CLU基因rs11136000位點(diǎn)C等位基因頻率降低與缺血性腦卒中后癲癇易感性增加有關(guān)。

此外rs11136000位點(diǎn)SNPs也與患者血清CLU水平有關(guān)。有報(bào)道稱rs11136000可能通過影響可變剪接、mRNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及隨后的蛋白質(zhì)生成而增加腦卒中后癲癇風(fēng)險(xiǎn)[21]。在本研究中rs11136000位點(diǎn)CC/TC基因型(C等位基因攜帶者)患者血清CLU水平高于TT基因型患者。CLU是人體內(nèi)一類重要的蛋白聚糖，可參與多種生物學(xué)過程，包括精子成熟、組織分化、組織重塑、膜循環(huán)、脂質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞增殖和死亡、腫瘤進(jìn)展和神經(jīng)退行性疾病等[16]。CLU通過穩(wěn)定應(yīng)激蛋白和抑制細(xì)胞凋亡從而對(duì)腦損傷有一定的保護(hù)作用。在AD小鼠模型(PDAPP小鼠)中，上調(diào)CLU表達(dá)可抑制淀粉樣蛋白沉積并增加神經(jīng)炎毒性，相關(guān)神經(jīng)炎性營(yíng)養(yǎng)不良也減少[22]。與野生型小鼠相比，CLU敲除小鼠在永久性大腦中動(dòng)脈閉塞后愈合過程中組織重塑較慢[23]。這意味著CLU基因與細(xì)胞凋亡和炎癥機(jī)制有關(guān)。此外，CLU也參與癲癇持續(xù)狀態(tài)后神經(jīng)細(xì)胞死亡過程。人CLU基因主要編碼分泌型異二聚糖蛋白。最近的研究表明，CLU可以分泌到腦脊液和循環(huán)血中[24]。Xiao等[25]通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，癲癇患者的腦脊液中CLU水平明顯降低。這與本研究結(jié)果基本一致。我們亦發(fā)現(xiàn)癲癇組患者血清CLU水平顯著低于對(duì)照組，因此我們推測(cè)，CLU水平降低可能會(huì)減弱抗凋亡效應(yīng)，從而導(dǎo)致缺血性腦卒中后腦神經(jīng)元死亡，進(jìn)而增加繼發(fā)性癲癇的發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)。與基礎(chǔ)研究證據(jù)一致，當(dāng)前研究中發(fā)現(xiàn)的CLU基因rs11136000位點(diǎn)TC/CC基因型與較高的血清CLU水平之間的正向關(guān)系進(jìn)一步支持了它們對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。

然而，在這項(xiàng)研究中，我們無法支持CLU基因rs9314349和rs9331949位點(diǎn)SNPs與腦卒中后癲癇易感性之間的聯(lián)系。這可能是由于與全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)相比，樣本量相對(duì)較小。在我們的研究中，這3個(gè)位點(diǎn)的MAF分別為0.146、0.171和0.232，而白種人的MAF報(bào)道均>0.349[19,21]。中國(guó)人群中MAF較低，因此需要更大的樣本量來檢測(cè)SNPs的小或中度遺傳效應(yīng)。在未來的研究中，通過更大的樣本量或薈萃分析可能會(huì)獲得積極的結(jié)果。

綜上，在本研究人群中，我們證實(shí)了CLU基因rs11136000位點(diǎn)TC/CC基因型分布頻率降低與缺血性腦卒中后癲癇易感性增加有關(guān)。但是本研究存在樣本量小、種族背景和病理生理異質(zhì)性等局限性，我們還需要對(duì)不同種族進(jìn)行更大樣本量的實(shí)驗(yàn)研究或薈萃分析，以闡明CLU多態(tài)性與癲癇之間的遺傳關(guān)聯(lián)。隨著對(duì)癲癇發(fā)病機(jī)制的深入了解，未來也可能會(huì)得到不同的結(jié)果。