烏凱迪，張婷婷，宋瑩，王振，李曉瑩，周明博，陳陽(yáng)燕，蔣希成

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

凝血系統(tǒng)由細(xì)胞和可溶性蛋白質(zhì)組成，正常人體的生理性凝血是在身體血管損傷部位的止血過(guò)程。而血栓形成是指人體過(guò)度凝血進(jìn)而導(dǎo)致不良心腦血管事件的過(guò)程，如心肌梗死、中風(fēng)和靜脈血栓栓塞等。

益腦通絡(luò)顆粒是經(jīng)名老中醫(yī)陳景河所擬的“中風(fēng)防治片”深入研究并更換劑型所創(chuàng)，全方由益母草、何首烏、葛根、川芎、杜仲、紅花、澤瀉7味藥組成，具有活血化瘀、祛風(fēng)通絡(luò)、益精填髓等功效。本課題組對(duì)自擬方益腦通絡(luò)顆粒進(jìn)行臨床前研究，在“上工治未病”和“未病先防、既病防變”的思想下，對(duì)健康大鼠和小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，觀察凝血四項(xiàng)以及紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)以及紅細(xì)胞壓積(HCT)指標(biāo)，以此判斷益腦通絡(luò)顆粒對(duì)于現(xiàn)實(shí)生活中部分人群存在的危險(xiǎn)致病因素的調(diào)控作用，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)打好基礎(chǔ)，同時(shí)旨在發(fā)現(xiàn)該藥物對(duì)于凝血功能異常的預(yù)防作用，從而降低由凝血功能異常導(dǎo)致中風(fēng)發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料

1.1 儀器和試藥

電子天平(上海光正醫(yī)療儀器有限公司)；注射器、剪刀、秒表、玻璃毛細(xì)管(江蘇省長(zhǎng)豐醫(yī)療實(shí)業(yè)有限公司)；全自動(dòng)血凝儀(北京普利生儀器有限公司，型號(hào)：C2000-A)；多用臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)貝克曼公司，型號(hào)：X-22R)；益腦通絡(luò)顆粒水溶液(方中各藥均購(gòu)自于哈藥集團(tuán)世一堂中藥飲片有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR雄性小鼠40只，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(遼)2020-0001。SD雄性大鼠20只，體質(zhì)量220～240 g，購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(黑)2018-003，動(dòng)物飼養(yǎng)室溫度21～25 ℃，相對(duì)濕度60%～70%，每天光照12 h，自由攝食、攝水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥

將ICR雄性小鼠隨機(jī)分為4組，分別是空白對(duì)照組、益腦通絡(luò)顆粒低劑量組(9 g/kg生藥)、益腦通絡(luò)顆粒中劑量組(18 g/kg生藥)、益腦通絡(luò)顆粒高劑量組(36 g/kg生藥)，每組5只，每天灌胃1次，每次0.4 mL，空白對(duì)照組給予等量蒸餾水，連續(xù)給藥7 d。

將SD雄性大鼠隨機(jī)分為4組，分別為空白對(duì)照組、益腦通絡(luò)顆粒低劑量組(6 g/kg生藥)、益腦通絡(luò)顆粒中劑量組(12 g/kg生藥)、益腦通絡(luò)顆粒高劑量組(24 g/kg生藥)，每組5只，每天灌胃1次，每次2 mL，空白對(duì)照組給予等量蒸餾水，連續(xù)給藥7 d。

2.2 益腦通絡(luò)顆粒對(duì)小鼠出血時(shí)間的影響

每組取小鼠5只，于末次給藥后1 h，在正常飼養(yǎng)溫度下，用剪刀在距離鼠尾約3 mm處剪去小鼠尾巴，血液自行流出后開(kāi)始計(jì)時(shí)，每隔10 s用濾紙輕拭血滴1次，直至拭后不再出血為止，停止計(jì)時(shí)，所記錄時(shí)間為出血時(shí)間[2]。

2.3 益腦通絡(luò)顆粒對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響

每組取小鼠5只，于末次給藥后1 h，在正常飼養(yǎng)溫度下，用玻璃毛細(xì)管插入小鼠眼內(nèi)眥球后靜脈叢，從血液流入玻璃毛細(xì)管開(kāi)始計(jì)時(shí)，至血液充滿(mǎn)整個(gè)毛細(xì)管為止，取出玻璃毛細(xì)管，平放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，每隔10 s折斷玻璃毛細(xì)管5 mm，并緩慢左右拉開(kāi)，觀察折斷面是否有血凝絲出現(xiàn)，重復(fù)多次，直至有血凝絲出現(xiàn)，立刻停止計(jì)時(shí)，所記錄時(shí)間為凝血時(shí)間[3]。

2.4 益腦通絡(luò)顆粒對(duì)大鼠凝血四項(xiàng)的影響

每組取大鼠5只，于末次給藥后1 h，將其麻醉，用檸檬酸鈉(9∶1)真空采血管腹主動(dòng)脈取血2 mL，放入離心機(jī)中，3 000 r/min，離心10 min，分離血漿，用全自動(dòng)血凝儀測(cè)定凝血四項(xiàng)(APTT、PT、TT、FIB)[4]指標(biāo)。

2.5 益腦通絡(luò)顆粒對(duì)大鼠血細(xì)胞分析的影響

每組取大鼠5只，于末次給藥后1 h，將其麻醉，用檸檬酸鈉(9∶1)真空采血管腹主動(dòng)脈取血2 mL，用全血自動(dòng)分析儀測(cè)定各組大鼠紅細(xì)胞、血紅蛋白以及紅細(xì)胞壓積[5]。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 益腦通絡(luò)顆粒對(duì)小鼠出血時(shí)間的影響

小鼠灌胃7 d，與空白對(duì)照組比較，益腦通絡(luò)顆粒低、中、高劑量組均可以顯著延長(zhǎng)小鼠出血時(shí)間(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 益腦通絡(luò)顆粒對(duì)小鼠出血時(shí)間的影響

3.2 益腦通絡(luò)顆粒對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響

小鼠灌胃7 d，與空白對(duì)照組比較，益腦通絡(luò)顆粒低、中、高劑量組均可以顯著延長(zhǎng)小鼠凝血時(shí)間(P<0.01)，但益腦通絡(luò)顆粒中、高劑量組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 益腦通絡(luò)顆粒對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響

3.3 益腦通絡(luò)顆粒對(duì)大鼠凝血四項(xiàng)的影響

大鼠灌胃7 d進(jìn)行凝血四項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比較，針對(duì)于APTT，益腦通絡(luò)顆粒低劑量和中劑量組存在顯著差異(P<0.01)；而高劑量組并無(wú)顯著差異(P>0.05)；在PT方面，低劑量組無(wú)顯著差異(P>0.05)，但中、高劑量組表現(xiàn)出極顯著的差異性(P<0.01)；在TT的數(shù)據(jù)上，只有中劑量組存在了顯著的差異性(P<0.05)，其他兩組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在FIB中，低劑量組存在顯著差異(P<0.05)，中劑量組和高劑量組具有極顯著的差異性(P<0.01)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明了益腦通絡(luò)顆粒具有延長(zhǎng)APTT、PT以及TT的作用，且可以降低血液中FIB，從而發(fā)揮抗凝血的作用，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 益腦通絡(luò)顆粒對(duì)大鼠APTT、PT、TT、FIB的影響

3.4 益腦通絡(luò)顆粒對(duì)大鼠血細(xì)胞的影響

經(jīng)過(guò)對(duì)灌胃后的大鼠取腹主動(dòng)脈血，進(jìn)行紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)分析。與空白對(duì)照組相比，在RBC方面，益腦通絡(luò)顆粒低劑量組和中劑量均無(wú)顯著差異(P>0.05)，而高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在HGB方面，低劑量組和中劑量組雖然在平均水平上可以看出有些變化，但兩組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高劑量組存在顯著的差異性(P<0.05)；在HCT數(shù)據(jù)上，只有高劑量組表現(xiàn)出極顯著的差異性(P<0.01)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 益腦通絡(luò)顆粒對(duì)大鼠血細(xì)胞的影響

4 討論

針對(duì)于凝血功能的重要性，在臨床上醫(yī)生常常以凝血功能檢測(cè)結(jié)果對(duì)患者進(jìn)行病情評(píng)估，凝血四項(xiàng)是臨床上常見(jiàn)評(píng)價(jià)凝血功能的檢測(cè)之一，凝血功能異常常常會(huì)導(dǎo)致瘀血。通過(guò)對(duì)小鼠出血時(shí)間和凝血時(shí)間的研究發(fā)現(xiàn)，益腦通絡(luò)顆?？梢杂行У匮娱L(zhǎng)出、凝血時(shí)間，具有顯著的活血效果。其中，研究人員通過(guò)對(duì)益母草提取物進(jìn)行抗血小板聚集實(shí)驗(yàn)，顯示該藥物對(duì)花生四烯酸和二磷酸腺苷誘導(dǎo)兔的血小板聚集具有潛在的抗聚集作用，對(duì)TNF-α的表達(dá)有抑制作用[6]。方中所用葛根具有擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集的作用，能夠防止動(dòng)脈粥樣硬化[7]。而紅花在《新修本草》中記載：“紅花治口噤不能語(yǔ), 血結(jié)及產(chǎn)后諸病?！逼涔π榛钛ń?jīng)、散瘀止痛[8]。有研究表明，紅花的有效成分可以明顯延長(zhǎng)凝血時(shí)間，抑制血小板聚集，同樣降低了血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于預(yù)防中風(fēng)起到了促進(jìn)作用[9]。CAI等[10]通過(guò)研究顯示川芎嗪可顯著降低大鼠全血黏度和血小板聚集性，此外，李力[11]通過(guò)川芎嗪對(duì)血小板進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，表明了川芎嗪具有顯著抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的能力。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)均表明，川芎也具備抗血小板聚集作用，降低血栓發(fā)生概率的功效。

相關(guān)資料顯示，中風(fēng)患者不同凝血指標(biāo)的改變或早于影像學(xué)上的改變，這些指標(biāo)的改變可進(jìn)一步激活凝血系統(tǒng)，引起抗凝、凝血、纖溶水平變化[12]。而凝血四項(xiàng)是展現(xiàn)凝血功能的主要指標(biāo)，其中APTT和PT分別反映內(nèi)源性凝血系統(tǒng)和外源性凝血系統(tǒng)的狀況；FIB是體內(nèi)參與凝血的一個(gè)重要因子，其水平升高代表著血液可能屬于高凝狀態(tài)；TT主要反映FIB轉(zhuǎn)為纖維蛋白的時(shí)間[13]。

本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)正常大鼠凝血四項(xiàng)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，益腦通絡(luò)顆粒可以明顯延長(zhǎng)大鼠的APTT、PT以及TT，表明益腦通絡(luò)顆粒能同時(shí)抑制內(nèi)源性和外源性凝血因子的活性，具有抗凝血的作用；對(duì)于FIB，益腦通絡(luò)顆粒也能使其呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，同樣起到了抗凝血作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，益腦通絡(luò)顆粒中劑量組在各項(xiàng)指標(biāo)上與空白對(duì)照組比較均呈顯著差異，為臨床用藥量提供了新思路。有研究表明紅細(xì)胞數(shù)值的異常增多，可能伴隨著血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積、血小板增多，進(jìn)一步造成頭暈、頭脹等癥狀，嚴(yán)重的可能會(huì)引起心肌梗塞、腦血栓等血栓類(lèi)疾病[14]。血紅蛋白數(shù)目的異常增多，會(huì)導(dǎo)致人體血液黏稠度上升，血管類(lèi)疾病的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)大大增加[15]。本文探討了益腦通絡(luò)顆粒對(duì)于血細(xì)胞中的紅細(xì)胞等數(shù)據(jù)的影響，通過(guò)與空白對(duì)照組相比，益腦通絡(luò)顆粒高劑量組別展現(xiàn)出較好的降低紅細(xì)胞、血紅蛋白以及紅細(xì)胞壓積的能力，對(duì)于預(yù)防凝血功能異常起到了積極的作用。

綜上所述，益腦通絡(luò)顆粒具有較好的抗凝血功能，活血化瘀功效較為顯著，同時(shí)為預(yù)防由凝血異常引起的相關(guān)疾病提供了可能。