劉宏，黃楊，張雨薇，仲麗麗，代巧妹，楊婧，倪雪妍，李冀

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

抑郁癥是一種常見的精神疾病，也是全世界殘疾的主要原因之一[1]，其主要臨床表現(xiàn)為顯著而持久的心境低落、思維遲緩、認(rèn)知功能損害[2]以及自我毫無價值感和反復(fù)出現(xiàn)的自殺念頭、食欲和體質(zhì)量顯著變化(增加或減少)等[3]。對于中醫(yī)而言，抑郁癥屬于“郁證”的統(tǒng)籌范圍。近年來中藥因其多成分、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)和毒副作用小的優(yōu)勢成為抗抑郁藥物研究中的熱點(diǎn)領(lǐng)域[4]。根據(jù)中醫(yī)對抑郁癥的病機(jī)認(rèn)識，本實(shí)驗(yàn)通過慢性輕度不可預(yù)知應(yīng)激加孤養(yǎng)(CMUS)方法建立大鼠抑郁模型，采用中藥復(fù)方金郁歡為干預(yù)方藥，選用在臨床上應(yīng)用多年并取得滿意治療效果的烏腺金絲桃和郁金、合歡花水提取物[5]進(jìn)行配伍應(yīng)用，以β-catenin信號通路為切入點(diǎn)，觀察金郁歡對小鼠海馬組織損傷修復(fù)和β-catenin蛋白的影響,從而初步探索金郁歡治療抑郁癥的作用及其機(jī)制。

1 材料

1.1 動物

清潔級ICR小鼠60只，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物生產(chǎn)許可證：SCXK(黑)2018-003。小鼠體質(zhì)量(20±2)g，鼠齡8～10周，雌雄不限，正常晝夜節(jié)律條件，溫度18～25 ℃，濕度55%～65%，自由進(jìn)食和飲水。

1.2 藥物與試劑

金郁歡湯劑，藥物組成為烏腺金絲桃30 g，郁金15 g，合歡花15 g，(購自北京同仁堂藥店，鑒定為正品)。另取單味藥烏腺金絲桃60 g，單味藥郁金30 g，單味藥合歡花30 g，烏腺金絲桃與郁金、合歡花配伍比例為2∶1∶1。提取時，用水浸泡藥材2 h，10倍量的水進(jìn)行提取后濃縮至所需體積。

鹽酸氟西汀(百憂解)(禮來制藥公司，美國)。在0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液中溶解成混合懸浮液。

Rabbit Anti-β-catenin(北京博奧森，貨號bs-23663R，lot：BA01048540)；蛋白酶抑制劑(Roche, Indianapolis, IN, USA)；Super-GL ECL 超敏發(fā)光液(艾博思生物)；Lowry蛋白測定試劑盒(Meiji Biotech,中國上海有限公司)；RT試劑盒(Novland公司)；Trizol試劑(Invitrogen公司)；TAE緩沖液、瓊脂糖等。

1.3 主要儀器

曠場實(shí)驗(yàn)裝置：一個底部方形(60 cm×60 cm×20 cm)的開箱，自制；NIKON顯微鏡(ECLIPSE-50I，日本)；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(R138，湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司)；JD-801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(捷達(dá)公司，南京)；Power PacTMHC電泳儀(bio-rad)；VE-180垂直電泳槽(天能)；DY-B1脫色搖床(上海青浦滬西儀器)等。

2 方法

2.1 動物分組及模型的建立

將60只ICR小鼠隨機(jī)分為5組：control組(Control)、model組(Model)、金郁歡(低、高)劑量組(JYH-L、JYH-H)、fluoxetine組(Fluoxetine)，每組12只。采用CMUS法，每天使用不一樣的刺激方法建立小鼠抑郁模型，采取了7種刺激方法，每天隨機(jī)選擇1種刺激，且刺激的方法不同，保持一段時間不間斷。具體刺激方法如下：(1)潮濕鼠籠，24 h;(2)固定小鼠，時間2 h;(3)在冰水(4 ℃)中游泳，時間3 min;(4)電擊小鼠足部，10 s;(5)在熱水中游泳，時間3 min;(6)夾尾，時間2 min;(7)禁水，時間24 h;(8)歪斜小鼠籠，時間24 h;(9)絕食，時間24 h。

2.2 給藥途徑及劑量

JYH-L、JYH-H組分別給予金郁歡提取物0.2 g/kg、0.8 g/kg；fluoxetine組以0.02 g/(kg·d)劑量給予氟西汀懸浮液灌胃。control組和model組小鼠灌胃等體積生理鹽水。以上各組小鼠每日給藥1次，連續(xù)給藥3周后進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

2.3 樣本制備

行為學(xué)測試后，每組6只大鼠深度麻醉后灌入400 mL生理鹽水、1 mol/L磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，然后用500 mL 4%多聚甲醛溶液固定，pH 7.4。腦組織在視神經(jīng)交叉后4 mm處，即海馬平面做冠狀切片(1.5 cm×1 cm×5 cm)。組織塊4 ℃低溫固定48 h。腦組織用石蠟包埋并切片至所需的厚度(5 mm)。

2.4 曠場實(shí)驗(yàn)(OFT)

將一個方形底部(60 cm×60 cm×20 cm)的開箱，分成36個大小相等的網(wǎng)格。用酒精去除實(shí)驗(yàn)空間的氣味后，將小鼠放置在每個象限的中心。記錄各組小鼠5 min內(nèi)在箱中水平移動得分(后腿跨越方格數(shù))和直立得分(前肢站立次數(shù))以測量探索行為。

2.5 Nissl染色觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)

將切片浸入1%甲苯胺藍(lán)溶液中染色,50 ℃ 20 min，用蒸餾水快速沖洗并分化。用蘇木精復(fù)染色，脫水后，清洗并安裝載玻片。

每只小鼠腦組織1張切片，每張切片選取10個不重疊連續(xù)高倍(×400)視野觀察，JD-801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析各組小鼠海馬CA3區(qū)尼氏小體總面積(S總)。

2.6 免疫組織化學(xué)法及Western blot法檢測β-catenin蛋白水平

將組織塊進(jìn)行梯度酒精逐級脫水(70%→80%→95%→100%)，從低濃度向高濃度脫水(各1～2 h)，二甲苯透明20～30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。

將海馬組織加RIPA裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑，離心收取總蛋白，電泳，加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)液計(jì)算蛋白含量。

2.7 RT-PCR法檢測β-catenin基因表達(dá)水平

采用Trizol-A+試劑提取各組小鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)半暗帶區(qū)總RNA，用小鼠莫洛尼白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶從RNA中合成cDNA，紫外線下電泳。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究的數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0軟件(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。組間比較采用方差分析。在方差齊性的情況下采用Bonferroni’s方法進(jìn)行兩兩比較，在方差不齊的情況下采用Welch’s方法進(jìn)行比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 曠場實(shí)驗(yàn)

與control組比較，model組水平移動得分無明顯差別(P>0.05)；與model組比較，JYH-L組、JYH-H組、fluoxetine組水平移動得分無明顯差別(P>0.05)。與control組比較，model組直立得分降低(P<0.01)；與model組比較，JYH-L組直立得分無顯著差別(P>0.05)，JYH-H組、fluoxetine組直立得分顯著增加(P<0.01)，見表1。

表1 各組小鼠探索行為得分比較

3.2 金郁歡對CMUS小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞尼氏小體S總的影響

定量分析顯示，與control組比較，model組S總顯著降低(P<0.01)；與model組比較，JYH-L組、JYH-H組上述指標(biāo)增高(P<0.05，P<0.01)，fluoxetine組上述指標(biāo)亦表現(xiàn)為增高(P<0.01)，見表2。

表2 各組小鼠海馬CA3區(qū)尼氏小體總面積比較

3.3 免疫組織化學(xué)法檢測β-catenin蛋白表達(dá)結(jié)果

光鏡下觀察到，β-catenin陽性細(xì)胞主要分布于皮質(zhì)及海馬區(qū)。DAB染色顯示，棕黃色顆粒出現(xiàn)在β-catenin陽性細(xì)胞的細(xì)胞漿，control組切片著色非常淺或不著色，見圖1。測定各組小鼠海馬陽性細(xì)胞β-catenin的IOD，IOD值大小代表蛋白陽性表達(dá)量的多少。測定結(jié)果顯示，與control組比較，model組 β-catenin 表達(dá)下降(P<0.01)；與model組比較，JYH-L組β-catenin表達(dá)升高(P<0.05)，JYH-H組β-catenin 表達(dá)顯著升高(P<0.01)，fluoxetine組β-catenin表達(dá)顯著升高(P<0.01),見表3、圖1。

表3 各組小鼠海馬β-catenin表達(dá)情況

圖1 各組小鼠海馬β-catenin表達(dá)(DAB染色,10×20)

3.4 Western blot法檢測β-catenin蛋白表達(dá)結(jié)果

結(jié)果分析顯示，與control組比較，model組小鼠海馬β-catenin蛋白含量明顯降低(P<0.01)，與model組比較，JYH-L組、JYH-H組海馬β-catenin含量明顯升高(P<0.05，P<0.01)，fluoxetine組海馬β-catenin含量明顯升高(P<0.01)，見表4。

表4 各組小鼠海馬β-catenin蛋白表達(dá)比較

3.5 RT-PCR法檢測β-catenin mRNA表達(dá)結(jié)果

結(jié)果顯示，與control組比較，model組小鼠海馬β-catenin mRNA表達(dá)降低(P<0.01)；與model組比較，JYH-L組、JYH-H組小鼠β-catenin mRNA表達(dá)均明顯升高(P<0.01)，fluoxetine組提示小鼠β-catenin mRNA表達(dá)亦明顯升高(P<0.01)，見表5。

表5 各組小鼠海馬β-catenin mRNA表達(dá)比較

4 討論

抑郁癥是一種復(fù)雜而又發(fā)作頻繁的疾病，相關(guān)研究表明與抑郁癥相關(guān)的健康狀況比其他慢性疾病有明顯的衰退[6]。隨著時代的發(fā)展，研究者越來越關(guān)注抑郁癥發(fā)展機(jī)制。然而其發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，涉及到遺傳、應(yīng)激、單胺類物質(zhì)缺乏、下丘腦-垂體-腎上腺軸(Hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)失調(diào)、免疫、內(nèi)分泌和神經(jīng)發(fā)生等多種因素[7-8]，但其中最經(jīng)典的莫過于Wnt/β-catenin學(xué)說[9]。進(jìn)化保存的Wnt/β-catenin通路啟動信號級聯(lián)，在正常胚胎發(fā)育期間和每個組織器官系統(tǒng)有機(jī)體的整個生命中都至關(guān)重要。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，Wnt信號級聯(lián)協(xié)調(diào)神經(jīng)元功能的所有方面，包括分化，突觸形成和可塑性、神經(jīng)生成和再生[10-11]。相關(guān)研究[12]表明抑郁行為與海馬組織Wnt信號通路功能紊亂有關(guān)，在wnt通路中一個很重要的因子就是β-catenin，它負(fù)責(zé)將核外應(yīng)激信號傳遞到核內(nèi)，由此可見β-catenin的表達(dá)讓整個Wnt信號通路的生物學(xué)效應(yīng)受到了影響。許多研究表明，β-catenin信號與抑郁癥的病理生理學(xué)和治療有牽連[13-14]。YANG等[15]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，通過RES治療提高了神經(jīng)營養(yǎng)因子的海馬蛋白水平以及p-β-catenin/β-catenin的相對比率，通過降低HPA軸多動性、增加BDNF表達(dá)和等離子IL-6、CRP和TNF-α濃度以及調(diào)節(jié)海馬Wnt/β-catenin通路，改善了CUMS大鼠的抑郁行為。QIN等[16]學(xué)者通過EA治療降低了β-catenin的mRNA和蛋白表達(dá)水平。隨著β-catenin表達(dá)水平逐漸降低，顯示W(wǎng)nt信號通路正逐漸從激活狀態(tài)向抑制過程移動。β-catenin的表達(dá)顯示出抗抑郁作用，表明EA可以通過Wnt/β-catenin信號通路刺激神經(jīng)生成，保護(hù)海馬神經(jīng)元免受抑郁大鼠的傷害，并在一定程度上產(chǎn)生抗抑郁作用。

近年來，中醫(yī)藥在抗抑郁方面發(fā)揮了重要作用，單獨(dú)應(yīng)用中藥或中西藥聯(lián)合應(yīng)用顯示出快速抗抑郁作用[17-18]。中醫(yī)將抑郁癥歸于“郁病”的范疇。目前主流觀點(diǎn)認(rèn)為抑郁癥的病機(jī)是肝氣郁滯、脾氣郁結(jié)。正由于身體內(nèi)部的氣機(jī)不暢，使得疾病進(jìn)一步發(fā)展從而由氣及血，最后導(dǎo)致臟腑功能失調(diào)，氣血陰陽紊亂[19]，加重了病情，所以治療上應(yīng)疏肝健脾。通過篩選發(fā)現(xiàn)，中藥合歡花具有解郁安神之功效。施學(xué)麗等[20]學(xué)者發(fā)現(xiàn)合歡花可以增加大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量，這使得大鼠海馬神經(jīng)元得到了有效的修復(fù)，改善了大鼠的抑郁行為。郁金有行氣解郁，清心涼血之功效，有研究指出郁金中的有效成分谷甾醇在抑郁癥發(fā)作過程中可以通過調(diào)節(jié)多巴胺、五羥色胺受體等，對抑郁癥產(chǎn)生的焦慮行為起到一定的緩解作用[21]。烏腺金絲桃經(jīng)李冀等[22]學(xué)者實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)其具有抗抑郁、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗炎等作用。本研究將通過此3者搭配而成的金郁歡湯劑，研究其對小鼠抑郁行為的調(diào)節(jié)是否有作用。本實(shí)驗(yàn)通過不可預(yù)見慢性刺激的方法復(fù)制抑郁動物模型，觀察金郁歡對模型動物行為學(xué)、海馬組織內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)和海馬CA3區(qū)尼氏小體總面積(S總)以及分子β-catenin蛋白的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，在曠場實(shí)驗(yàn)中，與模型組對比，金郁歡高、低劑量組小鼠的水平得分不是特別明顯，這可能與實(shí)驗(yàn)誤差有關(guān)，在日后實(shí)驗(yàn)中需特別注意此類問題，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)去除房間有可能刺激小鼠的氣味。與對照組相比，模型組小鼠直立得分降低，與模型組比較，金郁歡組直立得分升高，說明藥物治療在一定程度上改善了抑郁造成的快感缺失[23]，增強(qiáng)了小鼠活動的積極性。

有相關(guān)研究表明藥物的定期日常治療可以有效地改善接受CUMS程序的小鼠的行為改變[24]。慢性應(yīng)激還會引起神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)改變，降低細(xì)胞內(nèi)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子水平，從而導(dǎo)致抑郁癥發(fā)生[25]。Nissl染色也顯示，與模型組比較，JYH-H組與fluoxetine組海馬組織中神經(jīng)元細(xì)胞面積范圍更大，尼氏小體總面積有所增高。尼氏小體面積的增大可以看出金郁歡對海馬神經(jīng)元的保護(hù)起到了一定的作用，修復(fù)了部分受損神經(jīng)元。這與有關(guān)研究的結(jié)果具有一致性[26]。因此可以假設(shè)，外界的應(yīng)激影響了Wnt/β-catenin信號通路，這使得神經(jīng)系統(tǒng)的活性受到了影響，然后改變了海馬區(qū)的神經(jīng)功能，從而導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生不同程度的抑郁和焦慮樣行為。但JYH-L組的尼氏小體變化不大，提示我們需要注意金郁歡復(fù)方劑量的問題，低劑量的金郁歡對小鼠腦組織結(jié)構(gòu)的影響不是特別明顯，免疫組織化學(xué)檢測和Western Blot法中也顯示，與模型組對比，JYH-H組與fluoxetine組β-catenin表達(dá)顯著升高(P<0.01)。利用RT-PCR法檢測β-catenin mRNA表達(dá)的結(jié)果也同樣顯示出，與model組比較，其余3組用藥組β-cateninmRNA表達(dá)均明顯升高。LI等[27]人的研究中發(fā)現(xiàn)，在Wnt信號出現(xiàn)后，β-catenin表達(dá)水平顯著升高，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也是符合的。本研究表明金郁歡抗抑郁的作用可能與β-catenin上調(diào)有關(guān)，影響了β-catenin蛋白表達(dá)水平，從而影響抑郁癥的發(fā)生發(fā)展，這也為臨床用藥提供了一個新的思路。

總之，金郁歡復(fù)方的應(yīng)用可以提高抑郁性失眠動物自主活動和主動探索陌生環(huán)境的能力，使得抑郁小鼠腦內(nèi)海馬組織形態(tài)及功能得到了明顯改善，保護(hù)了海馬神經(jīng)元細(xì)胞，提高腦內(nèi)β-catenin蛋白的表達(dá)水平，從而發(fā)揮改善抑郁行為功效的能力。這為臨床治療抑郁癥提供了有效的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。但典型的Wnt/β-catenin信號通路在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的變化存在復(fù)雜性，Wnt信號的失活(下調(diào))導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白降解并促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生多種疾病[28-29]，抑郁癥發(fā)病機(jī)制是復(fù)雜多變的，樣本數(shù)據(jù)量的多少以及氣候環(huán)境等因素的不可控性，金郁歡的藥材產(chǎn)地以及藥量多少和配伍比例也需要進(jìn)一步明確，其抗抑郁的作用機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。