云靖婷，胡曉陽(yáng)，李志軍，孫爽

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)，黑龍江 大慶 163711)

哮喘，又名支氣管哮喘，是由多種炎癥細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的慢性氣道炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為喘息、氣促、胸悶、咳嗽等，且會(huì)隨時(shí)間變化而加重，伴有可逆性呼氣氣流受限[1-4]。哮喘的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多項(xiàng)研究表明，哮喘的發(fā)生與氣道炎癥、免疫調(diào)節(jié)機(jī)制密切相關(guān)，這二者是導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性的重要因素，也是目前哮喘機(jī)制研究的重點(diǎn)[5-6]。近年來，隨著空氣質(zhì)量下降、飲食衛(wèi)生問題頻發(fā)等，哮喘發(fā)病人數(shù)逐年增多。雖然多數(shù)患者經(jīng)過藥物治療后可以緩解，但仍會(huì)影響患者的生活質(zhì)量，目前臨床常用的吸入性糖皮質(zhì)激素(ICS)及長(zhǎng)效β2受體激動(dòng)劑有明顯副作用，而中醫(yī)治療哮喘有較大優(yōu)勢(shì)，所以探究哮喘的影響因素與發(fā)病機(jī)制進(jìn)而尋找治療哮喘更加有效的方法尤為重要[7-10]。

抗支糖漿由《金匱要略》中的經(jīng)典古方射干麻黃湯衍化，經(jīng)過多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而成，為黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，本藥基于射干麻黃湯宣肺清熱、化痰平喘之功，依據(jù)哮喘的特點(diǎn)和病因病機(jī)，對(duì)其進(jìn)行加減化裁，成此良藥，諸藥配伍，共奏宣肺疏風(fēng)、化痰止咳、清熱平喘之功?？怪菨{具有較好的抑制氣道炎癥和免疫調(diào)節(jié)作用，但其具體的療效機(jī)制仍需進(jìn)一步探索[5]。本實(shí)驗(yàn)建立霧化煙草提取物環(huán)境哮喘模型小鼠，觀察小鼠一般狀態(tài)，對(duì)其肺組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，統(tǒng)計(jì)肺泡灌洗液(BALF)中細(xì)胞的分類及計(jì)數(shù)，選擇輔助性T細(xì)胞1/輔助性T細(xì)胞2(Th1/Th2)以及半胱氨酰白三烯受體(CysLTRs)所介導(dǎo)的炎癥通路作為研究對(duì)象，用ELISA法、Western Blot法和RT-PCR法檢測(cè)相關(guān)生理生化指標(biāo)，以探究抗支糖漿的相關(guān)作用機(jī)制與影響，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康雌性昆明小鼠90只，體質(zhì)量(20±2)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001。所有小鼠均采用黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的全營(yíng)養(yǎng)顆粒飼養(yǎng)，自由飲水，晝夜節(jié)律正常，實(shí)驗(yàn)操作遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

抗支糖漿(組成：炙麻黃、苦杏仁、石膏、魚腥草、射干、僵蠶、地龍、拳參、炙百部、桑白皮、黃芩、虎杖、蘆根、平貝母、甘草)，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院配置生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)為黑藥制字z20131020，規(guī)格為250 mL/瓶。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(DG5031)，上海珂淮儀器有限公司；包埋機(jī)(JB-P5)，武漢俊杰電子有限公司；病理切片機(jī)(RM2016)，上海徠卡儀器有限公司；正置光學(xué)顯微鏡(NikonEclipseE10)，日本尼康；高速臺(tái)式離心機(jī)(X-22R)，美國(guó)貝克曼儀器有限公司；自制玻璃霧化箱40 cm×30 cm×25 cm。

ELISA試劑盒，安迪生物科技(上海)有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；PCR試劑盒，Roche公司；雞卵清蛋白OVA、氫氧化鋁，美國(guó)Sigma公司；孟魯司特納咀嚼片，杭州默沙東制藥有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

將雌性小鼠90只隨機(jī)分為9組,空白組(A組)、模型組(B組)、模型+抗支糖漿低劑量組(C組)、模型+抗支糖漿高劑量組(D組)、模型+孟魯司特組(E組)、模型+霧化煙草提取物組(F組)、模型+霧化煙草提取物+抗支糖漿低劑量組(G組)、模型+霧化煙草提取物+抗支糖漿高劑量組(H組)、模型+霧化煙草提取物+孟魯司特組(I組)，每組10只。

2.2 建模及給藥方法

稱取5 mg OVA，溶于50 mL生理鹽水，配置成致敏液。稱取5 g OVA，溶于100 mL生理鹽水中，得5% OVA溶液，霧化激發(fā)備用。稱取煙葉20 g，加入100 mL蒸餾水，開啟真空泵，調(diào)節(jié)流速，點(diǎn)燃煙葉，使其燃燒的煙霧過水，待20 g煙葉完全燃盡后，得煙草提取物溶液(質(zhì)量濃度為20%，甲醛濃度為1.056 μg/mL，符合污染大氣標(biāo)準(zhǔn))，霧化備用。

除空白組外，其余各組于實(shí)驗(yàn)第0、7和14天給予每只小鼠腹腔+雙大腿皮下注射致敏液共0.2 mL致敏?？瞻捉M則以生理鹽水代替致敏液注射，部位及注射劑量與其余各組相同。實(shí)驗(yàn)第1～27天，模型+霧化煙草提取物組、模型+霧化煙草提取物+抗支糖漿低劑量組、模型+霧化煙草提取物+抗支糖漿高劑量組、模型+霧化煙草提取物+孟魯司特組,4組小鼠置于自制霧化箱內(nèi)，煙草提取物溶液甲醛濃度1.056 μg/mL霧化吸入，3 h/d，連續(xù)27 d。其余組不予任何處理。實(shí)驗(yàn)第21～27天，除空白組外，其余各組將小鼠置于自制霧化箱中，以5%(m/v)OVA進(jìn)行霧化吸入激發(fā)，45 min/d，連續(xù)7 d，觀察并記錄小鼠哮喘發(fā)作情況；空白組以生理鹽水代替OVA霧化激發(fā)。給藥組于實(shí)驗(yàn)第21天開始進(jìn)行藥物干預(yù)，給藥劑量按動(dòng)物體表面積比值換算，在霧化激發(fā)前0.5 h給藥。

2.3 取材

末次霧化結(jié)束24 h內(nèi)處死小鼠，切開其頸部及前胸正中皮膚，分離氣管，并結(jié)扎右主支氣管，在左側(cè)主支氣管處進(jìn)行氣管插管，進(jìn)行支氣管肺泡的灌洗。針管抽取0.5 mL生理鹽水，緩慢注入后保留20 s回抽，重復(fù)3次，每只小鼠收集肺泡灌洗液(BALF)1.2 mL，4 ℃保存，1 500 r/min離心10 min，沉淀物涂片固定；取上清液保存于-80 ℃的環(huán)境中，作為待測(cè)樣品；分別剪取右肺上葉組織與右肺下葉組織各100 mg，放入凍存管中標(biāo)記，立即置液氮保存；取右肺中葉在4%多聚甲醛中室溫固定，用以病理組織檢查。

2.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

2.4.1 一般狀況

觀察記錄動(dòng)物模型整體狀態(tài)，判斷是否有異常，包括體質(zhì)量、皮毛、活動(dòng)情況、精神狀態(tài)、睡眠、進(jìn)食與飲水及二便等，分析相關(guān)原因，判斷造模是否成功及藥物作用效果。

2.4.2 HE染色觀察肺組織病理情況

處死小鼠后取下肺組織塊投入預(yù)先配制好的10%福爾馬林固定液中固定24 h，采用70%、80%、90%、100%的梯度酒精與二甲苯使組織塊脫水透明，經(jīng)浸蠟包埋后對(duì)其進(jìn)行切片與貼片，再經(jīng)由脫蠟、脫色與染色等過程，用中性樹膠封片，待樹膠干后，即可觀察。

2.4.3 BALF中白細(xì)胞的分類及計(jì)數(shù)

將收集到的肺泡灌洗液1 500 r/min 離心10 min，去上清后沉淀制備細(xì)胞懸液，分別取細(xì)胞懸液和0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液按9∶1的比例混勻，取10 μL混合液加入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。用Hank’S液調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度為4×105/mL，取50 μL的細(xì)胞懸液制備細(xì)胞涂片并干燥固定，先后滴加瑞氏染液與磷酸鹽緩沖液，染色5 min后流水沖去染液，待涂片自然干燥后鏡檢。

2.4.4 ELISA法檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)

在板條中設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，樣本孔先加待測(cè)樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL，而后每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min，取出進(jìn)行重復(fù)洗板5次后每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光15 min，最后每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔的OD值。

2.4.5 Western Blot檢測(cè)CysLTR1的蛋白表達(dá)水平

混勻Western及IP細(xì)胞裂解液，取1 000 μL加入苯甲基磺酰氟(PMSF)10 μL，取100 mg肺組織置于含有PMSF的裂解液中，勻漿機(jī)粉碎組織后裂解30 min，12 000 r/min離心10 min提取蛋白。配制分離膠后配制5%濃縮膠，灌膠后插入齒梳，水平放置等待膠凝。根據(jù)所測(cè)蛋白的濃度計(jì)算25 μg蛋白的溶液體積為上樣量，置入100 ℃水浴鍋中進(jìn)行蛋白變性。濃縮膠凝固后，電泳跑濃縮膠至出分離膠，按照目的蛋白分子量大小切取分離膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，再經(jīng)TBST洗滌兩次后將膜封閉于封閉液中，經(jīng)一抗、二抗孵育后將ECL發(fā)光液滴于PVDF膜上，使發(fā)光液與蛋白充分反應(yīng)。

2.4.6 RT-PCR檢測(cè)CysLTR1的基因表達(dá)水平

取100 mg肺組織加入裂解液中充分勻漿，加入0.2 mL氯仿，12 000 r/min離心15 min，記錄上清液體積，加入與上清液等體積的異丙醇充分混勻，12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL預(yù)冷的75%DEPC乙醇洗滌沉淀，10 000 r/min離心10 min，棄上清，將沉淀溶于40 μL 1‰DEPC水中提取RNA。將提取的RNA在20 μL反應(yīng)體系中逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在DEPC預(yù)處理的管中加入OligodT 1 μL，6 000 r/min離心2 min，置入PCR儀，70 ℃金屬浴10 min，最后4 ℃直到結(jié)束，依次加入5×反轉(zhuǎn)錄酶Buffer 4 μL、dNTP(2.5 mmol/L)4 μL、0.1 mol/L DTT 2 μL、Rnase Inhabitor 1 μL、M-mLV 1 μL，短暫離心后置入PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR測(cè)定。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 一般狀態(tài)

空白組小鼠的毛色正常，毛質(zhì)光澤柔順，動(dòng)作協(xié)調(diào)，反應(yīng)敏捷，呼吸順暢，正常進(jìn)食飲水，二便正常，體質(zhì)量增長(zhǎng)穩(wěn)定，狀態(tài)健康。其余組小鼠在霧化刺激前呼吸順暢，霧化開始后則相繼出現(xiàn)咳嗽喘促、呼吸頻率加快，口鼻分泌物增多等表現(xiàn)，甚至有腹部抽動(dòng)，撓抓口鼻，咳喘劇烈等情況，模型組、模型+霧化煙草提取物組癥狀加重明顯。經(jīng)藥物干預(yù)后，各組癥狀均有明顯減輕，僅少數(shù)有蜷臥懶動(dòng)情況。

3.2 HE染色結(jié)果

空白組支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)正常，連續(xù)、清晰，壁無(wú)明顯增厚，極少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組與模型+霧化煙草提取物組支氣管周圍、黏膜層、肺泡壁和血管周圍發(fā)現(xiàn)較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，其中EOS、MAC、LYM增多明顯；支氣管壁增厚，氣道上皮被破壞，有脫落死皮，管腔有黏液栓；基底膜形態(tài)不規(guī)則，黏膜有充血水腫現(xiàn)象，部分肺泡壁變薄或斷裂，間距增寬，體積明顯變小甚至萎縮，腔內(nèi)有炎性細(xì)胞。藥物干預(yù)后病理變化減輕明顯，支氣管黏膜充血較少，水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有不同程度改善，分泌物明顯減少，見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色(×400)

3.3 BALF中細(xì)胞的分類及計(jì)數(shù)

與空白組相比，模型組、模型+霧化煙草提取物組白細(xì)胞總數(shù)、EOS絕對(duì)計(jì)數(shù)，EOS、LYM、NEU各組所占百分比比例增多，MAC占比雖減少，但絕對(duì)計(jì)數(shù)增加明顯(P<0.05)。與模型組相比，模型+霧化煙草提取物組白細(xì)胞總數(shù)、EOS絕對(duì)計(jì)數(shù)，LYM、NEU、EOS所占百分比比例均增加，MAC所占百分比雖減少，但絕對(duì)計(jì)數(shù)增加明顯(P<0.05)?？怪菨{高低劑量組、孟魯司特組與模型組、模型+霧化煙草提取物組的統(tǒng)計(jì)結(jié)果相比，白細(xì)胞總數(shù)、EOS絕對(duì)計(jì)數(shù)，EOS、LYM、NEU各組所占百分比比例降低(P<0.05)，MAC占比雖有所增加，但絕對(duì)計(jì)數(shù)降低(P<0.05)?？怪菨{高低劑量組與孟魯司特組相比，白細(xì)胞總數(shù)、EOS絕對(duì)計(jì)數(shù)，MAC、EOS、LYM、NEU各組占比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組BALF中白細(xì)胞總數(shù)、EOS絕對(duì)計(jì)數(shù)及細(xì)胞分類

3.4 抗支糖漿對(duì)BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ、LTD4的影響

與空白組相比，其余各組IL-4、IL-5、IL-13、LTD4含量均增多，而IFN-γ含量減少(P<0.05)。與模型組相比，模型+霧化煙草提取物組小鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13、LTD4的含量增多，IFN-γ的含量減少(P<0.05)。孟魯司特組、抗支糖漿高低劑量組與模型組、模型+霧化煙草提取物組相比，IL-4、IL-5、IL-13、LTD4的含量減少，IFN-γ的含量增多(P<0.05)?？怪菨{高低劑量組與孟魯司特組的結(jié)果相比，IL-4、IL-5、IL-13、LTD4、IFN-γ含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組小鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ、LTD4測(cè)定比較

3.5 CysLTR1蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

模型組、模型+霧化煙草提取物組CysLTR1的蛋白表達(dá)水平，較空白組增多(P<0.05)。與模型組相比，模型+霧化煙草提取物組CysLTR1的蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。孟魯司特組、抗支糖漿高低劑量組CysLTR1的蛋白表達(dá)水平較模型組、模型+霧化煙草提取物組減少(P<0.05)。抗支糖漿高低劑量組CysLTR1的蛋白表達(dá)水平與孟魯司特組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2、圖3。

圖2 CysLTR1、β-actin的蛋白條帶圖

注：與A組比較，#P<0.05；與B組比較，*P<0.05。

3.6 CysLTR1mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果

模型組、模型+霧化煙草提取物組CysLTR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量，較空白組增多(P<0.05)。與模型組相比，模型+霧化煙草提取物組的CysLTR1的蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。孟魯司特組、抗支糖漿高低劑量組CysLTR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量較模型組、模型+霧化煙草提取物組減少(P<0.05)?？怪菨{高低劑量組CysLTR1mRNA相對(duì)表達(dá)量與孟魯司特組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組小鼠CysLTR1mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

4 討論

抗支糖漿有清熱解毒、宣肺止咳、清肺化痰之功效，臨床應(yīng)用十?dāng)?shù)年，療效顯著。有研究發(fā)現(xiàn)，抗支糖漿對(duì)兒童咳嗽變異性哮喘及小兒支氣管哮喘的治療效果良好[11-13]。

研究發(fā)現(xiàn)，煙草煙霧暴露已成為兒童支氣管哮喘發(fā)病的重要因素之一，此外，有研究結(jié)果表明，妊娠期婦女吸煙，也可以成為兒童與青少年哮喘發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素[14-16]。有研究提示，煙草煙霧能夠影響包括健康人群呼吸道的免疫系統(tǒng)，與多種呼吸道疾病如鼻炎、鼻竇炎及哮喘等的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[17]。煙草煙霧不僅會(huì)導(dǎo)致哮喘發(fā)生，還會(huì)加重哮喘癥狀，吸煙患者的癥狀較不吸煙的患者更嚴(yán)重[18]，更有研究表明，煙草煙霧暴露可能會(huì)導(dǎo)致哮喘患者對(duì)糖皮質(zhì)激素治療不敏感[19]。因此本實(shí)驗(yàn)建立煙霧哮喘模型，以模擬空氣污染時(shí)哮喘發(fā)作情況。

哮喘常由免疫異常引起，但其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。Th1/Th2在人體免疫方面有著很大的作用，兩者的平衡與免疫功能關(guān)系密切，Th1/Th2失衡目前被認(rèn)為是哮喘最重要的病機(jī)之一。CysLTRs通道是哮喘氣道炎癥的重要通道之一，CysLTRs通過與靶細(xì)胞上CysLTR1結(jié)合，聚集并活化炎癥細(xì)胞，增加血管滲透性及氣道黏液分泌導(dǎo)致哮喘，Th1/Th2失衡會(huì)導(dǎo)致哮喘CysLTRs介導(dǎo)的炎癥通路的氣道炎癥形成，二者相互影響。Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ，Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-13，其中IFN-γ與IL-4相互拮抗，可抑制IL-4mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。氣道炎癥發(fā)生時(shí)，IL-4水平增加與IFN-γ水平減少，可反映Th1/Th2失衡。IL-4和IL-13可增強(qiáng)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞CysLTR1的表達(dá)，并在氣管平滑肌細(xì)胞中促進(jìn)CysLTR1的產(chǎn)生。有研究表明IFN-γ能上調(diào)支氣管上皮細(xì)胞CysLTR1及CysLTR1mRNA的表達(dá)，增強(qiáng)LTs對(duì)呼吸道的炎癥效應(yīng)[20-22]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抗支糖漿可以改善霧化煙草提取物環(huán)境哮喘模型小鼠的一般狀態(tài)，降低炎性細(xì)胞數(shù)量，減少黏膜下水腫及黏液的分泌，減輕氣道炎癥，改善呼吸道高反應(yīng)?？怪菨{與孟魯司特均可調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫平衡狀態(tài)，下調(diào)CysLTR1mRNA的表達(dá)干預(yù)CysLTR1介導(dǎo)的哮喘CysLTs炎癥作用達(dá)到防治霧化煙草提取物環(huán)境哮喘的目的。