蘇 昂孫鳳云魯子鵬張季儒王昭玉高 瑞*劉 劍*

(1.山東大學(xué)控制科學(xué)與工程學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，山東 濟(jì)南 250061；2.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，山東省科學(xué)院海洋儀器儀表研究所，山東 青島 266001)

微型藻類(lèi)是水體的重要組成部分和水質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[1-2]。水中氮、磷等元素的超標(biāo)會(huì)造成微型藻類(lèi)爆發(fā)性繁殖，從而形成水華、赤潮等水體自然災(zāi)害[3]。不同微藻類(lèi)群的時(shí)空分布特征、所產(chǎn)生的危害以及所形成水華的治理方法都具有顯著差異性[4]，因此微藻監(jiān)測(cè)對(duì)水華的研究和治理具有十分重要的意義。

微藻檢測(cè)主要分為宏觀檢測(cè)和微觀檢測(cè)，宏觀檢測(cè)有無(wú)人機(jī)或衛(wèi)星遙感檢測(cè)[5-6]、熒光檢測(cè)[7]，利用遙感或熒光監(jiān)測(cè)水華，只能監(jiān)測(cè)總體微藻密度，難以研究水體中微藻種類(lèi)構(gòu)成以及特定藻類(lèi)密度。微觀檢測(cè)包括傳統(tǒng)顯微鏡檢測(cè)[8]、流式細(xì)胞儀檢測(cè)[9]和基因檢測(cè)[10]。傳統(tǒng)顯微鏡檢測(cè)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)可以精確檢測(cè)特定種類(lèi)微藻并分析水體中藻種構(gòu)成，但是都存在檢測(cè)成本高，相關(guān)設(shè)備體積大難以實(shí)現(xiàn)微藻現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等問(wèn)題[11]?；驒z測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)微藻的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[12]。目前現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)微藻主要以檢測(cè)胡蘿卜素和葉綠素為主，但是僅能檢測(cè)總體的藻類(lèi)含量，不能判斷藻類(lèi)種屬和觀察微藻形態(tài)[13]。因此研發(fā)一種既能開(kāi)展現(xiàn)場(chǎng)藻類(lèi)種屬檢測(cè)又能觀察細(xì)節(jié)形態(tài)的便攜式藻類(lèi)檢測(cè)儀對(duì)海洋、湖泊、河流等水域的富營(yíng)養(yǎng)化研究與治理有重要意義。

本文設(shè)計(jì)了一種基于手機(jī)的便攜式藻類(lèi)顯微與智能識(shí)別系統(tǒng)，可拍攝微藻顯微圖片，分辨率達(dá)2 μm，基于手機(jī)內(nèi)置的微藻檢測(cè)APP可實(shí)現(xiàn)微藻種類(lèi)識(shí)別并計(jì)算密度。整體設(shè)備尺寸為156 mm×84 mm×52 mm，總重量為550 g?；谄胀ㄖ悄苁謾C(jī)平臺(tái)，直接取自然水樣檢測(cè)，簡(jiǎn)單便攜，檢測(cè)成本低，可實(shí)現(xiàn)特定種類(lèi)微藻的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)以及水華發(fā)展過(guò)程的監(jiān)測(cè)，為水華的預(yù)警、監(jiān)測(cè)以及相關(guān)研究提供重要的技術(shù)支持。

1 系統(tǒng)設(shè)計(jì)

1.1 便攜式顯微鏡結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

便攜式顯微鏡由鏡架，透鏡，電源和光源四部分組成，采用單透鏡結(jié)合智能手機(jī)相機(jī)成像，顯微鏡結(jié)構(gòu)如圖1(a)所示。玻片座內(nèi)置LED燈作為光源，光線由透光孔發(fā)出，透過(guò)玻片經(jīng)過(guò)球形透鏡和手機(jī)鏡頭放大，在手機(jī)相機(jī)中成像。玻片座套在調(diào)焦螺栓上與調(diào)焦盤(pán)配合實(shí)現(xiàn)調(diào)焦。球形透鏡可分為50倍鏡、100倍鏡、200倍鏡三種。其中200倍鏡分辨率為2 μm，結(jié)合手機(jī)相機(jī)，可將微藻清晰放大200倍至1 000倍。顯微鏡實(shí)物圖如圖1(b)所示，圖中左上角為顯微鏡放大倍數(shù)為400倍時(shí)拍攝的刻度玻片視場(chǎng)圖，圖中白色標(biāo)注為100 μm。

圖1 便攜式手機(jī)顯微鏡爆炸圖及實(shí)物圖

1.2 藻類(lèi)智能識(shí)別APP的設(shè)計(jì)

當(dāng)前研究中一般使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)進(jìn)而計(jì)算微藻密度，不僅工作量大、對(duì)識(shí)別人員專(zhuān)業(yè)能力要求高而且容易造成視覺(jué)疲勞降低準(zhǔn)確度。本系統(tǒng)采用深度學(xué)習(xí)算法對(duì)顯微鏡拍攝圖像中的藻類(lèi)進(jìn)行識(shí)別并計(jì)數(shù)。利用深度學(xué)習(xí)模型的研究一般在PC端完成[14]，降低了系統(tǒng)的便攜性，影響現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的實(shí)現(xiàn)。本文在手機(jī)端開(kāi)發(fā)了基于yolov5深度學(xué)習(xí)模型的微藻檢測(cè)APP，通過(guò)APP可以調(diào)用手機(jī)相機(jī)拍攝顯微照片，或查看已拍攝的微藻照片進(jìn)行識(shí)別計(jì)數(shù)，檢測(cè)結(jié)果保存在數(shù)據(jù)庫(kù)中。

基于智能手機(jī)搭建系統(tǒng)可以更好地做到微型化，提高系統(tǒng)的便攜性，便于開(kāi)展現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。同時(shí)可以依托智能手機(jī)成熟的軟件開(kāi)發(fā)系統(tǒng)開(kāi)發(fā)配套APP，實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的存儲(chǔ)和處理，做到顯微拍攝和數(shù)據(jù)處理的一體化。智能手機(jī)不僅作為上位機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，而且是成像系統(tǒng)的重要組成部分。

1.3 微藻密度檢測(cè)原理

制作玻片時(shí)取5 μL水樣均勻分布于18 mm×18 mm的范圍內(nèi)，所以水樣中微藻密度計(jì)算公式如下:

式中:N為視場(chǎng)可見(jiàn)藻類(lèi)數(shù)量，S1為水樣分布面積，S2為視場(chǎng)面積，P為水樣中藻類(lèi)密度。

檢測(cè)水樣時(shí)應(yīng)先通過(guò)預(yù)檢測(cè)估計(jì)水樣中微藻密度，然后經(jīng)過(guò)離心或稀釋處理保證檢測(cè)時(shí)微藻密度在系統(tǒng)可檢測(cè)范圍內(nèi)。測(cè)量微藻密度時(shí)，每一次樣本觀察共拍攝10張顯微照片并使用深度學(xué)習(xí)模型進(jìn)行識(shí)別，為減小誤差去掉兩個(gè)濃度最低值和兩個(gè)濃度最高值，取剩余6組結(jié)果平均值作為檢測(cè)結(jié)果并記錄。

2 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備

為驗(yàn)證微藻檢測(cè)系統(tǒng)的實(shí)用性和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)能力，本文開(kāi)展了水華模擬實(shí)驗(yàn)，在敞口玻璃器皿中，加入取自野外的河水，并養(yǎng)有水生植物和小型觀賞魚(yú)類(lèi)。利用水生植物、魚(yú)類(lèi)、水中微藻等在玻璃器皿中組成一個(gè)小型生態(tài)水體系統(tǒng)，用來(lái)模擬自然界中的水環(huán)境。通過(guò)人為調(diào)控水體的富營(yíng)養(yǎng)化程度，模擬自然水域中水華的形成過(guò)程。在對(duì)水樣鏡檢時(shí)發(fā)現(xiàn)玻璃器皿中優(yōu)勢(shì)藻種為羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)并且其他藻種極其稀少，因此以羊角月牙藻為水樣中目標(biāo)藻類(lèi)，觀察月牙藻的增殖情況和密度變化。

羊角月牙藻為月牙型單細(xì)胞藻，大小約為2 μm×20 μm，當(dāng)使用200倍球形透鏡和2倍手機(jī)攝像頭組合時(shí)即總體放大倍數(shù)為400倍時(shí)觀察效果較好，所以在以羊角月牙藻為研究對(duì)象時(shí)，均以上述透鏡組合進(jìn)行觀察。放大倍數(shù)為400倍時(shí)顯微鏡視場(chǎng)范圍為一直徑0.3 mm的圓。

實(shí)驗(yàn)中所用主要設(shè)備為尼康E200生物顯微鏡、XB-K-25型血球計(jì)數(shù)板(上海求精公司)、XK-400型離心機(jī)(江蘇新康公司)。

2.2 微藻識(shí)別深度學(xué)習(xí)模型

經(jīng)過(guò)一個(gè)月的培養(yǎng)，使用便攜式顯微鏡鏡檢水樣時(shí)拍攝了月牙藻不同密度下顯微圖像共750副，去掉7副成像質(zhì)量差的圖像，共743張?jiān)卵涝屣@微照片作為深度學(xué)習(xí)模型數(shù)據(jù)集。人工標(biāo)注后，通過(guò)程序按照9∶1的比例將數(shù)據(jù)集分為訓(xùn)練集和測(cè)試集。訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)選用yolov5l，迭代周期300輪。訓(xùn)練結(jié)束后，得到的最優(yōu)模型精確率(Precision)為0.94，召回率(Recall)為0.99，mAP0.5為0.99，訓(xùn)練結(jié)果如圖2所示。

圖2 目標(biāo)識(shí)別模型訓(xùn)練結(jié)果

mAP0.5表示當(dāng)置信閾值為0.5時(shí)多類(lèi)別平均精度的平均值，由于本研究中僅有月牙藻一個(gè)類(lèi)別，因此mAP0.5的值等于平均精度(Average Precision，AP)，通過(guò)式(2)計(jì)算平均精度

式中:p表示精確率(Precision)，r表示召回率(Recall)，此時(shí)AP的值等于置信閾值為0.5時(shí)，Precision-Recall曲線下方所構(gòu)成區(qū)域的面積。精確率、召回率的計(jì)算公式分別如下:

式中:TP表示正確的目標(biāo)被正確識(shí)別為目標(biāo)區(qū)域的數(shù)量，F(xiàn)P表示非正確的目標(biāo)被錯(cuò)誤識(shí)別為目標(biāo)區(qū)域的數(shù)量，F(xiàn)N表示正確的目標(biāo)被錯(cuò)誤地識(shí)別為背景區(qū)域的數(shù)量。由上述可知，精確率、召回率和mAP0.5的值越接近于1，表示所訓(xùn)練模型的識(shí)別效果越好。

將最優(yōu)模型部署到微藻檢測(cè)APP中，微藻識(shí)別及微藻密度檢測(cè)界面如圖3所示。當(dāng)系統(tǒng)檢測(cè)出圖像中的目標(biāo)藻類(lèi)時(shí)，用檢測(cè)框標(biāo)出微藻并顯示相對(duì)應(yīng)的置信值和標(biāo)簽，以標(biāo)簽“sc”代表月牙藻。檢測(cè)結(jié)果頁(yè)面上方為NMS及Threshold調(diào)節(jié)按鈕，NMS(Non-maximum suppression)為非極大抑制，其目的是為了消除多余的檢測(cè)框，找到最佳的物體檢測(cè)位置，實(shí)驗(yàn)顯示當(dāng)NMS為0.7時(shí)效果較好。Threshold表示置信閾值，當(dāng)目標(biāo)框置信值大于設(shè)定值時(shí)，該目標(biāo)判定為正確目標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)所訓(xùn)練模型檢測(cè)Threshold為0.5時(shí)，效果較好。

圖3 手機(jī)APP識(shí)別月牙藻并計(jì)算其密度

2.3 微藻密度梯度實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證本系統(tǒng)檢測(cè)微藻的可靠性，本文開(kāi)展了微藻密度梯度試驗(yàn)，首先配置四種藻液，標(biāo)號(hào)為A、B、C、D。分別使用傳統(tǒng)的顯微鏡計(jì)數(shù)法和所研制的便攜式智能微藻檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)四種藻液進(jìn)行檢測(cè)，獲得月牙藻密度。顯微鏡計(jì)數(shù)法是將經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的藻液放在血球計(jì)數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)室中，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。由于計(jì)數(shù)室的容積是一定的(0.1 mm3)，所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微藻數(shù)目來(lái)?yè)Q算成單位體積內(nèi)的微藻總數(shù)目。實(shí)驗(yàn)中所用顯微鏡為尼康E200生物顯微鏡，血球計(jì)數(shù)板為XB-K-25型血球計(jì)數(shù)板(上海求精)。配置高濃度藻液時(shí)使用XK-400型離心機(jī)(江蘇新康公司)進(jìn)行離心處理。

測(cè)量結(jié)果如圖4(a)所示，月牙藻在104個(gè)/mL～107個(gè)/mL范圍內(nèi)，傳統(tǒng)顯微鏡計(jì)數(shù)法和本便攜式檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量結(jié)果的相對(duì)誤差分別為3.03%、2.64%、4.08%、0.84%。同時(shí)針對(duì)一個(gè)數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)的藻液，實(shí)驗(yàn)配制五種不同密度梯度，使用兩種方法分別對(duì)其進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果如圖4(b)所示，月牙藻在2.2×106個(gè)/mL～12.1×106個(gè)/mL范圍內(nèi)，便攜式顯微鏡視場(chǎng)可見(jiàn)微藻數(shù)量與微藻密度有較好的線性相關(guān)性，擬合直線的R2為0.979 18。

圖4 微藻密度梯度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 水華監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)玻璃器皿放在陽(yáng)臺(tái)，人為調(diào)控，加速水體的富營(yíng)養(yǎng)化進(jìn)程。每隔3 d～4 d選取光照正常日拍攝水體外觀圖，并取水樣在微藻檢測(cè)系統(tǒng)下進(jìn)行檢測(cè)，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。每次取上、中、下層水樣各0.5 mL，共1.5 mL水樣，使藻液均勻混合。取5 μL藻液制成玻片放便攜式顯微鏡下鏡檢。根據(jù)視野中藻類(lèi)分布情況每次拍攝10張不同視場(chǎng)區(qū)域的月牙藻顯微照片作為鏡檢數(shù)據(jù)保存。水華監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)如圖5所示。

圖5 水華模擬實(shí)驗(yàn)

在水華模擬實(shí)驗(yàn)中，由于隨季節(jié)變化會(huì)出現(xiàn)溫度的較大幅度改變，實(shí)驗(yàn)中監(jiān)測(cè)到兩次水華的發(fā)展過(guò)程。第一次為春季水華，發(fā)生在3月上旬至四月初，共28 d，水溫變化為(19±2)℃；第二次為夏季水華，發(fā)生在五月中旬至六月中旬，共28 d，水溫變化為(25±2)℃。取樣日水溫?cái)?shù)據(jù)記錄如表1所示。

表1 春、夏季水溫對(duì)比及取樣日水溫變化

如圖5所示，春季時(shí)培養(yǎng)皿中水華爆發(fā)，呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后衰退的現(xiàn)象，由于人為調(diào)控導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化加劇，月牙藻大量增殖。當(dāng)月牙藻增殖到臨界點(diǎn)時(shí)，此時(shí)密度為8.7×106個(gè)/mL。由于受到溫度、無(wú)機(jī)鹽、溶解氧等因素制約以及魚(yú)類(lèi)和微生物捕食活動(dòng)影響，月牙藻發(fā)生死亡，密度降低，其密度變化趨勢(shì)與相關(guān)研究結(jié)果一致[15]。由表1可知，夏季平均水溫比春季高約6.3℃，因此相關(guān)酶活性增強(qiáng)，月牙藻生命活動(dòng)更活躍，開(kāi)始增殖形成夏季水華，水華發(fā)展趨勢(shì)與春季一致。由于此時(shí)溫度較高，月牙藻數(shù)量臨界值更高為16.5×106個(gè)/mL，超過(guò)臨界值后密度出現(xiàn)降低至11.9×106個(gè)/mL，但仍高于春季時(shí)的臨界密度值。圖5中所示水體外觀圖與微藻檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果相一致，水體外觀圖右上角為對(duì)應(yīng)的便攜式顯微鏡視場(chǎng)照片。同時(shí)由圖5可知，夏季增殖線斜率為0.49，而春季增殖線斜率為0.2，由于微藻生命活動(dòng)更活躍，夏季微藻增殖速率高于春季，此現(xiàn)象符合有關(guān)水華的研究結(jié)果[16]。由水華模擬實(shí)驗(yàn)可知，微藻檢測(cè)系統(tǒng)可以完成對(duì)水華發(fā)展過(guò)程的監(jiān)測(cè)，預(yù)警水華爆發(fā)，并且具備對(duì)水體的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)能力。

3 結(jié)論與展望

本文開(kāi)發(fā)了基于智能手機(jī)的便攜式微藻檢測(cè)系統(tǒng)，并且通過(guò)微藻密度梯度實(shí)驗(yàn)和水華模擬實(shí)驗(yàn)，與傳統(tǒng)顯微鏡檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，驗(yàn)證了微藻檢測(cè)系統(tǒng)的可靠性和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明該系統(tǒng)可以高效、快速地測(cè)量目標(biāo)微藻濃度并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)水華發(fā)展。但是由于自然界水華發(fā)展周期長(zhǎng)，發(fā)展?fàn)顩r及速率難以人為控制，所以本文僅在實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了模擬水華實(shí)驗(yàn)，其準(zhǔn)確度和功能還應(yīng)結(jié)合自然水域檢測(cè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證和改進(jìn)。同時(shí)還應(yīng)開(kāi)展多藻類(lèi)水華實(shí)驗(yàn)，建立多種微藻數(shù)據(jù)庫(kù)，訓(xùn)練相關(guān)目標(biāo)識(shí)別模型，驗(yàn)證該系統(tǒng)對(duì)多種微藻的識(shí)別及密度測(cè)量功能。