溫欽友，葉燕芳，鄭政淮，張亞如，陳麗晨，黃志偉*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)福建省特種淀粉品質(zhì)科學(xué)與加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002）

紅曲米是將紅曲霉（Monascus）接種到大米中發(fā)酵制備而成的，含有多種活性物質(zhì)，是一種藥食兩用的傳統(tǒng)中藥，也可作為食品的染色劑和防腐劑、治療消化不良等。紅曲米的生理功能主要來(lái)源于紅曲霉的活性代謝產(chǎn)物[1]，如莫納可林K[2]（monacolin K，MK）、γ氨基丁酸和色素等[3]。其中MK具有降低膽固醇、抗癌防癌、神經(jīng)保護(hù)、抗炎抑菌等功效[4-6]。MK又稱洛伐他?。╨ovastatin），最早由日本學(xué)者遠(yuǎn)藤章于1979年從紅色紅曲霉（M.ruber）的發(fā)酵產(chǎn)物中首次分離獲得[7]，MK可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制膽固醇合成限制酶——3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，HMGR）的活性而抑制膽固醇的合成，從而降低人體和動(dòng)物血液中的膽固醇水平[8]。研究表明，在紅曲米中至少含有14種具有降血脂功能的物質(zhì)，包括莫納可林K、莫納可林J、莫納可林L、莫納可林M、莫納可林X及它們的酸式結(jié)構(gòu)、脫氫莫納可林K、二氫莫納可林L、康伐他汀等[9]。除了產(chǎn)生具有降血脂作用的活性物質(zhì)，多數(shù)紅曲霉菌株還會(huì)產(chǎn)生具有肝腎毒性的桔霉素，這種毒素的存在限制了紅曲霉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[10]。但不同紅曲霉菌株產(chǎn)桔霉素的能力差異很大，Dai等[11]從商業(yè)紅曲產(chǎn)品中分離出4株叢毛紅曲霉菌株 MS-1、YDJ-1、YDJ-2 和 K104061，且發(fā)現(xiàn)這4株叢毛紅曲霉在高產(chǎn)MK的同時(shí)不產(chǎn)桔霉素，這對(duì)叢毛紅曲霉的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用具有深遠(yuǎn)意義。

他汀類藥物已成為降血脂治療的主流藥物[12-13]，因此如何提高發(fā)酵產(chǎn)物中的MK產(chǎn)量是紅曲霉領(lǐng)域近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。一般紅曲霉產(chǎn)MK的常見(jiàn)發(fā)酵模式有固態(tài)發(fā)酵（solid state fermentation，SSF）和液態(tài)發(fā)酵（submerged fermentation，SmF）[2]。相比 SmF，SSF 法有許多優(yōu)勢(shì)，如真菌在SSF中能夠產(chǎn)生更高活性的酶，因而代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量也更高，甚至能夠產(chǎn)生SmF下無(wú)法生成的酶類[14]，還有研究發(fā)現(xiàn)，SSF下紅曲霉的MK合成速率、甘油消耗率、生物量的積累速率、細(xì)胞膜的流動(dòng)性與滲透性以及甘油耐受濃度都明顯高于SmF下的紅曲霉[15-16]，SSF發(fā)酵的MK產(chǎn)量高出SmF下的數(shù)倍甚至數(shù)十倍[17-18]。

向紅曲霉的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中添加碳源（甘油、葡萄糖、乳糖等）、氮源（谷氨酸、大豆粉、蛋白胨等）、無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也是提高其MK產(chǎn)量的有效方法之一。甘油常作為碳源，用于紅曲霉的MK發(fā)酵[15]。Shi等[19]通過(guò)生理學(xué)和轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，在紅曲霉發(fā)酵過(guò)程中甘油加速了其糖酵解和碳代謝。也有研究指出甘油不僅被紅曲霉用作碳源，而且直接參與其代謝[20]。這些研究表明，甘油作為碳源在紅曲霉發(fā)酵中起到了很好的促進(jìn)作用。氮源是真菌菌絲生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也能促進(jìn) MK 合成，如 NaNO3[21]、大豆粉[22]等，張占軍等[23]利用響應(yīng)面法研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)接種量為17.50%、裝料量為32.95 g/250 mL、玉米粉添加量為3.80%和蛋白胨添加量為2.37%時(shí)，煙色紅曲霉（Monasucs fuliginosus Sato）固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量最高。此外，將一些氨基酸作為氮源或前體物質(zhì)添加到培養(yǎng)基中，能顯著提高紅曲霉的MK產(chǎn)量[24]，如谷氨酸[25]、蛋氨酸[26]。對(duì)于紅曲霉等許多絲狀真菌，某些單價(jià)和二價(jià)陽(yáng)離子對(duì)其細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的合成都具有重要的促進(jìn)作用，Panda等[27]研究發(fā)現(xiàn)MgSO4、NH4Cl和NaCl均能大幅度提高紫色紅曲霉菌株MTCC 369的MK產(chǎn)量，MnSO4和CaCl2也有促進(jìn)效果。Dikshit等[28]對(duì)紫色紅曲霉（M.purpureus）與血紅紅曲霉（M.sanguineus）兩種菌株的SSF培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MgSO4·7H2O和MnSO4·7H2O對(duì)兩種菌株的MK產(chǎn)量都有顯著的促進(jìn)作用。

目前，紫色紅曲霉、紅色紅曲霉和叢毛紅曲霉為紅曲發(fā)酵生產(chǎn)中3種主要紅曲霉，國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)于提高紅曲霉MK產(chǎn)量的研究報(bào)道，多以紅色紅曲霉和紫色紅曲霉的研究為主，關(guān)于叢毛紅曲霉的文獻(xiàn)報(bào)道較少。因此，根據(jù)前期研究結(jié)果，選擇11種對(duì)紅曲霉MK產(chǎn)量具有顯著提高效果的外源誘導(dǎo)物，研究其對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響，從而為叢毛紅曲霉更好地應(yīng)用于高M(jìn)K紅曲發(fā)酵產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與試劑

叢毛紅曲霉（Monascus pilous）菌株 CICC 5045：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。葡萄糖、瓊脂粉、蛋白胨、磷酸二氫鉀、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、磷酸、蛋氨酸、谷氨酸、三水合乙酸鈉、二水合檸檬酸鈉、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、Na2MoO4·2H2O、CaCl2、CoCl2·6H2O（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純）：格雷斯（中國(guó)）有限公司；MK標(biāo)準(zhǔn)品（洛伐他汀≥98%）：中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.1.2 儀器與設(shè)備

中藥粉碎機(jī)（50 g，LG-01）：瑞安市百信藥機(jī)有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋（MJ-54A）：施都凱儀器設(shè)備有限公司；超低溫保存箱（MDF-382E）：日本三洋電機(jī)貿(mào)易會(huì)社；電子天平（BSA2202S-CW）、電子天平（BSA-124S-CW）：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；水浴鍋（HH-2）：江蘇金壇精達(dá)儀器制造廠；潔凈工作臺(tái)（VS-1300LU）：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；恒溫?fù)u床（ZHWY-200D）：上海智城分析儀器制造有限公司；霉菌培養(yǎng)箱（MJX-50）：寧波江南儀器廠；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9005）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；高效液相色譜儀（e2695）：美國(guó)沃特斯公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：200 g新鮮土豆，削皮、切塊，于沸水中煮20 min至煮爛成汁，經(jīng)4層紗布過(guò)濾后，加入葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g，加水溶解后定容至1 000 mL，121℃下高壓滅菌20 min。

種子液培養(yǎng)基：葡萄糖60g、蛋白胨20g、NaNO32g、KH2PO41 g、MgSO41 g，于250 mL三角瓶中裝入100 mL種子液培養(yǎng)基，121℃下高壓滅菌20 min。

固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：取30 g大米，加入6 g甘油與20 mL水，封口后于121℃下高壓滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)方法

叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)方法參照Z(yǔ)hang等[15]與陳慎等[29]的研究方法：用無(wú)菌水沖洗PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d～14 d的紅曲霉孢子并輕輕刮下，倒入種子液培養(yǎng)基中。將種子液培養(yǎng)基置于28℃恒溫?fù)u床內(nèi)，160 r/min振蕩培養(yǎng)2 d后，取8 mL種子培養(yǎng)液，加入到裝有固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的塑料發(fā)酵瓶?jī)?nèi)，并置于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d，待米粒長(zhǎng)滿菌絲后，加入20 mL無(wú)菌水，隨后每日加水5 mL并將米粒搖勻打散，培養(yǎng)至第15天，發(fā)酵完成。

1.2.2 叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別加入蛋氨酸（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/g）、谷氨酸（0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/g）、三水合乙酸鈉（0.60、0.80、1.00、1.20、1.40 mg/g）、二水合檸檬酸鈉（1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mg/g）、FeSO4·7H2O（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25mg/g）、MgSO4·7H2O（1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mg/g）、ZnSO4·7H2O（1.00、1.50、2.00、2.50、3.00mg/g）、MnSO4·H2O（1.00、1.25、1.50、1.75、2.00 mg/g）、Na2MoO4·2H2O（0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/g）、CaCl2（1.00、1.50、2.00、2.50、3.00mg/g）、CoCl2·6H2O（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/g），培養(yǎng)基的其他成分及培養(yǎng)條件均保持一致，同時(shí)以不添加外源誘導(dǎo)物的固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對(duì)照，按照1.2.1中的方法進(jìn)行叢毛紅曲霉的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)后，檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物的MK含量，每個(gè)處理設(shè)4個(gè)重復(fù)。

1.2.3 叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵外源誘導(dǎo)物最優(yōu)組合的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

根據(jù)固態(tài)發(fā)酵的單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取MK產(chǎn)量提高效果最顯著的3種外源誘導(dǎo)物，進(jìn)行外源誘導(dǎo)物最優(yōu)組合的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.4 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中MK含量的高效液相色譜檢測(cè)

待測(cè)樣品的前處理：將發(fā)酵培養(yǎng)后的紅曲米樣品置于60℃的鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重，隨后將紅曲米研磨粉碎并過(guò)80目篩，取1 g粉末置于10 mL離心管中，加入75%乙醇定容至10 mL，超聲處理30 min，期間搖勻1次，待超聲完成后再搖勻1次，并靜置5 min，隨后取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后，用于高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）進(jìn)樣檢測(cè)。

酸型MK標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取1.50 mg MK標(biāo)準(zhǔn)品，置于10 mL棕色容量瓶中，加入2 mL 0.2 moL/L NaOH溶液，用75%乙醇溶解后定容至10 mL，50℃水浴30 min，期間振搖2次，使內(nèi)酯型MK轉(zhuǎn)化為酸型MK，配制成150 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

內(nèi)酯型MK標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取1.50 mg MK標(biāo)準(zhǔn)品，置于10 mL棕色容量瓶中，用75%乙醇溶解后定容至10 mL，配制成150 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4℃下冰箱中存?zhèn)溆谩?/p>

HPLC檢測(cè)的色譜條件：Waters高效液相色譜儀（e2695），色譜柱為 SunfireC18（5μm，250mm×4.6mm）；流動(dòng)相為乙腈∶0.1%磷酸水溶液=55∶45（體積比）；流速為1 mL/min；紫外檢測(cè)器的波長(zhǎng)為238 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為 20 μL。

待測(cè)樣品中MK含量（mg/kg）的計(jì)算公式如下。

式中：W（MK）為樣品中 MK 含量，mg/kg；C（MK）為MK標(biāo)準(zhǔn)品濃度和待測(cè)樣品目標(biāo)物質(zhì)峰面積（A）的比值，μg/mL；m為待測(cè)樣品的質(zhì)量，g。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

采用SPSS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，對(duì)所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同誘導(dǎo)物對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響

2.1.1 蛋氨酸對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響

蛋氨酸添加量對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 蛋氨酸添加量對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of methionine concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

由圖1可知，不同添加量的蛋氨酸，叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量均與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異。氨基酸是一種有機(jī)氮源，在叢毛紅曲霉的固態(tài)發(fā)酵中添加蛋氨酸相當(dāng)于添加有機(jī)氮源，其對(duì)叢毛紅曲霉的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義[30]。但本研究中不同添加量的蛋氨酸，對(duì)叢毛紅曲霉的MK產(chǎn)量沒(méi)有顯著促進(jìn)作用，因此，可

不添加蛋氨酸。

2.1.2 谷氨酸對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響谷氨酸添加量對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響見(jiàn)圖2。

圖2 谷氨酸添加量對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響Fig.2 Effect of glutamic acid concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

由圖2可知，添加谷氨酸可顯著提高叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量（P＜0.05）。當(dāng)谷氨酸添加量為0.50 mg/g時(shí)，MK產(chǎn)量可達(dá)227.29 mg/kg，比對(duì)照組的MK產(chǎn)量提高了57.9%，因此，叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK時(shí)，谷氨酸的最適添加量為0.50 mg/g。添加谷氨酸能夠顯著提高紅曲霉的MK產(chǎn)量，其原因可能是谷氨酸能夠改變紅曲霉的細(xì)胞形態(tài)，從而增加MK的分泌[25]。此外，Zhang等[31]的研究結(jié)果表明，谷氨酸能提高紅曲霉MK合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)MK的合成。

2.1.3 三水合乙酸鈉對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響

三水合乙酸鈉添加量對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響見(jiàn)圖3。

圖3 三水合乙酸鈉添加量對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響Fig.3 Effect of sodium acetate concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

由圖3可知，不同添加量的三水合乙酸鈉，叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量均與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異。因此，叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK時(shí)，可不添加三水合乙酸鈉。三水合乙酸鈉對(duì)紅曲霉發(fā)酵的MK合成有一定的促進(jìn)作用，但三水合乙酸鈉添加量過(guò)高會(huì)使培養(yǎng)基的pH值升高，從而不利于菌體的生長(zhǎng)，進(jìn)而抑制MK的合成[32]。

2.1.4 二水合檸檬酸鈉對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響

二水合檸檬酸鈉添加量對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響見(jiàn)圖4。

圖4 二水合檸檬酸鈉添加量對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響Fig.4 Effect of citric acid concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

由圖4可知，不同添加量的二水合檸檬酸鈉，叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量均與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異。二水合檸檬酸鈉對(duì)紅曲霉發(fā)酵的MK合成有一定的促進(jìn)作用，可能是由于二水合檸檬酸鈉在水解時(shí)會(huì)釋放堿性離子，使紅曲霉發(fā)酵環(huán)境的pH值穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)，起到了緩沖作用，從而調(diào)節(jié)菌體細(xì)胞的滲透壓[33]。但本研究中不同添加量的二水合檸檬酸鈉，均未顯著提高叢毛紅曲霉的MK產(chǎn)量。因此，叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK時(shí)，可不添加二水合檸檬酸鈉。

2.1.5 FeSO4·7H2O對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響

FeSO4·7H2O添加量對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響見(jiàn)圖5。

圖5 FeSO4·7H2O添加量對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響Fig.5 Effect of FeSO4·7H2O concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

由圖5可知，不同添加量的FeSO4·7H2O，叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量均與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異。楊東成等[34]研究了3種金屬離子對(duì)紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)生色素的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度Fe2+能提高紅色素的產(chǎn)量。馮光志等[35]的研究表明，F(xiàn)e2+會(huì)促進(jìn)某些真菌的菌絲生長(zhǎng)，但其添加量超過(guò)279.3 mg/kg時(shí)反而抑制菌絲的生長(zhǎng)。所以，推測(cè)適當(dāng)添加量的Fe2+會(huì)促進(jìn)叢毛紅曲霉的菌絲生長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)MK合成。但本研究中不同添加量的FeSO4·7H2O，均未明顯提高叢毛紅曲霉的MK產(chǎn)量。因此，叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK時(shí)，可不添加FeSO4·7H2O。

2.1.6 MgSO4·7H2O對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響

MgSO4·7H2O添加量對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響見(jiàn)圖6。

圖6 MgSO4·7H2O添加量對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響Fig.6 Effect of MgSO4·7H2O concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

由圖6可知，不同添加量的MgSO4·7H2O，對(duì)提高叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量有顯著效果。當(dāng)MgSO4·7H2O添加量為1.50 mg/g時(shí)，MK產(chǎn)量達(dá)到最大（212.03 mg/kg），與對(duì)照組的差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），比對(duì)照組的MK產(chǎn)量提高了46.5%；當(dāng)MgSO4·7H2O添加量為0～1.50 mg/g時(shí)，叢毛紅曲霉的MK產(chǎn)量隨MgSO4·7H2O添加量的增加而增加。分析其原因，可能是Mg2+為真菌生長(zhǎng)所需的微量元素[36]。Mg2+還能夠促進(jìn)土曲霉洛伐他汀合成前體物質(zhì)的積累和菌體發(fā)育，從而提高洛伐他汀產(chǎn)量[37]。當(dāng)MgSO4·7H2O添加量大于1.50 mg/g時(shí)，叢毛紅曲霉MK產(chǎn)量的提高效果隨MgSO4·7H2O添加量的增加而下降。分析其原因，可能是叢毛紅曲霉生物量的快速積累，導(dǎo)致培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過(guò)快，進(jìn)而造成MK產(chǎn)量的下降[38]。因此，叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK時(shí)，MgSO4·7H2O的最適添加量為1.50 mg/g。

2.1.7 ZnSO4·7H2O對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響

ZnSO4·7H2O添加量對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響見(jiàn)圖7。

圖7 ZnSO4·7H2O添加量對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響Fig.7 Effect of ZnSO4·7H2O concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

由圖7可知，不同添加量的ZnSO4·7H2O，對(duì)提高叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量有顯著效果。當(dāng)ZnSO4·7H2O添加量為2.50 mg/g時(shí)，MK產(chǎn)量達(dá)到最大（237.86 mg/kg），與對(duì)照組的差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），比對(duì)照組的MK產(chǎn)量提高了136.2%；隨著ZnSO4·7H2O添加量的增加，叢毛紅曲霉的MK產(chǎn)量也逐漸增加。分析其原因，可能是Zn2+能夠提高叢毛紅曲霉的色素產(chǎn)量[39]，而色素與MK同為聚酮化合物，因此添加Zn2+對(duì)叢毛紅曲霉的MK合成也有一定的促進(jìn)作用，從而提高M(jìn)K產(chǎn)量。當(dāng)ZnSO4·7H2O的添加量大于2.50 mg/g時(shí)，叢毛紅曲霉產(chǎn)MK的增長(zhǎng)速率隨著ZnSO4·7H2O添加量的增加而下降，可能是較高添加量的ZnSO4·7H2O促進(jìn)叢毛紅曲霉生物量的快速積累，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過(guò)快消耗，從而影響其代謝產(chǎn)物的合成。因此，叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK時(shí)，ZnSO4·7H2O的最適添加量為2.50 mg/g。

2.1.8 MnSO4·H2O對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響

MnSO4·H2O添加量對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響見(jiàn)圖8。

圖8 MnSO4·H2O添加量對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響Fig.8 Effect of MnSO4·H2O concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

由圖8可知，不同添加量的MnSO4·H2O，對(duì)提高叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量有顯著效果。當(dāng)MnSO4·H2O添加量為1.50 mg/g時(shí)，MK產(chǎn)量達(dá)到最大（219.29 mg/kg），與對(duì)照組的差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），比對(duì)照組的MK產(chǎn)量提高了107.6%；當(dāng)MnSO4·H2O的添加量為0～1.50mg/g時(shí)，隨著MnSO4·H2O添加量的升高，叢毛紅曲霉的MK產(chǎn)量也逐漸增加。這與Lin等[38]的研究結(jié)果一致，推測(cè)Mn2+可以通過(guò)促進(jìn)MK生物合成途徑中莫納可林J和2-甲基丁酸前體的積累來(lái)促進(jìn)MK的生成。因此，叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的MnSO4·H2O最佳添加量為1.50 mg/g。

2.1.9 Na2MoO4·2H2O對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響

Na2MoO4·2H2O添加量對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響見(jiàn)圖9。

圖9 Na2MoO4·2H2O添加量對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響Fig.9 Effect of Na2MoO4·2H2O concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

由圖9可知，不同添加量的Na2MoO4·2H2O，對(duì)提高叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量有顯著效果。當(dāng)Na2MoO4·2H2O的添加量為1.00 mg/g時(shí)，MK產(chǎn)量達(dá)到最大（326.91 mg/kg），與對(duì)照組的差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），比對(duì)照組的MK產(chǎn)量提高了133.3%；當(dāng)Na2MoO4·2H2O添加量小于1.00 mg/g時(shí)，隨著Na2MoO4·2H2O添加量的增加，叢毛紅曲霉的MK產(chǎn)量也逐漸增加。分析其原因，可能是Mo6+具有與Zn2+相似的功能，能夠促進(jìn)聚酮化合物合成反應(yīng)的進(jìn)行，進(jìn)而提高紅曲霉的MK產(chǎn)量[39]，此外，添加Na2MoO4·2H2O能夠減少叢毛紅曲霉在發(fā)酵過(guò)程出現(xiàn)的結(jié)塊現(xiàn)象，也有助于叢毛紅曲霉MK產(chǎn)量的提高。因此，叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK時(shí)，Na2MoO4·2H2O的最適添加量為1.00 mg/g。

2.1.10 CaCl2對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響

CaCl2添加量對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響見(jiàn)圖10。

圖10 CaCl2添加量對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響Fig.10 Effect of CaCl2concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

由圖10可知，添加1.50 mg/g的CaCl2，能顯著提高叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量，比對(duì)照組的MK產(chǎn)量提高了53.1%；當(dāng)CaCl2添加量小于1.50 mg/g時(shí)，隨著CaCl2添加量的升高，叢毛紅曲霉的MK產(chǎn)量也逐漸增加；當(dāng)添加量高于1.50 mg/g時(shí)，MK產(chǎn)量隨著CaCl2添加量的增大而減小，且與對(duì)照組的MK產(chǎn)量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。分析原因可能是較高的CaCl2添加量不利于叢毛紅曲霉的生長(zhǎng)，進(jìn)而導(dǎo)致其MK產(chǎn)量下降[28]。因此，叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK時(shí)，CaCl2的最適添加量為1.50 mg/g。

2.1.11 CoCl2·6H2O對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響

CoCl2·6H2O添加量對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)產(chǎn)MK的影響見(jiàn)圖11。

圖11 CoCl2·6H2O添加量對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)產(chǎn)MK的影響Fig.11 Effect of CoCl2·6H2O concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

由圖11可知，CoCl2·6H2O添加量為0.05 mg/g時(shí)，可顯著提高叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量，MK產(chǎn)量可達(dá)152.41 mg/kg，比對(duì)照組的MK產(chǎn)量提高了39.3%；當(dāng)CoCl2·6H2O添加量大于0.05 mg/g時(shí)，MK產(chǎn)量隨CoCl2·6H2O添加量的增加而逐漸減少。分析其原因，適當(dāng)添加Co2+，對(duì)叢毛紅曲霉的發(fā)酵培養(yǎng)起到了促進(jìn)作用，會(huì)顯著促進(jìn)其菌絲生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物的合成[35]；但CoCl2·6H2O添加量過(guò)高時(shí)，反而抑制叢毛紅曲霉的菌絲生長(zhǎng)。因此，叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK時(shí)，CoCl2·6H2O添加量不宜超過(guò)0.05 mg/g。

2.2 固態(tài)發(fā)酵外源誘導(dǎo)物最優(yōu)組合的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

以ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O和Na2MoO4·2H2O 3種誘導(dǎo)物為試驗(yàn)因素，基于Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以MK產(chǎn)量為響應(yīng)值，進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸方程擬合及分析，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 外源誘導(dǎo)物最優(yōu)組合的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果Table 2 The results of response surface optimization for the optimal combination of inducers

對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸，得出二次多元回歸方程：Y=560.13-27.5A-22.22B+2.44C-36.96AB-20.29AC+30.87BC+28.92A2-95.43B2-23.92C2。同時(shí)，對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 The variance analysis results of regression model of response surface

由表3可知，擬合方程的P＜0.000 1，表明響應(yīng)面的回歸模型達(dá)到了極顯著水平；失擬項(xiàng)P=0.244 8＞0.05，失擬不顯著，表明方程的擬合程度較好。因此，上述回歸方程可以用于準(zhǔn)確分析和預(yù)測(cè)各因素與MK產(chǎn)量之間的關(guān)系?；貧w模型的確定系數(shù)R2=0.980 4，說(shuō)明該模型能解釋98.04%響應(yīng)值的變化。因此，該模型擬合程度較好，能很好地反映響應(yīng)值的變化，可以利用此模型對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

此外，由回歸模型的方差分析結(jié)果（表3）可知，方程一次項(xiàng)中的A項(xiàng)、B項(xiàng)，交互項(xiàng)AB、BC項(xiàng)和二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)叢毛紅曲霉MK產(chǎn)量的影響達(dá)到極顯著水平；交互項(xiàng)AC對(duì)叢毛紅曲霉MK產(chǎn)量的影響達(dá)到顯著水平。F值的大小能夠反映出各因素對(duì)MK產(chǎn)量的影響程度，根據(jù)F值可知，3種外源誘導(dǎo)物對(duì)叢毛紅曲霉MK產(chǎn)量的影響的大小順序?yàn)锳（MnSO4·H2O）>B（Na2MoO4·2H2O）>C（ZnSO4·7H2O）。

根據(jù)回歸擬合方程，做每2個(gè)因素對(duì)MK產(chǎn)量影響程度的響應(yīng)面三維圖，并對(duì)3組對(duì)比因素（AB、AC與BC）進(jìn)行響應(yīng)面模擬分析，結(jié)果見(jiàn)圖12。

圖12 各因素交互作用對(duì)MK產(chǎn)量的影響Fig.12 Interactive effects of variables on MK yield

如圖12所示，BC圖形的曲面向上凸起，表明了在兩因素的影響下，存在最大值。AB與AC的兩兩因素之間交互作用的顯著性較弱，而B(niǎo)C的兩兩因素間交互作用的顯著性較強(qiáng)。

2.2.2 外源誘導(dǎo)物最優(yōu)組合的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

通過(guò)回歸模型的預(yù)測(cè)，當(dāng)MnSO4·H2O添加量為1.20 mg/g、Na2MoO4·2H2O 添加量為 1.00 mg/g、ZnSO4·7H2O添加量為2.80 mg/g，在此條件下，叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的MK產(chǎn)量預(yù)測(cè)值為622.25 mg/kg。為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的可靠性，根據(jù)預(yù)測(cè)的3種外源誘導(dǎo)物最佳添加量組合，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，其MK產(chǎn)量平均為631.10 mg/kg，與預(yù)測(cè)的MK產(chǎn)量無(wú)顯著差異，說(shuō)明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的外源誘導(dǎo)物最優(yōu)組合的參數(shù)可靠。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)研究了11種外源誘導(dǎo)物對(duì)叢毛紅曲霉固態(tài)發(fā)酵MK產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，在適當(dāng)?shù)奶砑恿肯拢?1種外源誘導(dǎo)物對(duì)叢毛紅曲霉的MK產(chǎn)量都有一定的提高效果，其中，ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O 和Na2MoO4·2H2O 3種誘導(dǎo)物對(duì)MK產(chǎn)量的提高效果最顯著，分別比對(duì)照組提高了1.4倍、1.1倍、1.3倍。響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果表明，外源誘導(dǎo)物的最優(yōu)組合為1.20 mg/g MnSO4·H2O、1.00 mg/g Na2MoO4·2H2O 和 2.80 mg/g ZnSO4·7H2O，其 MK 產(chǎn)量可達(dá) 631.10 mg/kg，與回歸方程預(yù)測(cè)的MK產(chǎn)量無(wú)顯著差異。