呂文，張正陽(yáng)，李萍，杜欣軍*，王碩

（1.食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.天津市食品科學(xué)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 300071）

阪崎克羅諾桿菌是一種兼性厭氧革蘭氏陰性細(xì)菌，不產(chǎn)生孢子，但具有形成生物膜的能力，可以在人類和動(dòng)物的腸道中存活[1]。該菌是一種食源性病原體，通常檢出于嬰兒配方奶粉中。該致病菌可以引起嬰幼兒菌血癥、腦膜炎和壞死性小腸結(jié)腸炎等，死亡率較高[2]。此外，該細(xì)菌還會(huì)感染免疫功能減弱的老年人和成年人，并導(dǎo)致肺炎、結(jié)膜炎、傷口感染和尿路感染等[3-4]。這種細(xì)菌對(duì)各類極端外部環(huán)境表現(xiàn)出不同的抵抗力，例如耐酸性[5]、耐藥性[6]和耐壓力性[7]。與其他細(xì)菌相比，耐干燥性是阪崎克羅諾桿菌最突出的環(huán)境抵抗能力，這也是導(dǎo)致食品污染、引起嬰幼兒感染的重要原因[8-10]。因此，研究阪崎克羅諾桿菌的耐干燥機(jī)制具有重要意義，能夠?yàn)榉乐卧摬≡峁┲匾膮⒖肌?/p>

目前的研究表明，生物膜、海藻糖和細(xì)胞中的相容物質(zhì)有利于阪崎克羅諾桿菌對(duì)抗周圍環(huán)境中的不利因素。生物膜不僅有助于細(xì)菌附著在一些物體的表面，還能增強(qiáng)微生物在各種環(huán)境中的抵抗力[11]。生物膜的產(chǎn)生可以增強(qiáng)細(xì)菌在低水活度環(huán)境中的生存能力，同時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境壓力的抵抗能力[12]。在低水分條件下，阪崎克羅諾桿菌可以產(chǎn)生大量的海藻糖。海藻糖可穩(wěn)定磷脂膜和蛋白質(zhì)之間的結(jié)構(gòu)，以抵抗有害的外部干燥環(huán)境[13]。此外，細(xì)胞中相容物質(zhì)的攝取和合成，如脯氨酸、甜菜堿、甘氨酸、膽堿也可以在滲透調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，從而保護(hù)菌株細(xì)胞免受干燥環(huán)境造成的損害[14]。雖然目前對(duì)于阪崎克羅諾桿菌耐干燥機(jī)制已經(jīng)開展了一些研究，但并未發(fā)現(xiàn)屬于該菌的獨(dú)特機(jī)制，因此，很難解釋阪崎克羅諾桿菌突出的干燥抵抗能力。需要進(jìn)一步研究該致病菌突出耐干燥能力的潛在機(jī)制。

前期對(duì)一株耐干燥能力較強(qiáng)的阪崎克羅諾桿菌進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，從蛋白表達(dá)水平分析了菌株在干燥刺激前后蛋白表達(dá)的差異[15]。其中，ESA-00281基因編碼的假設(shè)蛋白表現(xiàn)出明顯的表達(dá)差異。對(duì)比分析顯示，它與鼠傷寒沙門氏菌中對(duì)應(yīng)的同系物STM3155相似度為51.88%，STM3155由于在半固體培養(yǎng)基中表達(dá)情況類似于其他的運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因，因此，被描述為運(yùn)動(dòng)基因[16]。Hartmann等[11]通過(guò)轉(zhuǎn)座子突變構(gòu)建阪崎克羅諾桿菌ESA-00281突變體發(fā)現(xiàn)，該基因?qū)ι锬そY(jié)構(gòu)有強(qiáng)烈影響，且有助于與Caco-2腸上皮細(xì)胞的黏附。但該基因?qū)嫫榭肆_諾桿菌脫水耐受性的影響及其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

本研究構(gòu)建阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894的ESA-00281基因敲除菌株和回補(bǔ)菌株，基于對(duì)野生株、突變株及回補(bǔ)株的耐干燥能力、表面疏水性、膜透過(guò)性以及運(yùn)動(dòng)性、生物膜形成能力進(jìn)行比較分析，探究ESA-00281基因在阪崎克羅諾桿菌耐干燥過(guò)程中的可能作用機(jī)制，可為阪崎克羅諾桿菌的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阪崎克羅諾桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC BAA-894：美國(guó)菌種保藏中心。S17lambda pir菌株、DH5α菌株、pCVD442質(zhì)粒等為食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

限制性內(nèi)切酶BamHI、SalI：美國(guó)NEB公司；DNA提取試劑盒：天根生化科技有限公司；肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（lauria broth，LB）：美國(guó)BD公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)液：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒：美國(guó)OMEGA公司；無(wú)縫克隆和組裝試劑盒：中國(guó)諾唯贊生物科技有限公司；甲醛（分析純）：上海生工生物有限公司；結(jié)晶紫、1-N-苯基萘胺（分析純）、二甲苯（分析純）：天津泰進(jìn)科技有限公司。

1.2 主要儀器

DYY-6C型電泳儀、WD-9405B型水平搖床：北京市六一儀器廠；德國(guó)Eppendorf公司；UV-Vis紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；HCJ-4C型磁力攪拌水浴鍋：蘇州東鵬儀器制造有限公司；5424C-150339型臺(tái)式離心機(jī)：艾本德中國(guó)有限公司；LBI-250型生化培養(yǎng)箱：上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；OHG-914385型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；Sunrise Basic酶標(biāo)儀：奧地利Tecan公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

參考美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894基因序列設(shè)計(jì)引物（Genbank序列號(hào)：NC_009778.1），引物序列見表1，引物位置見圖1。

圖1 引物位置示意圖Fig.1 Locations of primers

表1 試驗(yàn)引物Table 1 Primers for test

1.3.2 ESA-00281基因缺失突變體的構(gòu)建

在阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894中，使用pCVD442自殺載體介導(dǎo)的同源重組實(shí)現(xiàn)ESA-00281基因的敲除[17]。使用引物pCVD442F和pCVD442R（表1）對(duì)pCVD442進(jìn)行線性化。使用兩對(duì)引物ESA-00281UF/ESA-00281UR和ESA-00281DF/ESA-00281 DR（表1）從阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894的DNA中擴(kuò)增ESA-00281的上下同源臂。使用商用無(wú)縫克隆和組裝試劑盒將上游和下游片段克隆到pCVD442自殺載體中，生成目標(biāo)載體pCVD442-Q-H。將目標(biāo)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌S17 lambda pir，然后通過(guò)電轉(zhuǎn)化構(gòu)建缺失突變體ΔESA-00281。

1.3.3 回補(bǔ)菌株的構(gòu)建

使用含有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的cpESA-00281F/cpESA-00281R引物（表1）從阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894的基因組DNA中擴(kuò)增ESA-00281基因。將產(chǎn)物克隆到pACYC184，轉(zhuǎn)移到突變體中獲得回補(bǔ)菌株cpESA-00281。對(duì)重組質(zhì)粒和回補(bǔ)菌株中ESA-00281編碼區(qū)的核苷酸序列進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.3.4 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

取活化后的菌液按照1∶100（體積比）接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 h。從轉(zhuǎn)接開始，每隔1 h取樣，測(cè)定OD600。用LB液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。測(cè)定菌液OD600直至平臺(tái)期，最后繪制出生長(zhǎng)曲線。比較阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894野生型菌株、ΔESA-00281突變株和回補(bǔ)株生長(zhǎng)曲線的差異。每個(gè)樣本作3個(gè)平行。

1.3.5 耐干燥性評(píng)估

將菌株活化，以1∶100（體積比）將10μL培養(yǎng)12h～14 h的菌液接種于1 mL LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期（OD600值為0.6～0.8），平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h～14 h后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，得到干燥前的菌落總數(shù)。將對(duì)數(shù)期的菌液加入96孔板并置于滅菌的干燥器中（內(nèi)有500 g脫水硅膠），封口膜密封，每個(gè)干燥器內(nèi)放置1個(gè)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于溫度為37℃、濕度為45%的恒溫培養(yǎng)箱恒溫恒濕培養(yǎng)6 d后取出96孔板，在每個(gè)孔中加入200 μL/孔的磷酸鹽緩沖溶液，梯度稀釋后平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h～14 h后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，得到干燥后的菌落總數(shù)。以上步驟重復(fù)3次，計(jì)算死亡率。死亡率越高，耐干燥能力越弱。

1.3.6 表面疏水性評(píng)估

將菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床中振蕩培養(yǎng)（37℃、200 r/min）12 h～14 h。5 000 r/min離心5 min后收集菌體，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗3次后，將OD600調(diào)至0.5，將2 mL細(xì)菌懸浮液與400 μL二甲苯混合液在室溫（25±1）℃下培養(yǎng)2 h，取出水相物質(zhì)測(cè)定OD600值，記為H。細(xì)菌表面疏水性指數(shù)（H/%）計(jì)算公式為H/%=（0.5-H）/0.5 ×100[18]。

1.3.7 生物膜形成能力評(píng)估

將菌株接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到107CFU/mL，各取100 μL菌液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，以無(wú)菌的LB培養(yǎng)基為空白對(duì)照，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48 h。48 h后取出96孔板，將懸浮的菌液吸出，待平板完全干透后于孔中加入200 μL 99%甲醇將生物膜固定15 min，吸出上清液，將平板晾干。隨后，向孔中加入200 μL 0.1%結(jié)晶紫（crystal violet，CV）溶液。30 min后取出多余的 CV，用生理鹽水清洗3次，將結(jié)晶紫溶液洗凈。最后，加入200 μL 95%乙醇釋放結(jié)合的CV。使用Sunrise Basic酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)量吸光度。

1.3.8 運(yùn)動(dòng)能力評(píng)估

運(yùn)動(dòng)性分析參考文獻(xiàn)[19]稍加修改。將菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床中振蕩培養(yǎng)（37℃、200 r/min）12 h～14 h。吸取 5 μL 菌液滴于軟瓊脂平板（含0.3%瓊脂的LB瓊脂培養(yǎng)基）中央，待無(wú)菌風(fēng)吹干后封口膜密封于30℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12 h～14 h，觀察菌落大小。

1.3.9 膜透過(guò)性評(píng)估

將菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)（37℃、200 r/min）12 h～14 h。12 000 r/min離心 1 min獲得菌體沉淀，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次后，利用磷酸緩沖鹽溶液將菌體復(fù)溶至OD600值為0.5。取1.92 mL細(xì)胞懸液和80 μL熒光探針1-N-苯基萘胺混合，設(shè)置熒光分光光度計(jì)的寬度、激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別設(shè)置為5、350 nm和420 nm，在此條件下監(jiān)測(cè)混合物的熒光強(qiáng)度[20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Origin8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每個(gè)試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，以確保重復(fù)性。所有結(jié)果均采用鄧肯多區(qū)間檢驗(yàn)和方差分析（ANOVA）進(jìn)行分析，以分析組間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 ESA-00281缺失突變體和回補(bǔ)菌株的構(gòu)建與驗(yàn)證

構(gòu)建ESA-00281基因敲除突變體ΔESA-00281及相應(yīng)的回補(bǔ)菌株cpESA-00281。突變株和回補(bǔ)株的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）驗(yàn)證結(jié)果見圖2。

圖2 突變株和回補(bǔ)株的PCR驗(yàn)證Fig.2 PCR validation of the mutant and complementary strains

利用ESA-00281F/R和YZESA-00281F/R引物對(duì)突變株進(jìn)行驗(yàn)證，利用ESA-00281F/R對(duì)回補(bǔ)株進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，ESA-00281F/R引物對(duì)在野生株、突變株和回補(bǔ)株中擴(kuò)增片段大小為367 bp、無(wú)擴(kuò)增、367 bp，YZESA-00281F/R引物對(duì)在野生株和突變株中擴(kuò)增片段大小分別為979、577 bp，證明敲除株和回補(bǔ)株均構(gòu)建成功。

2.2 ESA-00281在阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894中的作用分析

2.2.1 阪崎克羅諾桿菌野生株、突變株及回補(bǔ)株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

Research on coupled heating system of air source heat pump and gas boiler

用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見圖3。

圖3 阪崎克羅諾桿菌野生株、突變株及回補(bǔ)株的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curves of wild，mutant and complementary strains of C.sakazakii

由圖3可知，與野生株相比，ΔESA-00281突變體及cpESA-00281回補(bǔ)株表現(xiàn)出類似的生長(zhǎng)速度，回補(bǔ)株相對(duì)于其他兩株菌先進(jìn)入對(duì)數(shù)期，但三者均符合細(xì)菌正常生長(zhǎng)的規(guī)律，OD600均于10 h左右開始保持穩(wěn)定。結(jié)果表明，生長(zhǎng)性能并不受基因缺失的影響，排除了不同生長(zhǎng)規(guī)律對(duì)后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果的影響。

2.2.2 阪崎克羅諾桿菌野生株、ΔESA-00281突變株及回補(bǔ)株耐干燥性評(píng)估

對(duì)阪崎克羅諾桿菌野生株、突變株及回補(bǔ)株6 d干燥脅迫下的死亡率進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖4。

圖4 阪崎克羅諾桿菌野生株、突變株及回補(bǔ)株的干燥死亡率Fig.4 Desiccation-induced mortality rates of wild，mutant and complementary strains of C.sakazakii

由圖4可知，野生株、突變株、回補(bǔ)株的干燥死亡率分別為56.02%、64.78%、57.84%。干燥刺激后，相對(duì)于野生株 WT，ΔESA-00281突變株的死亡率有所升高，回補(bǔ)株的死亡率則與野生株大致相同，表明ESA-00281基因的缺失降低了阪崎克羅諾桿菌的干燥耐受能力，ESA-00281在阪崎克羅諾桿菌抵御干燥環(huán)境過(guò)程中起到正向作用。

2.2.3 表面疏水性分析

對(duì)野生株、ΔESA-00281突變株及其回補(bǔ)株的表面疏水性進(jìn)行了比較分析，結(jié)果見圖5。

圖5 阪崎克羅諾桿菌野生株、突變株及回補(bǔ)株細(xì)胞表面疏水性Fig.5 Cell surface hydrophobicity of wild，mutant and complementary strains of C.sakazakii

2.2.4 生物膜形成能力分析

采用結(jié)晶紫染色研究ESA-00281基因?qū)嫫榭肆_諾桿菌ATCC BAA-894生物膜形成的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 阪崎克羅諾桿菌野生株、突變株及回補(bǔ)株的生物膜形成能力比較Fig.6 Biofilm formation capacity of wild，mutant and complementary strains of C.sakazakii

由圖6可知，與野生型相比，ΔESA-00281突變株的生物膜量明顯減少，回補(bǔ)株的生物膜形成能力與野生株相似。結(jié)果表明，ESA-00281基因在生物膜形成方面發(fā)揮正向作用。

2.2.5 運(yùn)動(dòng)能力分析

阪崎克羅諾桿菌在半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)可以形成明顯的運(yùn)動(dòng)環(huán)。野生株（WT）、ΔESA-00281突變株和cpESA-00281回補(bǔ)株的菌株運(yùn)動(dòng)性結(jié)果見圖7。

圖7 阪崎克羅諾桿菌野生株、突變株及回補(bǔ)株的運(yùn)動(dòng)性鑒定Fig.7 Mobility identification of wild，mutant and complementary strains of C.sakazakii

由圖7可知，與野生株相比，ΔESA-00281突變株的運(yùn)動(dòng)環(huán)直徑無(wú)明顯變化，表明ESA-00281對(duì)阪崎克羅諾桿菌的運(yùn)動(dòng)性無(wú)關(guān)。

2.2.6 膜透過(guò)性測(cè)定結(jié)果

對(duì)阪崎克羅諾桿菌野生株、ΔESA-00281突變株及回補(bǔ)株細(xì)胞的外膜通透性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖8。

圖8 阪崎克羅諾桿菌野生株、突變株及回補(bǔ)株細(xì)胞膜通透性測(cè)定Fig.8 Membrane permeability of wild，mutant and complementary strains of C.sakazakii

由圖8可知，與野生株相比，ΔESA-00281突變株的膜通透性無(wú)明顯變化，說(shuō)明ESA-00281基因的缺失并不會(huì)影響其外膜通透性。

3 討論與結(jié)論

以上試驗(yàn)說(shuō)明，ESA-00281基因?qū)w生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)性以及細(xì)胞膜通透性無(wú)明顯影響，可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞表面疏水性及生物膜的形成能力等機(jī)制以抵抗外界環(huán)境的壓力并確保生命活動(dòng)的正常進(jìn)行，從而應(yīng)對(duì)干燥脅迫，調(diào)節(jié)菌株的耐干燥性能。在面對(duì)外界復(fù)雜的生存環(huán)境時(shí)，最先感知到外界變化并作出響應(yīng)的往往是細(xì)菌細(xì)胞的表面，細(xì)菌細(xì)胞的表面具有許多生物活性物質(zhì)，它們體現(xiàn)了細(xì)菌生命活動(dòng)的情況，其變化會(huì)影響細(xì)胞的表面疏水性。在液體環(huán)境中，細(xì)胞表面的疏水作用使細(xì)胞表面具有一定的黏附能力[21]，從而增強(qiáng)其生存能力。文獻(xiàn)[11]表明，該基因?qū)aco-2細(xì)胞的黏附有一定的影響。因此，ESA-00281基因缺失導(dǎo)致的表面疏水性降低可能是該突變株耐干燥能力下降的原因之一。細(xì)菌細(xì)胞形成菌膜能有效提高對(duì)外界環(huán)境的耐受性[22]。一般認(rèn)為，細(xì)菌可以通過(guò)形成生物膜以增加對(duì)干燥環(huán)境的抵抗力[23]。很多報(bào)道已經(jīng)顯示，菌膜形成對(duì)沙門氏菌[24]、單核細(xì)胞增生李斯特菌[25]和大腸桿菌抵抗干燥環(huán)境具有重要作用[26]。本結(jié)果表明，ESA-00281可能通過(guò)促進(jìn)生物膜的形成進(jìn)而增強(qiáng)耐干燥能力。

本文利用基因敲除技術(shù)構(gòu)建了ΔESA-00281突變株，并以此研究阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894中該基因的功能。對(duì)阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894野生株及ΔESA-00281突變株的耐干燥性比較結(jié)果顯示，ESA-00281基因缺失后菌株在干燥脅迫下的死亡率有所升高，表明該基因在阪崎克羅諾桿菌耐干燥中發(fā)揮正向作用。此外，對(duì)阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894野生株及ΔESA-00281突變株的生理活性進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示，ESA-00281對(duì)于阪崎克羅諾桿菌的生物膜形成及表面疏水性發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用，表明該基因可能通過(guò)改變表面疏水性來(lái)調(diào)節(jié)生物膜的形成和對(duì)介質(zhì)的黏附，從而正向調(diào)節(jié)菌株的耐干燥能力。